張 雷，趙曉錕，楊江峰，張 瑩，王 凈

(河北北方學(xué)院 動物科技學(xué)院，河北 張家口 075131)

羊性別控制技術(shù)是通過人為干預(yù)方法使成年雌性動物按性別需求生產(chǎn)后代的一項(xiàng)技術(shù)[1]。性別控制能充分發(fā)揮公、母畜的繁殖性能，消除有害基因，提高遺傳選擇強(qiáng)度，保護(hù)珍稀瀕危生態(tài)資源，優(yōu)化商品動物，獲得優(yōu)質(zhì)的毛、皮、絨、肉、乳等畜產(chǎn)品，使經(jīng)濟(jì)效益最大化[2]。羊性別控制的途徑主要有3種：(1)X和Y精子的頭部、DNA含量、精子膜電荷量的分布位置、含有的抗原以及對抗原的反應(yīng)能力等方面存在差異[3]，通過這些特點(diǎn),在受精前干預(yù)精子可控制動物性別；(2)利用細(xì)胞遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法等對受精后的早期胚胎進(jìn)行性別鑒定；(3)調(diào)控受精前母畜生殖器官的內(nèi)環(huán)境，達(dá)到有效精子和卵子結(jié)合的目的[4]。

1 X、Y精子分離

1.1 沉降法

Y精子的體積比X精子的體積小,沉積速率慢。張岳周報道將新鮮精液稀釋、沉淀2 h后，取2 mL頂層精液、6 mL底層精液經(jīng)洗液、稀釋處理后，制成顆粒冷凍精液，解凍后輸精發(fā)現(xiàn)，頂層精液的后代公羔占比為36.4%，母羔占比為63.3%；底層精液的后代公羔占比為75%，母羔占比為25%[5]。張岳周再驗(yàn)證這一試驗(yàn)，將鮮奶稀釋2倍后的羊精液裝于試管中，在廣口保溫瓶內(nèi)低溫自然沉淀2 h后從頂層和底層分別取0.1 mL精液進(jìn)行授精，結(jié)果輸入頂層精液的后代公羔占比為70.5%，底層精液的后代母羔占比為70.9%[5]，與上次結(jié)果不同。張淑娟報道X精子與Y精子的比重差異并不大，只存在0.007 g·cm-3的密度差異[6]，因此對操作要求非常嚴(yán)格，并且由于精子不同的成熟時期比重也不同，所以沉降法的效果存在誤差，不是很準(zhǔn)確。

1.2 電泳法

精子表面帶電荷量X精子頭部較高，Y精子尾部較高，在電場中向不同電極移動[7]。用此方法分離牛精子后人工授精，向陽極移動的精子后代雌性占71.3%，向陰極移動的精子后代雄性占63.9%[5]。在pH為7.4條件下用此方法處理人精液，結(jié)果80%的Y精子靠近負(fù)極[6]。

1.3 梯度離心法

李平等[8]報道用此法首次對兔的精子分離，受精后發(fā)現(xiàn)后代性別無顯著改變。張岳周報道根據(jù)精子的比重關(guān)系分離精子，把稀釋后的羊精液離心5 min，取上清液對29只母羊人工授精，后代公羔率為78.13%；取下液輸精對24只母羊人工授精，后代母羔率為76%[5]。且離心過程會對精子造成一系列損害，如畸形、活力下降。

1.4 免疫學(xué)分離法

Y精子具有H-Y抗原特性，利用H-Y抗血清免疫反應(yīng)區(qū)分X和Y精子，雌仔兔比例達(dá)到78.9%[9]。此法操作方便、成本低，但需要長時間處理精子，從而降低了精子的活力[4]。

1.5 流動細(xì)胞光度測定法

不同哺乳動物X精子與Y精子的DNA含量不同，X精子比Y精子的DNA含量高，人、兔、豬、牛、犬、馬、羊X精子DNA含量分別比Y精子多2.8%、3.0%、3.6%、3.8%、3.9%、4.1%、4.2%[9-10]。DNA含量差別較大的動物精液分離難度較小，當(dāng)DNA含量差別小于3%時，分離難度很大[11-12]。激光激發(fā)時，由于X精子DNA含量較高放射出較強(qiáng)的信號，通過儀器和計算機(jī)系統(tǒng)擴(kuò)增可區(qū)分X精子和Y精子。這一技術(shù)被廣泛應(yīng)用于家兔、豬、綿羊和牛的精子分離，并產(chǎn)生了相應(yīng)的性別控制后代。經(jīng)過分離的精子頂體完整性得到改善，穿透宮頸粘液的能力降低，受精卵的壽命縮短，導(dǎo)致牛后代的生長能力比未進(jìn)行分離的差，但這種情況在羊的精子分離上沒有體現(xiàn)，有待進(jìn)一步研究其原因[13-14]。此方法分離后的X、Y精子冷凍保存，解凍后進(jìn)行人工受精也能夠產(chǎn)生預(yù)期性別的羔羊[15-16]。近年來流式細(xì)胞儀不斷改良，分離精液的準(zhǔn)確度和分離速度大大提高，但分離過程會損傷精子，儀器價格比較昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室難以配置[17]。

2 早期胚胎性別鑒定

2.1 細(xì)胞學(xué)方法

通過分析部分胚胎細(xì)胞的染色體組成可判斷胚胎性別，雌性為XX染色體，雄性為XY染色體，雌性胚胎中的一條X染色體在早期發(fā)育過程中處于暫時失活狀態(tài)[18]。取胚胎滋養(yǎng)層中細(xì)胞，用秋水仙素處理并染色，檢查中期染色體的譜帶差異，根據(jù)X染色體和Y染色體的大小及形態(tài)鑒定性別[19]。李平等[8]報道14-15日齡的牛胚胎中有58.5%可以鑒定，后代的性別與鑒定結(jié)果一致。在生產(chǎn)實(shí)踐中采集細(xì)胞的過程容易損傷胚胎，獲得高質(zhì)量的中期染色體分裂相也很困難[20]。

2.2 免疫法

根據(jù)雄性胚胎上存在特異性H-Y抗原，用H-Y抗血清或H-Y單克隆抗體檢測，從而鑒定胚胎的性別。

2.2.1 細(xì)胞毒性分析法 在胚胎培養(yǎng)過程中，加入H-Y抗血清與補(bǔ)體(豚鼠血清)，將發(fā)育良好的胚胎定為H-Y-(雌性)，而出現(xiàn)卵裂球溶解或者發(fā)育不完全的定為H-Y+(雄性)[21]。

2.2.2 間接免疫熒光法 使用單抗或H-Y抗血清與8細(xì)胞至囊胚期胚胎共同孵育培養(yǎng)30 min，再用標(biāo)記有異硫氰酸熒光素(FITC)的二抗進(jìn)行處理，通過熒光顯微鏡觀察，雄性胚胎被熒光標(biāo)記，不顯示熒光的為雌性胚胎，經(jīng)移植到母鼠后，根據(jù)所產(chǎn)的后代，雄胚符合率為78%，雌胚符合率為81%[21]。該方法對豬、綿羊和牛胚胎性別鑒定準(zhǔn)確率分別為81%、85%和89%[8]。

2.2.3 囊胚形成抑制法 利用H-Y抗體具有可逆性抑制桑椹胚向囊胚發(fā)育階段雄性胚胎的特點(diǎn)。研究者將大鼠桑葚時期的胚胎與H-Y抗體共孵育6 h，發(fā)育成囊胚的判定為雌性，不能發(fā)育成囊胚的判定為雄性。雄性胚胎被去除H-Y抗體，繼續(xù)培養(yǎng)后仍可發(fā)育成囊胚[21]。雌性胚胎和雄性胚胎被移植后，得到79%的雌鼠和91.3%的雄鼠。利用此法對奶牛的胚胎進(jìn)行性別鑒定，雌性胚胎的準(zhǔn)確率為81.82%，雄性胚胎的準(zhǔn)確率為80%[21]。

2.3 分子生物學(xué)法

根據(jù)Y染色體上存在SRY基因，用雄性特異性基因探針和PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行性別鑒定，Y染色體上檢測出SRY基因?yàn)樾坌?，否則判斷為雌性[22-23]。

2.3.1 DNA探針法 根據(jù)Y染色體基因序列設(shè)計并合成DNA探針，雜交標(biāo)記胚胎中的細(xì)胞，陽性者為雄性胚胎，陰性者為雌性胚胎。有學(xué)者針對牛的Y染色體合成DNA多條探針，標(biāo)記胚胎囊胚期細(xì)胞，經(jīng)鑒定，準(zhǔn)確率達(dá)到95%[4]。

2.3.2 PCR擴(kuò)增法 PCR法鑒定胚胎性別的實(shí)質(zhì)是對Y染色體上的性別決定基因SRY的鑒定。早期胚胎用切割法或吸取法進(jìn)行活組織取樣，設(shè)計SRY基因的特異性引物，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過是否能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，判斷胚胎的性別，若能則為雄性胚胎，若不能則為雌性胚胎[24]。黃淑楨等[25]鑒定試管羊胚胎性別，將124枚用PCR技術(shù)鑒定的胚胎移植給44只受體母羊，生產(chǎn)14只羔羊，其性別與胚胎鑒定的性別完全一致。但擴(kuò)增時間約2～3 h，時間較長。近年來隨著PCR擴(kuò)增技術(shù)持續(xù)改進(jìn)，非電泳的PCR縮短了鑒定所需時間，高效、快速、準(zhǔn)確等是PCR擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，但PCR技術(shù)存在最大的問題是容易污染，成為一種常規(guī)、有商業(yè)價值的胚胎性別鑒定方法還需進(jìn)一步研究[26]。

2.3.3 熒光原位雜交(FISH)法 包括熒光素探針的制備、探針和靶標(biāo)DNA的變性與雜交、觀察鑒定3部分，此方法可在細(xì)胞分裂間期和分裂中期雜交，具有廣泛的應(yīng)用性[27]。侯勝奎[22]報道用FISH法鑒定分離的精子，82%的Y精子輸精后，所產(chǎn)后代80%為雄性牛。在豬胚胎性別鑒定中，將Y染色體的探針與切割胚雜交，準(zhǔn)確率為91%，后期移植仔豬生產(chǎn)的符合率為100%[28]。此方法準(zhǔn)確度高，試劑無毒害，但是鑒定需要時間較長，對試劑要求較嚴(yán)格，鑒定成本高。

2.3.4 LAMP法 也叫環(huán)-酶恒溫擴(kuò)增法，為靶序列目標(biāo)基因上的6個區(qū)段設(shè)計4種引物及一種特殊的鏈置換型DNA聚合酶，在65 ℃恒溫條件下1 h左右，核酸的指數(shù)級擴(kuò)效率可達(dá)到109～1 010個拷貝數(shù)量級。2005年淮亞紅等用此方法對牛早期胚胎進(jìn)行性別鑒定，鑒定準(zhǔn)確率為100%，證明LAMP試劑盒具有準(zhǔn)確性、靈敏性、特異性[29]。該方法簡單快速、準(zhǔn)確靈敏，但容易受污染，需嚴(yán)格遵循操作規(guī)程[30-31]。

3 控制受精的環(huán)境

動物受精時的環(huán)境對于后代的性別決定有重要影響，如日糧營養(yǎng)、體液酸堿度、輸精時間等[32]。

3.1 飼養(yǎng)類型及營養(yǎng)水平

親代的營養(yǎng)與子代的性別有關(guān)。若母畜以采取谷物類飼料為主，則后代雌雄比例為家兔1∶1.7，犢牛1∶1.6；反之，以青綠飼料類飼料為主，后代則以雌性較多，家兔及犢牛雌雄比例均為1∶0.8[6]。在小鼠、兔和豬的臨床試驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)鎘元素與性別有關(guān)。將一定劑量的鎘摻入動物飼料中飼喂一段時間后，所生后代大多數(shù)是雌性。由于X精子的抵抗力較Y精子強(qiáng)，體內(nèi)鎘的積累使睪丸中的曲精小管上皮細(xì)胞出血壞死，Y精子的發(fā)育和活動能力減弱，X精子有更多受精機(jī)會多，故后代雌性多[33]。

3.2 體液酸堿度

X精子比Y精子耐酸，酸性環(huán)境不利于Y精子的運(yùn)動，Y精子到達(dá)子宮需要的時間長，與卵子結(jié)合機(jī)會變少，故產(chǎn)生的雌性較多；Y精子比X精子耐堿性強(qiáng)，Y精子在堿性環(huán)境中比X精子運(yùn)動快，與卵子結(jié)合的機(jī)會就會變高，故后代雄性較多。

3.2.1 精氨酸 精氨酸作為稀釋液稀釋精子使精液偏酸，適量的精氨酸能提高精液的品質(zhì)，但濃度較高的精氨酸對精子的生活環(huán)境會有破壞作用，精氨酸和X精子有良好的相互作用，能夠加強(qiáng)精子的存活，精氨酸的濃度為0.5%最好，有效提高了母羔率[34]。張麗等報道用生理鹽水將精氨酸稀釋成高、中、低3種濃度，分別為10%以上、5%、2.5%，輸精20～30 min后3種濃度各取1 mL注入牛陰道內(nèi)，注入高濃度和低濃度的后代產(chǎn)公犢較多，中等濃度的后代產(chǎn)母犢較多[18]。用精氨酸處理過的精液，雖然可以控制后代的雌雄比例，但出生的羔羊不如沒有進(jìn)行性別控制的羔羊體質(zhì)好。趙宗勝等在處理精液時添加半支維生素B12作為增強(qiáng)劑，起到了相對較好的效果[35]。

3.2.2 食醋液和碳酸氫鈉 張岳周報道，將40只母羊陰道用100 mL食醋液(20%)沖洗后，用稀釋2倍的羊精液輸精，產(chǎn)羔44只，其中31只母羔，母羔率達(dá)70.45%。27只母羊陰道用100 mL碳酸氫鈉(2.5%)沖洗，此時讓羊體呈前高后低站立10～15 min，沖洗液流盡后每只羊輸入0.2 mL精液，產(chǎn)羔29只，其中18只公羔，公羔率達(dá)62.07%[5]。

3.2.3 DATONG-01液 利用pH值為6.88的DATONG-01液，在人工輸精前20～30 min注射0.5 mL到子宮頸0.5～1 cm處，X精子在這種環(huán)境下活躍，Y精子受到抑制，后代雌性增多，顯著高于對照組(不作任何處理)[36]。而且操作簡單、成本低，便于在生產(chǎn)單位推廣應(yīng)用，對提高養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)畜牧業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展具有重大意義。

3.2.4 葡萄糖 葡萄糖在胚胎發(fā)育過程中有重要作用。經(jīng)卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)和體外受精(IVF)技術(shù)體外生產(chǎn)牛胚胎時，在培養(yǎng)液中添加葡萄糖，受精卵發(fā)育到囊胚期時檢測發(fā)現(xiàn)，雄性胚胎多且發(fā)育快于雌性[37]。李景云等人報道在人工輸精前30 min靜脈注射100 mL濃度為50%的葡萄糖，后代的母羔率達(dá)86.67%，比第一組(25%葡萄糖100 mL)和第二組(5%碳酸氫鈉100 mL)效果都好[38]。

3.3 輸精時間

施巧婷等報道，受精時卵子的成熟狀態(tài)對胚胎性別有很大的影響，在卵子徹底成熟時受精，雄性胚胎多于雌性胚胎，并闡明了性別比例與輸精時間相關(guān)，在排卵前5 h給綿羊輸精，后代多為母羔；在排卵后5 h輸精，后代多為公羔[28]。

綜上所述，X、Y精子分離和胚胎性別鑒定的方法存在重復(fù)性差、儀器昂貴、操作技術(shù)要求高、準(zhǔn)確率低、耗時長、對精子或者胚胎損傷大等問題。而采取動物排卵前或后5 h輸精，或者輸精前向動物子宮頸注入精氨酸、食醋液、DATONG-01液、葡萄糖等方法切實(shí)可行，這類通過改變外界環(huán)境控制后代性別的方法具有效果好、方便快捷、對動物損傷小的特點(diǎn)，可以在生產(chǎn)實(shí)踐中推廣應(yīng)用。