王瑞雪 劉佳森 李蘊(yùn)華 成立新 岳林芳 馬萬(wàn)山 趙艷紅

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 畜牧研究所，呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

lncRNA作為2012年度新興起的生命科學(xué)研究之一[1]，在生物眾多生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用，是繼mRNA和miRNA之后最熱門的分子生物學(xué)研究領(lǐng)域之一。lncRNA 是一類長(zhǎng)度均>200 nt且不具備或很少具有蛋白質(zhì)編碼能力的 RNA[2]，并缺乏明顯的開放閱讀框。最初有研究認(rèn)為 lncRNA 是基因組轉(zhuǎn)錄過程中形成的“噪音”，在生物體內(nèi)不發(fā)揮任何生物學(xué)功能[3]。但近期的研究表明，lncRNA可參與細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的 X 染色體失活、染色體結(jié)構(gòu)改變、基因印記、轉(zhuǎn)錄激活/沉默和核內(nèi)運(yùn)輸?shù)汝P(guān)鍵生命活動(dòng)[4]。Cesana等[5]通過研究人和小鼠的骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)，特異性表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼 RNA linc-MD1可以結(jié)合miR-133和miR-135來調(diào)控肌肉特異性基因MAML1和MEF2C的表達(dá)。Zhu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，lnc-mg 通過結(jié)合miR-125b調(diào)控骨骼肌發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子-IGF2的蛋白質(zhì)水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育。近年來，在畜禽領(lǐng)域逐漸開展了lncRNA的相關(guān)研究。Ren等[7]在豬的胎兒滋養(yǎng)層鑒定出一種新的lncRNA，發(fā)現(xiàn)其在豬胎兒骨骼肌中表達(dá)上調(diào)，并顯著影響豬胎兒骨骼肌的發(fā)育。Li等[8]通過RNA-seq技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法，在雞基因組中鑒定出281種與雞骨骼肌發(fā)育相關(guān)的新lncRNA。

綿羊肌肉發(fā)育相關(guān)的lncRNA研究正處于起步階段，劉瑞鑿等[9]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)烏珠穆沁羊和特克賽爾羊腓腸肌進(jìn)行l(wèi)ncRNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)lncRNA TCONS_00102859只在特克賽爾羊腓腸肌中表達(dá)，并且隨著發(fā)育其表達(dá)量逐漸增高。進(jìn)一步研究顯示，TCONS_00102859的過表達(dá)會(huì)引起肌肉分化相關(guān)基因MyoD和MyoG表達(dá)上調(diào)，MSTN表達(dá)下調(diào)，證明TCONS_00102859可能在成肌細(xì)胞的增殖分化中發(fā)揮作用。吳明明[10]通過對(duì)胚胎期綿羊90 d和120 d背最長(zhǎng)肌樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，共鑒定出1 114個(gè)lncRNA，其中有466個(gè)差異表達(dá)lncRNA，并進(jìn)一步證明，差異表達(dá)lnc-SEMT在肌肉發(fā)育中起正調(diào)控作用。Li等[11]對(duì)新疆地方品種-哈薩克羊進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，在哈薩克羊出生前后骨骼肌的比較中鑒定了1 566個(gè)lncRNA，其中差異表達(dá)的lncRNA為404個(gè)。蘇尼特羊，也叫戈壁羊，主要產(chǎn)于內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟蘇尼特左旗和右旗，是經(jīng)過長(zhǎng)期的自然選擇和人工選育而形成的地方良種。蘇尼特羊肉肌肉飽滿，瘦肉率高，蛋白質(zhì)含量高、脂肪低，膻味輕，深受國(guó)內(nèi)外用戶的好評(píng)。蘇尼特羊肌肉發(fā)育相關(guān)lncRNA的研究尚未有相關(guān)報(bào)道，因此，本研究以蘇尼特羊肌肉為研究對(duì)象，對(duì)120 d胎兒和5月齡羔羊背最長(zhǎng)肌進(jìn)行RNA-seq測(cè)序分析，以期為解析蘇尼特羊肌肉發(fā)育的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為分子輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及RNA提取

試驗(yàn)樣本所用群體來自內(nèi)蒙古蘇尼特右旗某蘇尼特羊原種場(chǎng)。對(duì)妊娠120 d蘇尼特羊和5月齡蘇尼特羊羔羊靜脈注射40 mg/kg BW的戊巴比妥鈉麻醉，屠宰，采集120 d蘇尼特羊胎兒背最長(zhǎng)肌樣本3個(gè)、5月齡羔羊背最長(zhǎng)肌樣本2個(gè)，樣品采集后立即置于液氮中，然后儲(chǔ)存于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱中。利用Trizol法分別提取胎兒120 d和5月齡羔羊背最長(zhǎng)肌的總RNA。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污染，Nanodrop 2 000檢測(cè)RNA的純度及濃度。

1.2 文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序及轉(zhuǎn)錄本的拼裝

按照測(cè)序要求進(jìn)行l(wèi)ncRNA文庫(kù)構(gòu)建，由于采集樣本的日期不同，首先對(duì)3個(gè)120 d 胎兒背最長(zhǎng)肌RNA樣本進(jìn)行等量混池測(cè)序(MFH_MLcn)，然后對(duì) 5月齡羔羊背最長(zhǎng)肌進(jìn)行并行測(cè)序(S5BZ_MS)。測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiseqTM2500。利用fastx_toolkit(V0.0.13)軟件對(duì)測(cè)序得到的Raw reads進(jìn)行質(zhì)控過濾。使用Tophat 2(V2.0.9)將過濾后的測(cè)序序列比對(duì)到綿羊參考基因組，應(yīng)用cufflinks軟件對(duì)比對(duì)后的bam文件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本的拼接。

1.3 差異表達(dá)lncRNA的篩選和靶基因預(yù)測(cè)

首先通過5步篩選法進(jìn)行基本的篩選：轉(zhuǎn)錄本exon個(gè)數(shù)篩選、轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度篩選、轉(zhuǎn)錄本已知注釋篩選、轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量篩選和編碼潛能篩選，然后利用CPC、CNCI和pfam蛋白結(jié)構(gòu)域及PhyloCSF分析方法進(jìn)行編碼潛能的分析，最后取交集鑒定新的候選lncRNA。從候選lncRNA中篩選出差異表達(dá)的lncRNA，差異表達(dá)分析使用Cuffdiff軟件，差異表達(dá)分析標(biāo)準(zhǔn)為∣log2(Fold change)∣≥1且q<0.05。使用Cuffdiff(http:∥cufflinks.cbcb.umd.edu/manual.html#cuffdiff)軟件對(duì)篩選所得到的lncRNA進(jìn)行定量分析，從而得到各樣品中l(wèi)ncRNA的FPKM信息，對(duì)差異表達(dá)lncRNA的cis作用靶基因設(shè)定為lncRNA的上下游100 kb鄰近基因。

1.4 GO富集和KEGG通路分析

利用GOseq軟件[12]對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行GO分析。使用KOBAS軟件[13]進(jìn)行KEGG 通路分析。

1.5 lncRNA的熒光定量PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選取8個(gè)lncRNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。內(nèi)參基因選擇β-actin，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列信息如表1所示。熒光定量PCR反應(yīng)總體系20 μL：上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL，TB Green Premix Taq Ⅱ 10 μL，Rox reference dye Ⅱ 0.4 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s， 60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)，3個(gè)重復(fù)。用2-ΔΔCt法計(jì)算羔羊lncRNA的相對(duì)表達(dá)量，并與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。

表1 lncRNA引物序列信息Table 1 lncRNA primer sequence information

2 結(jié)果與分析

2.1 原始數(shù)據(jù)分析與質(zhì)控

對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)(Raw reads)進(jìn)行過濾分析，如表2所示，2組樣本的總Clean reads 的大小分別為17.94 G和 25.27 G。Q20和Q30的比列均在95%以上，表明測(cè)序質(zhì)量可靠。

表2 數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量情況Table 2 Statement of data output quality

2.2 序列比對(duì)與拼接

質(zhì)控后的Clean reads比對(duì)到綿羊參考基因組結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，120 d胎兒組(MFH_MLcn) 樣本中Clean reads的86.42%能定位到基因組上的測(cè)序序列，4.67%在參考序列上有多個(gè)比對(duì)位置,reads在參考序列上唯一比對(duì)率為81.75%；羔羊組(S5BZ_MS)樣本中的Clean reads比對(duì)到基因組上的比例均為80%以上，比對(duì)到參考序列上多個(gè)比對(duì)位置的比例為5.3%～5.64%, reads在參考序列上唯一比對(duì)率為75.06%～77.17%。

表3 Reads 與參考基因組比對(duì)Table 3 Summary of the alignment of reads with the reference genome

2.3 lncRNA轉(zhuǎn)錄本的鑒定

利用cufflinks對(duì)轉(zhuǎn)錄片段進(jìn)行拼接，初步篩選出10 3307個(gè)轉(zhuǎn)錄本。然后對(duì)這些轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分步篩選，最終鑒定到1 112個(gè)候選lncRNA轉(zhuǎn)錄本，其中包括586個(gè)已知lncRNA和526個(gè)新lncRNA，詳細(xì)結(jié)果見圖1(a)。進(jìn)一步對(duì)候選lncRNA進(jìn)行分類，如圖1(b)所示，基因間型lncRNA占90.3%，反義型lncRNA 占9.7%。未發(fā)現(xiàn)有內(nèi)含子型的lncRNA。

圖1 候選lncRNA 篩選與類型分布Fig.1 Screening and type distribution of candidate lncRNA

2.4 lncRNA結(jié)構(gòu)與特征分析

為研究蘇尼特羊肌肉中 lncRNA 的基本特征，對(duì)比分析了 lncRNA 與 mRNA的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度、外顯子數(shù)、ORF長(zhǎng)度及轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與mRNA相比，lncRNA長(zhǎng)度區(qū)間在200～3 000 bp的lncRNA數(shù)為890個(gè)，占總數(shù)lncRNA的80.0%。每個(gè)lncRNA平均長(zhǎng)度為2 517 bp，平均2.5個(gè)外顯子數(shù)(圖2(a))。包含2個(gè)和3個(gè)外顯子的lncRNA數(shù)占所有l(wèi)ncRNA的87.3%(971個(gè))(圖2(b))。對(duì)lncRNA的開放讀碼框(ORF)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)lncRNA的長(zhǎng)度在500 bp以內(nèi)，平均數(shù)為123 bp。如圖2(c)所示，mRNA的ORF長(zhǎng)度明顯大于lncRNA。這一結(jié)果也提示lncRNA在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等表觀調(diào)控方面起著重要的作用。對(duì)測(cè)序獲得的 lncRNA與 mRNA 的表達(dá)量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)mRNA的整體表達(dá)量明顯高于lncRNA(圖2(d))。

(a) lncRNA與mRNA的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度；(b) lncRNA與mRNA外顯子數(shù)目；(c) lncRNA與mRNA ORF長(zhǎng)度；(d) lncRNA與mRNA轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量；縱坐標(biāo)中的密度表示對(duì)應(yīng)橫坐標(biāo)軸數(shù)值的因子數(shù)/檢測(cè)因子的總數(shù)；FPKM表示每百萬(wàn)測(cè)序堿基中每千個(gè)轉(zhuǎn)錄子測(cè)序堿基中所包含的測(cè)序片段數(shù)。(a) lncRNA and mRNA transcripts length; (b) lncRNA and mRNA exon number; (c) lncRNA and mRNA ORF length; (d) lncRNA and mRNA transcript expression level; Density in Y-axis represent the number of factors corresponding to the value of the abscissa axis/the total number of detection factors； FPKM represent number of sequenced fragments contained in every thousand transcripts of sequenced bases per million of sequenced bases.圖2 lncRNA與mRNA的結(jié)構(gòu)特征比較分析Fig.2 Comparative analysis of structural characteristics between lncRNA and mRNA

2.5 lncRNA的差異表達(dá)分析

在|log2(Fold change)|>1和q<0.05條件下，2組樣本之間的差異表達(dá)結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，在胎兒120 d組和 5月齡羔羊組中獲得399個(gè)差異表達(dá)的 lncRNA，其中212個(gè)表達(dá)上調(diào)，187個(gè)表達(dá)下調(diào)。

圖3 差異表達(dá) lncRNA 火山圖Fig.3 Volcano map of differentially expressed IncRNA

對(duì)差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行層次聚類分析來判斷差異轉(zhuǎn)錄本在不同實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)模式，由圖4(a)可知，羔羊組樣本間聚類在一起，與胎兒組差異明顯。此外，胎兒組上調(diào)基因?qū)?yīng)下調(diào)基因，而羔羊組與胎兒組基因表達(dá)模式有不同，羔羊組lncRNA的表達(dá)模式下調(diào)基因多于上調(diào)基因。之后，兩兩之間的差異表達(dá)組之間進(jìn)行了韋恩圖(Venn)分析，結(jié)果如圖4(b)所示，共有11個(gè)lncRNA在所有差異表達(dá)組中被檢測(cè)到。差異表達(dá)lncRNA在不同樣本中的表達(dá)量見圖5,值得注意的是ENSOART00000028118、ENSOART00000028271、LNC_000424和LNC_000978轉(zhuǎn)錄本在2個(gè)組中都有較高表達(dá)。此外，LNC_000422在胎兒120 d中有表達(dá)，在5月齡羔羊中無表達(dá)；LNC_000942在5月齡羔羊中有表達(dá)，在胎兒120 d中無表達(dá)。ENSOART00000028384和LNC_000421在胎兒120 d中的表達(dá)量更高；LNC_000311和LNC_000719在5月齡羔羊中的表達(dá)量更高。

圖4 差異表達(dá)lncRNA分析Fig.4 Differential expression analysis of lncRNA

2.6 lncRNA 的熒光定量PCR驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，并檢測(cè)其在綿羊肌肉中的表達(dá)，隨機(jī)選擇8個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，其中LNC_000074, LNC_000196, LNC_000588在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中表現(xiàn)為上調(diào)，LNC_000233, LNC_000276,LNC_000408, LNC_000586和 LNC_000649在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中表現(xiàn)為下調(diào)，并通過qRT-PCR檢測(cè)其在胎兒及羔羊肌肉中的表達(dá)。由圖6可知，經(jīng) qRT-PCR 驗(yàn)證，LNC_000074,LNC_000196和LNC_000588均上調(diào)表達(dá)，與RNA-seq測(cè)序結(jié)果上調(diào)一致；LNC_000223，LNC_000276，LNC_000408，LNC_000586和LNC_000649均下調(diào)表達(dá)，與RNA-seq測(cè)序結(jié)果下調(diào)一致。證明實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)一致。

圖5 差異表達(dá)lncRNA在不同樣本中的表達(dá)量Fig.5 Expression of differentially expressed lncRNA in different samples

圖6 差異表達(dá)lnRNA qRT-PCR與RNA-seq比較分析Fig.6 Comparison analysis of differentially expressed lncRNA by qRT-PCR and RNA-seq

2.7 差異表達(dá)lncRNA靶向mRNA預(yù)測(cè)

利用lncRNA和mRNA的定位來預(yù)測(cè)lncRNA在順式調(diào)控關(guān)系中的潛在目標(biāo)。將共同位置的閾值設(shè)置為lncRNA的上下游100KB，結(jié)果表明，626個(gè)差異表達(dá)lncRNA中503個(gè)lncRNA存在鄰近基因。對(duì)應(yīng)于1 273個(gè)靶基因。其中多個(gè)lncRNA具有共同的靶基因，如LNC_000421和LNC_000422的靶基因?yàn)镽TL1等。也有l(wèi)ncRNA具有多個(gè)可變剪切靶向多個(gè)編碼基因，如編碼基因TNNT1，PPP1R12C,EPS8L1是LNC_000311的潛在目標(biāo)等，并且這些lncRNA呈現(xiàn)不同方向的調(diào)控作用。

2.8 靶基因的功能注釋分析(GO和KEGG)

對(duì)這些鄰近基因進(jìn)行功能注釋分析，GO結(jié)果分別從生物學(xué)過程(Biological process，BP)、細(xì)胞組分(Cellular component，CC)和分子功能(Molecular function，MF)3個(gè)條目進(jìn)行分類。結(jié)果如圖7顯示，MFH_MLcn vs S5BZ_MS差異表達(dá)lncRNA的靶基因顯著富集到了60個(gè)GO term條目中，其中，涉及代謝過程的調(diào)控，生物合成BP，蛋白結(jié)合GC以及免疫反應(yīng)MF等相關(guān)。另外，在其他GO term條目中也發(fā)現(xiàn)了包括肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)育、骨骼肌細(xì)胞分化，骨骼肌收縮、橫紋肌細(xì)絲，肌肉組織發(fā)育等與骨骼肌發(fā)育緊密相關(guān)的GO term，提示這些lncRNA在肌肉發(fā)育的不同階段起著重要的調(diào)控作用。

圖7 差異lncRNA 的GO富集分析Fig.7 GO enrichment analysis of differential lncRNA

對(duì)這些靶基因基因進(jìn)行KEGG通路分析，結(jié)果如圖8所示，這些靶基因主要涉及Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑、Notch信號(hào)通路、Gap連接和甲狀腺激素合成等，都可能與骨骼肌的生長(zhǎng)，發(fā)育和功能有關(guān)。這些結(jié)果表明lncRNA可能在骨骼肌的發(fā)育和生長(zhǎng)中起重要作用，可根據(jù)以上功能注釋信息對(duì)這些lncRNA開展肌肉發(fā)育相關(guān)的研究提供了重要的信息。

圖8 差異表達(dá)lncRNA靶基因KEGG分析Fig.8 KEGG analysis of differentially expressed lncRNA target gene

3 討 論

近年來，隨著綿羊基因組研究的不斷深入，對(duì)其基因組進(jìn)行了大量的注釋和功能分析，但對(duì)內(nèi)蒙古地方品種—蘇尼特羊長(zhǎng)鏈非編碼RNA的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究以蘇尼特羊肌肉為研究對(duì)象，對(duì)120 d胎兒和5月齡羔羊背最長(zhǎng)肌進(jìn)行RNA-seq測(cè)序分析，以期為解析蘇尼特羊肌肉發(fā)育的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為分子輔助育種提供參考。

在本研究中，通過對(duì)蘇尼特羊胎兒120 d和5月齡蘇尼特羊背最長(zhǎng)肌組織中的lncRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，進(jìn)一步預(yù)測(cè)lncRNA的靶基因以揭示他們的功能。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，對(duì)比分析了 lncRNA 與 mRNA 的長(zhǎng)度、外顯子數(shù)、外顯子大小及表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與mRNA相比，lncRNA長(zhǎng)度區(qū)間在200～3 000 bp的lncRNA數(shù)占總數(shù)lncRNA的80.0%，說明lncRNA保守性較差。包含2個(gè)和3個(gè)外顯子的lncRNA數(shù)占所有l(wèi)ncRNA的87.3%，平均為2.5個(gè)外顯子數(shù)，外顯子數(shù)量比較少，與Cabili等[14]的研究結(jié)果一致。mRNA的ORF長(zhǎng)度明顯大于lncRNA，說明蛋白質(zhì)編碼基因具有更長(zhǎng)的ORF。對(duì)測(cè)序獲得的 lncRNA與 mRNA 的表達(dá)量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)mRNA的整體表達(dá)量明顯高于lncRNA，可能與lncRNA沒有編碼蛋白質(zhì)的能力有關(guān)。Li等[11]通過對(duì)綿羊的lncRNA和mRNA進(jìn)行特征分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與mRNA相比，lncRNA的外顯子數(shù)量集中分布在2個(gè)或3個(gè)，且ORF長(zhǎng)度較短，表達(dá)水平較低。本研究與Li等的研究結(jié)果一致，這些相似之處說明本研究中分析的lncRNA可靠性較高。在本研究中總共鑒定了 1 112 個(gè)候選lncRNA，包括586個(gè)已知lncRNA和526個(gè)新lncRNA，得到靶向mRNA編碼基因?yàn)? 273個(gè)，這些基因也為今后的研究提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

進(jìn)一步對(duì)對(duì)胎兒120 d組(MFH_MLcn)和 5月齡羔羊組(S5BZ_MS)進(jìn)行差異表達(dá)分析，共獲得399個(gè)差異表達(dá)的 lncRNA，其中212個(gè)表達(dá)上調(diào)，187個(gè)表達(dá)下調(diào)，說明不同發(fā)育時(shí)期蘇尼特羊肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育具有不同的lncRNA調(diào)控機(jī)制。Zhan等[15]通過構(gòu)建山羊胎兒(45、60和105 d妊娠)和出生后(出生后3 d)背最長(zhǎng)肌的RNA文庫(kù)，在不同發(fā)育階段骨骼肌庫(kù)之間的配對(duì)比較中，共發(fā)現(xiàn)577個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本。蘇尼特羊lncRNA和山羊lncRNA之間的差異可能歸結(jié)于品種和階段特異性。通過對(duì)lncRNA在不同樣本中的FPKM值進(jìn)行比較，結(jié)果說明ENSOART00000028118、ENSOART00000028271、LNC_000424和LNC_000978均在胎兒120 d和5月齡羔羊中有表達(dá)，ENSOART00000028271、LNC_000978、LNC_000311和LNC_000719在5月齡羔羊中的表達(dá)量較高，ENSOART00000028118和LNC_000424則與之相反。其中，ENSOART00000028118和LNC_000424在5月齡羔羊組中的表達(dá)量顯著上調(diào)，該結(jié)果進(jìn)一步證明ENSOART00000028118和LNC_000424在不同發(fā)育時(shí)期的蘇尼特羊肌肉組織中具有不同的調(diào)控作用，調(diào)控機(jī)制可能為:在胎兒120 d肌肉組織發(fā)育中起負(fù)調(diào)控作用，在5月齡羔羊肌肉組織發(fā)育中起正調(diào)控作用。ENSOART00000028271、LNC_000311和LNC_000719在5月齡羔羊肌肉組織中的表達(dá)量顯著下調(diào)，可能說明其在胎兒120 d肌肉組織發(fā)育中起正調(diào)控作用，在5月齡羔羊肌肉組織發(fā)育中起負(fù)調(diào)控作用。說明lncRNA的表達(dá)調(diào)控在不同時(shí)期有不同的表達(dá)方向，但仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

文獻(xiàn)研究顯示，在本研究鑒定到顯著差異的lncRNA中， ENSOART00000028118、 ENSOART00000028384、ENSOART00000027214、ENSOART00000028894、LNC_000196、LNC_00023、LNC_000269、LNC_000307、LNC_000311、LNC_000421、LNC_000422、LNC_00459 和 LNC_000879分別靶向?qū)?yīng)與綿羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因PPP1R12C、EPS8L1、RTL1、SIRT1、TRIM7、KLHL40、TNNI1、MEF2C、FOSB、JPH2和MYH1。研究表明，RTL1基因被證實(shí)參與促進(jìn)小鼠肌肉的增長(zhǎng)[16]，并且可顯著調(diào)控綿羊的肌肉肥大[17]。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1基因?qū)∪夂椭镜陌l(fā)育均具有調(diào)控作用[18]。TRIM7為糖原蛋白相互作用蛋白(GNIP),并被證明在骨骼肌中高表達(dá)[19]。Chao等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，KLHL40基因被預(yù)測(cè)為L(zhǎng)OC105603392的一個(gè)順式調(diào)控基因，并且被證明為肌肉的特異轉(zhuǎn)錄基因位點(diǎn)[21]。而作為慢骨骼肌鈣蛋白基因，TNNT1、TNNI1和TNNC1在綿羊肌肉中具有一致的表達(dá)模式[22]，同時(shí)有研究證明他們是維持緩慢肌纖維的重要基因[23]。Potthoff等[24]研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌中 MEF2C 的缺失會(huì)導(dǎo)致肌節(jié)組織出現(xiàn)異常。此外，F(xiàn)OSB作為FOS家族的一員，在細(xì)胞增殖、分化和骨骼發(fā)育中起著重要的作用。FOS家族編碼亮氨酸拉鏈蛋白，與JUN家族的蛋白質(zhì)二聚體結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1，參與細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)化[25]。研究也表明JPH2基因被認(rèn)為是心肌細(xì)胞內(nèi)T-小管成熟的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物，其突變可導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病[26]，由此可以證明JPH2具有調(diào)節(jié)骨骼肌中生物學(xué)功能的作用。此外發(fā)現(xiàn) 120 d 羔羊胎兒與5月齡羔羊中LNC_000421和LNC_000422與其靶基因RTL1之間呈正調(diào)控，說明LNC_000421和LNC_000422通過對(duì)靶基因RTL1的調(diào)控來促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)。ENSOART00000028118與其靶基因IGF2之間呈正調(diào)控，LNC_000311與其對(duì)應(yīng)的靶基因TNNI3之間也呈現(xiàn)正調(diào)控趨勢(shì)，說明ENSOART00000028118和LNC_000311參與了蘇尼特羊胚胎期至性成熟期發(fā)育階段骨骼肌的發(fā)育過程。這些結(jié)果進(jìn)一步揭示了lncRNA及其靶基因的協(xié)同關(guān)系,提示接下來可以側(cè)重研究這些lncRNA在蘇尼特羊肌肉中的功能及作用機(jī)制。

在對(duì)差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，在一些lncRNA在肌肉調(diào)節(jié)中起重要作用的通路中顯著富集。主要涉及Wnt信號(hào)通路[27]、Notch信號(hào)通路、Gap連接[28]和甲狀腺激素合成[29]等相關(guān)通路，均與肌肉發(fā)育相關(guān)，證明這些差異表達(dá)的lncRNA可以通過以上信號(hào)通路對(duì)肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行調(diào)控。Li等[11]通過對(duì)哈薩克羊進(jìn)行KEGG分析發(fā)現(xiàn)主要涉及Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑、鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑、Gap連接、河馬信號(hào)傳導(dǎo)和甲狀腺激素合成等信號(hào)通路，其可能與骨骼肌的生長(zhǎng)，發(fā)育和功能有關(guān)。本研究結(jié)果與Li的部分相似，進(jìn)一步提高了本研究預(yù)測(cè)關(guān)鍵基因及其相關(guān)通路的準(zhǔn)確性。

4 結(jié) 論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)蘇尼特羊不同發(fā)育階段肌肉進(jìn)行了初步的鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)在蘇尼特羊肌肉中存在大量的lncRNA，其表達(dá)水平在不同的發(fā)育階段存在著一定的差異。通過GO和KEGG富集分析，這些差異表達(dá)lncRNA涉及代謝過程的調(diào)控，生物合成，基因表達(dá)，蛋白結(jié)合以及mTOR信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、胰島素信號(hào)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、Wnt信號(hào)通路、間隙連接等信號(hào)通路。并篩選出13個(gè)與不同發(fā)育階段骨骼肌相關(guān)的候選lncRNA和靶基因，為從lncRNA的角度更好地理解蘇尼特羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的遺傳調(diào)控機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，也為綿羊分子輔助育種提供參考。