人工牛黃及天然牛黃有效成分的含量測(cè)定分析

張 林，龐春潔

（馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，湖北 武漢 430064）

牛黃是我國(guó)的一種傳統(tǒng)名貴中藥材，為牛的膽結(jié)石，藥用價(jià)值較高，其功效主要為解毒、息風(fēng)、涼肝、開竅、豁痰、清熱等[1]。牛黃在我國(guó)具有較大的需求量，大約有超過600種中成藥是以牛黃為原料制作而成的。然而在牛體內(nèi)，天然牛黃的自然發(fā)生率卻比較低，無(wú)法有效滿足中成藥生產(chǎn)以及臨床的實(shí)際需求。人工牛黃則是將新鮮的牛膽汁作為原料，配以膽酸、?；撬?、膽紅素、微量元素等加工制作而成的一種牛黃替代品[2]。有研究顯示，人工牛黃其成份與天然牛黃相近，在某些應(yīng)用領(lǐng)域可取代天然牛黃入藥，具有較好的臨床效果。牛黃的主要有效成分之一就是膽紅素，膽紅素含量的水平直接影響牛黃質(zhì)量，也是牛黃的重要評(píng)價(jià)依據(jù)[3]。本研究選擇液相色譜法測(cè)定人工及天然牛黃中膽紅素成分的含量，以檢測(cè)兩種牛黃有效成份差異，希望能為新藥開發(fā)提供技術(shù)資料以及試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

選用安捷倫1260型高效液相色譜儀，北京賽多利斯儀器有限公司的1/10000電子分析天平；昆山超聲儀器有限公司的KQ-500DE型超聲波清洗器。

1.2 試藥

牛黃選購(gòu)山東省藥材公司的天然牛黃以及湖南迪博制藥有限公司的人工牛黃；選用中國(guó)藥品生物制品鑒定所的膽紅素對(duì)照品；甲醇、三氯甲烷、水分別選擇、色譜純、分析純、二次純化水。

2 方 法

2.1 制備溶液

取適量的膽紅素對(duì)照品，放置在棕色量瓶?jī)?nèi)，選擇二甲亞砜將其溶解，制作成每毫升含0.58 mg膽紅素的對(duì)照品溶液，該溶液即為儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確量取10.0 mg牛黃樣品，置在5 ml棕色量瓶?jī)?nèi)，選擇二甲亞砜進(jìn)行稀釋、定容到刻度，進(jìn)行10分鐘超聲處理，然后進(jìn)行5分鐘離心處理，選取上清液過0.22 μm濾膜即可得到供試品溶液。

2.2 色譜條件

選擇Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；選擇甲醇-三氯甲烷-1%醋酸（65:32:3）作為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為455 nm，流速設(shè)置為每分鐘1.0 ml。

2.3 色譜分析

①制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：選取2.0 ml對(duì)照品儲(chǔ)備液，放置在10 ml棕色量瓶?jī)?nèi)，通過二甲亞砜將其稀釋到刻度。分別選取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml該溶液，放置于5 ml棕色量瓶?jī)?nèi)，選擇二甲亞砜稀釋、定容到刻度。3次進(jìn)樣，對(duì)色譜圖進(jìn)行記錄，對(duì)膽紅素平均濃度以及峰面積作線性回歸，獲回歸方程Y=19158X-4859.5，r=0.9998，結(jié)果顯示當(dāng)膽紅素濃度處于2.29～27.78 μg/ml范圍時(shí)，線性關(guān)系比較理想。②精密度試驗(yàn)：選擇9.27 μg/ml濃度20 μl的膽紅素對(duì)照品溶液，重復(fù)6次進(jìn)樣，對(duì)峰面積進(jìn)行測(cè)定；結(jié)果顯示色譜峰面積平均值為215659，RSD為2.57%。顯示進(jìn)樣精密度比較理想。③穩(wěn)定性試驗(yàn)：選取放置在避光、常溫條件下的20 μl人工牛黃供試品溶液，在0、1、2、3、4、5、8、10小時(shí)進(jìn)樣，對(duì)膽紅素峰面積進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果顯示峰面積平均值為252278，RSD=2.32%。分析結(jié)果顯示在避光、常溫條件下放置10小時(shí)的穩(wěn)定性比較理想。④重復(fù)性試驗(yàn)：準(zhǔn)確量取6份批號(hào)相同的人工牛黃供試品，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示膽紅素含量平均值為4.73μg/mg，RSD=2.25%，重復(fù)性比較理想。⑤回收率試驗(yàn)：準(zhǔn)確量取9份人工牛黃，并將其分為3組，每組各3分。分別在3組樣品中加入3種高、中、低不同的含量的膽紅素對(duì)照品溶液，并將其制作成供試品溶液。準(zhǔn)確選取20μl供試品溶液進(jìn)樣，每一樣品重復(fù)測(cè)量3次膽紅素含量，對(duì)回收率進(jìn)行計(jì)算。

2.4 測(cè)定樣品

選取人工牛黃和天然牛黃，按上述方法將其制作成供試品溶液。準(zhǔn)確量取20 μl供試品溶液進(jìn)樣，重復(fù)測(cè)量3次膽紅素含量。

3 結(jié) 果

3.1 回收率計(jì)算結(jié)果

高、中、低三種不同的含量的膽紅素加樣回收率分別為98.42%、98.62%、98.48%，具體測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 回收率計(jì)算結(jié)果

3.2 樣品測(cè)定結(jié)果

經(jīng)3次測(cè)定，天然牛黃膽紅素含量為（44.21±0.27）μg/mg，人工牛黃為（4.92±0.24）μg/mg。

4 討 論

本試驗(yàn)中對(duì)甲醇-三氯甲烷-醋酸、甲醇-三氯甲烷-磷酸作為流動(dòng)相的選擇，進(jìn)行對(duì)比分析，由于磷酸容易析出結(jié)晶，而1%醋酸和0.5%磷酸作為流動(dòng)相效果類似，故本研究選擇甲醇-三氯甲烷-1%醋酸（65:32:3）作為流動(dòng)相。由于膽紅素的穩(wěn)定性較差，選擇索氏提取或回流法提取的效果并不理想，所以本研究選擇超聲進(jìn)行提取。對(duì)于提取溶劑選擇上，通過對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于三氯甲烷等提取劑，二甲亞砜的提取率更高，因此本試驗(yàn)的提取溶劑選擇二甲亞砜。在超聲時(shí)間選擇上，分別試驗(yàn)10分鐘、15分鐘、20分鐘，發(fā)現(xiàn)超聲10分鐘提取率最高。同時(shí)由于膽紅素在光照、加溫時(shí)易出現(xiàn)不穩(wěn)定性[4]，建議在HPLC測(cè)定中選擇棕色量瓶。

分析本研究結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，和天然牛黃相比較，人工牛黃膽紅素含量?jī)H為（4.92±0.24）μg/mg，而天然牛黃的膽紅素含量達(dá)（44.21±0.27）μg/mg，兩者差異明顯。提示，在選擇人工牛黃入藥時(shí)，其用量可以適當(dāng)增加。

綜上所述，兩種牛黃其有效成份含量存在明顯差異，HPLC法可對(duì)人工牛黃以及天然牛黃的有效成分含量進(jìn)行精確測(cè)定，該方法操作簡(jiǎn)單方便，準(zhǔn)確性高。