土壤中一株溶磷青霉菌的分離鑒定及其應(yīng)用效果研究

許昌超，張俊濤，葉少萍，鄭富海

（廣州市林業(yè)和園林科學(xué)研究院，廣東 廣州 510405）

我國農(nóng)業(yè)耕地土壤普遍存在速效磷含量偏低的情況［1］。為滿足作物生長，大量磷肥的使用導(dǎo)致了嚴(yán)重的地下水污染以及地表水體富營養(yǎng)化等環(huán)境問題［2］。由于土壤中存在Ca2+、Al3+、Fe3+等金屬離子易與可溶性磷肥形成難溶物，導(dǎo)致植物對(duì)磷肥的利用率極低［3］，這種土壤總磷含量高但有效磷不足的情況被稱作磷素的“遺傳學(xué)缺乏”，而非“土壤學(xué)缺乏”［4］。研究表明，土壤中存在一類微生物可將植物無法利用的無效磷轉(zhuǎn)化為植物可以吸收的有效磷，為解決植物營養(yǎng)性缺磷問題指明了新的方向［5］。目前，已知的溶磷菌涵蓋了真菌、細(xì)菌和放線菌，其中溶磷真菌涵蓋了數(shù)十個(gè)屬［6-7］，分離和研究較多的土壤溶磷真菌絕大多數(shù)屬于曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬（Penicillium），江紅梅等［8］針對(duì)溶磷青霉菌進(jìn)行了較為詳細(xì)的羅列。多數(shù)研究認(rèn)為溶磷菌的溶磷機(jī)理與菌株分泌的H+以及有機(jī)酸種類和含量有關(guān)［9］?？傮w來看，真菌活化和溶解土壤難溶性無機(jī)磷鹽的能力要比細(xì)菌強(qiáng)，且效果更為穩(wěn)定［6，10］。

目前，已報(bào)道的溶磷真菌能夠溶解的難溶性無機(jī)磷源包括Ca3（PO4）2、 FePO4、 AlPO4、Zn3（PO4）2、 氟磷灰石以及磷礦粉等，多數(shù)對(duì)Ca3（PO4）2具有較好的溶解能力［11］。溶磷真菌的溶磷能力范圍波動(dòng)較大，以對(duì)Ca3（PO4）2的溶解能力為例，楊順等［12］從作物根圍土壤中篩選出的黑曲霉（A.niger）和塔賓曲霉（A.tubingensis）的溶解量分別為83.36 和79.50 mg/L；李學(xué)平等［13］從鹽堿地草坪根際篩選出的真菌溶磷能力達(dá)到310.23 mg/L；史發(fā)超等［14］從玉米和大豆土壤根際篩選出的一株斜臥青霉菌（P.decumbens）的溶磷能力高達(dá)956 mg/L；姜煥煥等［15］從土壤中篩出的16株真菌溶磷量在 11.4 ～231.7 mg/L之間。

李海云等［3］對(duì)文獻(xiàn)中溶磷菌的來源進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)溶磷菌的分布具有很強(qiáng)的根際效應(yīng)；趙小蓉等［16］也發(fā)現(xiàn)玉米和小麥根際溶磷菌數(shù)量比非根際土壤中的溶磷菌數(shù)量要高出1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，從植物根際土壤中可能更容易篩選出溶磷 菌株。

目前，國內(nèi)外關(guān)于溶磷菌的使用方式和效果也開展了較多的研究。Wang等［17］利用不同滅菌方式（伽馬射線滅菌或高溫滅菌）處理的泥炭、玉米芯、珍珠巖、麥麩以及腐熟牛糞搭配組合來作為溶磷黑曲霉的載體，添加到白菜種植土中后，顯著提高了土壤有效磷含量和白菜植株的生物量，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了黑曲霉菌株在土壤中的穩(wěn)定續(xù)存。史發(fā)超等［14］向農(nóng)田土壤中接種一株斜臥青霉菌，相對(duì)于不接種菌劑的農(nóng)田，其玉米產(chǎn)量增加2.4 t/hm2，增產(chǎn)率達(dá)到35.3%。閆輝等［18］發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)氮素和溶磷菌混施對(duì)土壤有效磷增量和小白菜促生的效果存在 差異。

考慮到溶磷真菌在溶磷能力和溶磷穩(wěn)定性方面的優(yōu)勢，該研究以廣州南沙區(qū)農(nóng)田作物根際土壤為篩選對(duì)象，進(jìn)行新優(yōu)溶磷真菌的篩選并獲得一株溶磷青霉菌。經(jīng)鑒定該菌為P.brocae，目前國內(nèi)外關(guān)于該種青霉菌的研究較少，對(duì)其溶磷能力的描述更是鮮見報(bào)道。本文進(jìn)一步對(duì)P.brocae的溶磷特性進(jìn)行了分析，并結(jié)合栽培試驗(yàn)驗(yàn)證了該菌株的應(yīng)用潛力，為新優(yōu)溶磷菌劑的開發(fā)和研究提供理論依據(jù)和可用的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

土壤樣品：采集自廣州市南沙區(qū)耕地土壤。

改良Pikovskaya（PVK）培養(yǎng)基：Glucose 10 g，無機(jī)氮源［（NH4）2SO40.5 g或KNO30.76 g，二者N含量相同］，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·4H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Yeast extract 0.5 g，無機(jī)磷源［Ca3（PO4）2、FePO4或AlPO4，其中P素含量2 g，相當(dāng)于Ca3（PO4）210 g、FePO49.74 g或AlPO47.87 g，在培養(yǎng)基滅菌后分別單獨(dú)加入］，Agar 15 g（固體平板），文中無特別說明磷源均選擇Ca3（PO4）2，氮源均選擇（NH4）2SO4，蒸餾水補(bǔ)足1 L，pH調(diào)節(jié)至7.0左右，滅菌120 ℃，30 min。

溶磷真菌篩選培養(yǎng)基：以Ca3（PO4）2為無機(jī)磷源的PVK固體培養(yǎng)基，分別添加氯霉素和鏈霉素至終濃度為50 mg/L。

PD/PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖液體/馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（BD，美國）。

分子試驗(yàn)材料：真菌DNA提取試劑盒（OMEGA，美國）；PCR試劑盒（東盛，國產(chǎn)）。

HPLC標(biāo)準(zhǔn)品：乙酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、檸檬酸、葡萄糖酸和酒石酸（Sigma-Aldrich，美國）、蘋果酸（源葉生物，國產(chǎn)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分離、純化和培養(yǎng)

稱取10 g土壤，放入500 mL三角瓶中，加100 mL無菌水，搖床振蕩30 min（30℃，200 r/min），將適量懸液用溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的滅菌NaCl水溶液按體積比梯度稀釋至10-4，取100 μL稀釋液均勻涂布在溶磷真菌篩選培養(yǎng)基上，每個(gè)樣品重復(fù)3次，然后放于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，每天對(duì)平板上菌落的生長和溶磷圈進(jìn)行跟蹤 觀察。

將溶磷真菌篩選培養(yǎng)平板上具有溶磷圈的菌落重新接種在改良的PVK培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化和溶磷圈的觀察。將純化了的真菌菌落接種到PDA平板或PDA斜面進(jìn)行形態(tài)觀察和保存，在PDA平板上挑取菌落接種于液體PD培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁，用于DNA提取和鑒定。

1.2.2 DNA提取和鑒定

取3 mL真菌液體培養(yǎng)基（OD600約0.8～1.0）， 10 000 r/min，5 min收 集 菌 體，0.8% NaCl清 洗2次（重懸后離心收集菌體），利用真菌DNA提取試劑盒提取DNA。利用引物ITS1（5’-TCCGTAGCTG AACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3’）對(duì)真菌ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增（94℃ 2 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30 cycles；72℃ 5 min；4℃ forever），反應(yīng)體系：PCR premix 25 μL，ITS1 1 μL（10 μmol/L），ITS4 1 μL（10 μmol/L），Template 1 μL，加水補(bǔ)足至50 μL。回收PCR產(chǎn)物，進(jìn)行基因測序分析。

1.2.3 液體培養(yǎng)條件下的溶磷能力測定

液體培養(yǎng)試驗(yàn)共設(shè)置3種無機(jī)磷鹽［Ca3（PO4）2、 FePO4或AlPO4］和 兩 種 氮 源［（NH4）2SO4或KNO3］，重復(fù)4次。將平板上的菌株接種到3 mL液體培養(yǎng)基中，待OD600達(dá)到0.6左右，取3 mL接種到裝有500 mL無機(jī)磷液體培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床振蕩培養(yǎng)，每隔24 h取樣一次，連續(xù)取樣7 d，對(duì)樣品進(jìn)行離心，收集上清液，利用鉬銻抗比色法測定液體中有效磷含量，并記錄對(duì)應(yīng)pH，以7 d內(nèi)能夠達(dá)到的最大溶磷量為溶磷峰值。

1.2.4 溶磷菌促生效果盆栽試驗(yàn)

供試土壤為廣州市常見的山地紅壤。鈣鎂磷肥（P2O5含量為10%）與土壤按照0.5 g/kg的比例混合，孢子懸液（1×108cfu/mL）或水按照10 mL/kg土壤添加，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，采用方形育苗盤（52 cm × 52 cm × 13 cm），每盆裝土15 kg且移栽長勢一致的小白菜16株，移栽30 d后測量根際抖落土壤有效磷含量（NaHCO3浸提）、小白菜植株鮮重以及干重，記錄分析。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5 發(fā)酵液小分子有機(jī)酸組成分析

取P6發(fā)酵液，經(jīng)高速離心（13 000 r/min，30 min）后取上清液，過0.45 μm濾膜壓濾等處理，用高效液相色譜儀（島津，LC-20A）檢測有機(jī)酸種類和含量。色譜條件見表2。

表2 色譜參數(shù)

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷菌的分離與鑒定

以Ca3（PO4）2為無機(jī)磷源，從農(nóng)田土壤中得到一株溶磷真菌，從外觀上看初步判斷為青霉屬（Penicillium），命名為P6（圖1）。將純化后的P6分別接種于AlPO4、FePO4和Ca3（PO4）2無機(jī)磷篩選平板上（圖2），觀察發(fā)現(xiàn)P6在AlPO4平板上的菌落最小，無可見溶磷圈；在FePO4平板上，基內(nèi)菌絲和氣生菌絲的著色均較深，無可見溶磷圈；在Ca3（PO4）2平板上基內(nèi)菌絲和氣生菌絲著色最淺，基本呈乳白色，略帶青色，周圍有較淺溶磷圈。為了優(yōu)化P6在Ca3（PO4）2平板上溶磷圈的觀察條件，這里以Ca3（PO4）2濃度和觀察時(shí)間為變量，照片記錄溶磷圈的變化情況（圖3），從圖中可以看出Ca3（PO4）2濃度越低，溶磷圈出現(xiàn)的時(shí)間越早且越明顯，說明在篩選初期適當(dāng)降低Ca3（PO4）2濃度可方便溶磷圈觀察。

圖1 P6在PVK平板上的成熟形態(tài)

圖2 P6在含Ca3（PO4）2、AlPO4或FePO4平板上的 菌落形態(tài)和溶磷情況

圖3 P6在平板上產(chǎn)生的溶磷圈特征與Ca3（PO4）2 濃度和培養(yǎng)時(shí)間之間的關(guān)系（平板反面）

將ITS序列測序結(jié)果和已知的其它青霉菌屬菌株進(jìn)行序列比對(duì)，并利用Mega 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。結(jié)果顯示，P6和P.brocae的同源性高達(dá)99.8%，目前尚未見關(guān)于該種溶磷菌的相關(guān) 報(bào)道。

2.2 P6的溶磷能力分析

為了量化P6的溶磷能力，對(duì)液體環(huán)境下連續(xù)培養(yǎng)7 d內(nèi)的P6溶磷峰值進(jìn)行了分析（表3），在以（NH4）2SO4為氮源的培養(yǎng)基中，P6溶解Ca3（PO4）2的能力在第4 d達(dá)到峰值（403.4 mg/L）；對(duì)AlPO4的溶解量在第2 d達(dá)到峰值（14.5 mg/L）；對(duì)FePO4的溶解量在第3 d達(dá)到峰值（16.5 mg/L），P6對(duì)3種無機(jī)磷源的溶磷能力總體表現(xiàn)為Ca3（PO4）2> FePO4>AlPO4。在以KNO3為氮源的培養(yǎng)基中，P6在上述3種無機(jī)磷培養(yǎng)液中的溶磷能力分別于 第4、第3和第4 d達(dá)到溶磷峰值分別為428.7、11.6和10.1 mg/L，溶磷偏好性表現(xiàn)為Ca3（PO4）2> AlPO4>FePO4?？偟膩碚f，以NO3-替代NH4+，能提高P6對(duì)Ca3PO4的溶解能力，但對(duì)AlPO4和FePO4的溶解能力均有所降低。前面的試驗(yàn)表明，P6不能在含AlPO4和FePO4的固體平板上形成溶磷圈，但在液體環(huán)境下能夠溶解AlPO4和FePO4，從溶磷量上來看，要遠(yuǎn)小于P6對(duì)Ca3（PO4）2的溶解能力。

表3 P6在液體培養(yǎng)條件下氮源對(duì)Ca3（PO4）2、FePO4和AlPO4的溶磷峰值 （mg/L）

2.3 P6發(fā)酵液pH變化和組成分析

對(duì)發(fā)酵過程中的PVK培養(yǎng)基的pH進(jìn)行跟蹤檢測發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，發(fā)酵液的pH總體呈下降趨勢（圖5）。有相關(guān)研究表明，溶磷真菌的溶磷作用與其分泌的有機(jī)酸密切相關(guān)，在此基礎(chǔ)上通過HPLC對(duì)培養(yǎng)基的有機(jī)酸組成進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)品和P6發(fā)酵液樣品色譜圖如圖6、7所示，結(jié)果表明培養(yǎng)基中有較高含量的草酸和乳酸以及少量的蘋果酸和檸檬酸，這可能是導(dǎo)致發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的pH持續(xù)下降的原因。

圖5 溶磷菌P6發(fā)酵液的pH隨時(shí)間的變化關(guān)系

圖6 9種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖7 P6培養(yǎng)基有機(jī)酸組成色譜圖

2.4 P6對(duì)小白菜的促生效果

本研究對(duì)處理和對(duì)照組小白菜的鮮重、干重以及根際土壤有效磷含量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析（表4），發(fā)現(xiàn)T2處理組的上述各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于其他3組，較對(duì)照組CK2處理分別提高了21.8%、16.0%和13.6%，且差異顯著（P＜0.05），說明了在P6和鈣鎂磷肥混合施肥的情況下，P6能夠提高鈣鎂磷肥的肥效。此外，數(shù)據(jù)分析還表明，盡管T1處理在各項(xiàng)檢測指標(biāo)上均不及CK2處理，但T1處理的小白菜鮮重和根際土壤有效磷含量相較于CK1處理分別增加了10.2%和14.2%，有顯著提高，該結(jié)果說明單獨(dú)向土壤中添加P6的改良和促生效果不及添加鈣鎂磷肥，但P6的添加確實(shí)起到了增加土壤有效磷含量和促進(jìn)小白菜生長的作用。

表4 溶磷菌P6對(duì)小白菜（B．chinensis）的促生效果評(píng)價(jià)

3 討論

國內(nèi)外關(guān)于青霉屬菌株的溶磷能力研究有較多報(bào)道，涉及的種類包括草酸青霉菌（P．oxalicum）、棘孢青霉菌（P．a(chǎn)culeatum）以及拜萊青霉菌（P．bilaiae）等，其中拜萊青霉菌已經(jīng)在國外被廣泛用于作物增產(chǎn)研究和應(yīng)用［19-21］。本文從土壤中篩選出了一株具有溶磷能力的P．brocae菌株（圖1），目前尚未見該種青霉菌溶磷特性方面的相關(guān)報(bào)道。從P6菌落生長狀態(tài)上看（圖2），同時(shí)期的P6在Ca3（PO4）2、AlPO4和FePO4平板上的菌落直徑和外觀（主要是孢子產(chǎn)生導(dǎo)致的氣生菌絲顏色深淺和基內(nèi)菌絲色素沉積等方面）存在差異，這可能與菌株在不同磷源平板上獲取生長所需磷元素的能力以及不同金屬元素對(duì)菌株的毒性有關(guān)。

文中研究了溶磷菌P6在不同濃度的Ca3（PO4）2平板上溶磷圈出現(xiàn)時(shí)間和大小隨時(shí)間的變化關(guān)系（圖3），發(fā)現(xiàn)降低Ca3（PO4）2的濃度可以使溶磷圈出現(xiàn)的時(shí)間提前，且溶磷圈更明顯，容易觀察。因此，建議從土壤中篩選溶磷菌時(shí)可適當(dāng)降低Ca3（PO4）2濃度，一方面方便溶磷圈觀察，另一方面可以縮短溶磷圈出現(xiàn)的時(shí)間，這會(huì)降低平板上眾多菌株間交叉污染的概率，節(jié)省純化時(shí)間。此外，低濃度的Ca3（PO4）2平板可能會(huì)提高環(huán)境中溶磷菌資源發(fā)掘的概率（如一些溶磷能力稍弱的菌種）。P6不能在以AlPO4和FePO4為無機(jī)磷源的篩選平板上產(chǎn)生溶磷圈（圖2），但是在液體培養(yǎng)環(huán)境下可以檢測到對(duì)AlPO4和FePO4的溶解能力（表3），P6對(duì)二者的溶解能力要顯著低于對(duì)Ca3（PO4）2的溶解能力，這可能是導(dǎo)致在AlPO4和FePO4平板上肉眼無法觀察到顯著溶磷圈的原因之一。葉勁松等［22］也報(bào)道了一株在固體平板上不能產(chǎn)生溶磷圈，但具有溶磷能力的霉菌。綜合前人的研究結(jié)果來看，與青霉菌相比，黑曲霉具有更好的溶解AlPO4和FePO4的能 力［23-24］。因此，可以考慮用黑曲霉和青霉菌做成復(fù)合菌劑來使用。

Asea等［25］研究認(rèn)為溶磷菌需要依靠吸收NH4+-N來分泌H+，從而達(dá)到溶磷的目的。虞偉斌等［26］闡述了一株假單胞菌以NH4+代替NO3-作為氮源能更好地溶解Ca3（PO4）2，溶磷能力提高了37倍。林英等［27］也發(fā)現(xiàn)一株伯克氏菌以NH4+作為氮源表現(xiàn)出更強(qiáng)的溶磷能力。此外，氮源種類也會(huì)影響菌株的代謝途徑和分泌有機(jī)酸的種類和量，如范丙全等［28］發(fā)現(xiàn)以NH4

+代替NO3-能顯著增加兩株供試青霉菌分泌有機(jī)酸的種類和產(chǎn)量，但溶解摩洛哥磷礦粉的能力卻有所降低，說明可能存在其他不依賴H+和有機(jī)酸的溶磷機(jī)理。在針對(duì)P6的溶磷特性研究中發(fā)現(xiàn)，利用NO3-代替NH4+的情況下，菌株對(duì)Ca3（PO4）2的溶解能力提高，但對(duì)AlPO4和FePO4溶解存在降低趨勢，可能預(yù)示著P6對(duì)AlPO4和FePO4的溶解存在不一樣的溶磷機(jī)理（表3）?？偟膩砜?，氮源種類對(duì)菌株溶磷能力的影響受菌株和磷源種類的影響較大，尚無確切定論［23，28］。對(duì)P6的發(fā)酵液檢測和分析確實(shí)發(fā)現(xiàn)了pH降低和有機(jī)酸分泌的現(xiàn)象（圖5、6和7），趙小蓉等［23］認(rèn)為Ca3（PO4）2溶解可能是由于真菌分泌的質(zhì)子和有機(jī)酸絡(luò)合雙重作用的結(jié)果，而AlPO4和FePO4的溶解可能只通過絡(luò)合作用，所以一般情況下溶磷菌更易溶解Ca3（PO4）2。王光華等［24］研究表明改變碳源種類也可以提高菌株的溶磷能力，未來可以嘗試通過改變碳源種類來提高P6的發(fā)酵和溶磷潛力。此外，P6在7 d內(nèi)的溶磷峰值并未出現(xiàn)在pH最低的節(jié)點(diǎn)上，二者相關(guān)性并不明顯，但該現(xiàn)象也不能排除有機(jī)酸分泌和pH降低在菌株溶磷過程中的作用，這可能是與其它未闡明的溶磷相關(guān)因素共同作用的結(jié)果。

溶磷菌能夠提高土壤中有效磷含量，促進(jìn)作物生長［29］，有研究表明直接向土壤中添加小分子有機(jī)酸能夠提高土壤有效磷含量［30］。因此，溶磷菌的促生作用可能與其分泌的有機(jī)酸有關(guān)，也有研究表明若干溶磷菌株可分泌植物生長激素IAA（吲哚乙 酸）［8］。本試驗(yàn)中利用小白菜作為供試植物，對(duì)溶磷菌P6的使用效果進(jìn)行了量化分析。結(jié)果表明，P6除了能夠提高土壤有效磷含量之外，還能提高鈣鎂磷肥的肥效，從而促進(jìn)小白菜生物量的增加（表4）。

4 結(jié)論

從土壤中篩選出一株溶磷青霉菌，經(jīng)鑒定為P．brocae，目前尚未見關(guān)于該菌株在溶磷特性方面的報(bào)道。研究表明，該菌對(duì)Ca3（PO4）2具有良好的溶解能力，對(duì)AlPO4和FePO4的溶解效果則較差，適當(dāng)調(diào)節(jié)固體篩選培養(yǎng)基中的Ca3（PO4）2含量可改善溶磷圈的觀察效果。P6的培養(yǎng)基隨培養(yǎng)時(shí)間延長，pH總體呈降低趨勢，并且在培養(yǎng)基中檢測到草酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸，溶磷能力和pH并無緊密關(guān)聯(lián)。小白菜B．chinensis栽培實(shí)驗(yàn)表明P6能夠提高根際土壤有效磷含量，也可以提高鈣鎂磷肥對(duì)小白菜的促生效果。