任康軼 任洛 鄧昱 謝曉虹 臧娜 謝軍 羅征秀羅健 符州 劉恩梅 李渠北

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸科/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室/兒童感染免疫重慶市重點實驗室，重慶 400014）

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是引起全球嬰幼兒下呼吸道感染的最主要病毒病原[1]，感染RSV后可致毛細(xì)支氣管炎及肺炎等，甚至可引起呼吸衰竭。文獻(xiàn)報道，RSV 感染主要集中在0～2 歲的嬰幼兒，嬰幼兒時期重癥RSV 感染與學(xué)齡期持續(xù)喘息、罹患哮喘、肺功能減退有關(guān)[2]。然而至今尚無有效的疫苗預(yù)防，已造成極大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。RSV 可分為A 和B 亞型，A 和B 亞型又根據(jù)基因序列的不同分為不同的亞型[3]。RSV全年均可檢出，溫帶地區(qū)主要在冬季流行，而熱帶地區(qū)以雨季為主[4]。在全球不同國家、不同地區(qū)RSV 流行模式不盡相同，故了解一個地區(qū)的RSV流行規(guī)律有重要意義。本研究分析了2013～2018年重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸中心住院患兒連續(xù)5 個流行季RSV 流行特征，以期為后續(xù)RSV分子流行病學(xué)研究提供線索。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究回顧性分析了2 066 例2013 年6 月至2018 年5 月于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸中心住院，且已完善鼻咽抽吸物16 種常見呼吸道病毒檢測患兒的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合急性下呼吸道感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；（2）年齡小于2 歲。排除嚴(yán)重心肺疾病、使用免疫抑制劑及患免疫缺陷病、病例資料不全的患兒。

本研究已通過我院倫理委員會審查[審查編號：（2015）年倫審（研）第（77-1）號]。

1.2 樣本收集及處理

由?？谱o(hù)士于患兒入院后24 h 內(nèi)采集患兒鼻咽抽吸物標(biāo)本。每管鼻咽抽吸物中加入病毒保護(hù)液2 mL，置于-80℃冰箱備用。

1.3 核酸提取及cDNA 合成

利用核酸提取試劑盒（Qiagen，貨號：57704）提取鼻咽抽吸物標(biāo)本中的病毒核酸，采用SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase System（Invitrogen，貨號：18080-044）試劑盒合成cDNA，操作均嚴(yán)格按說明書執(zhí)行。

1.4 呼吸道常見病毒的檢測及分型

根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]采用多重PCR 分兩輪檢測鼻咽抽吸物中常見的呼吸道病毒，包括RSV A 和B 型，流感病毒（IFV）A、B和C型，副流感病毒（PIV）1、2、3 和4 型，人冠狀病毒（HCoV）229E 和OC43，人偏肺病毒（HMPV），人鼻病毒（HRV）A、B和C 型，人博卡病毒（HBoV），腺病毒（ADV），以及人腸道病毒（HEV）。

1.5 資料收集

利用臨床信息登記表收集患兒年齡、性別、現(xiàn)病史、家族史、輔助檢查、診斷等臨床資料。本研究中所有臨床疾病（包括肺炎、毛細(xì)支氣管炎、支氣管炎）的診斷標(biāo)準(zhǔn)均依據(jù)《諸福棠實用兒科學(xué)》第8 版[5]。重癥下呼吸道感染（包括重癥肺炎及重癥毛細(xì)支氣管炎）判斷標(biāo)準(zhǔn)[8]為出現(xiàn)以下任何一種情況：（1）一般情況差；（2）有意識障礙；（3）低氧血癥表現(xiàn)：紫紺、呼吸增快（嬰兒呼吸頻率≥70 次/mim，1 歲以上患兒呼吸頻率≥50次/min）、有輔助呼吸（呻吟、鼻扇、三凹征）、間歇性呼吸暫?；蜓躏柡投龋?2%；（4）發(fā)熱：超高熱或持續(xù)高熱超過5 d ；（5）有脫水征或拒食 ；（6）胸片或胸部CT 提示≥2/3 一側(cè)肺浸潤、多葉肺浸潤、胸腔積液、氣胸、肺不張、肺壞死或肺膿腫；（7）有肺外并發(fā)癥。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布的計量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s,）描述，組間比較采用成組t檢驗；偏態(tài)分布計量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用秩和檢驗（2 組間用Mann-WhitneyU檢驗，3 組間用Kruskal-WallisH檢驗）。計數(shù)資料采用例數(shù)和構(gòu)成比（%）描述，組間比較使用卡方檢驗或Fisher 確切概率檢驗；多個樣本的多重比較采用χ2分割法，調(diào)整后的檢驗水準(zhǔn)α'=0.0083。其他組間比較P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料及病毒檢出情況

本研究共收集2013 年6 月至2018 年5 月期間2 歲以內(nèi)急性下呼吸道感染住院患兒鼻咽抽吸物標(biāo)本2 066 份，病毒檢出陽性1 595 份（77.20%）。其中RSV 檢出率最高，檢出826 份（39.98%）；其次為HRV，檢出521 份（25.22%）。其余病毒檢出情況如下：PIV 401 份（19.41%），HBoV 140份（6.78%），IFV 74 份（3.58%），HMPV 54 份（2.61%），HCoV 34份（1.65%），HEV 19份（0.92%）。

RSV 幾乎在全年均可檢出，其中冬季檢出率最高。2013～2014 年、2014～2015 年、2016～2017年、2017～2018 年4 個年度RSV 流行亞型分別以RSV-B、RSV-A、RSV-B、RSV-A 為主導(dǎo)，而2015～2016 年為RSV-A 和RSV-B 共同流行。見圖1。

圖1 2013～2018 年各季度RSV-A 與RSV-B 亞型分布 春季指3～5 月份；夏季指6～8 月份；秋季指9～11 月份；冬季指12 月份至次年2 月份。

2.2 RSV 檢出陽性患兒一般臨床資料

826 例RSV 檢 出陽性樣本中，RSV-A 陽性410 份（49.6%），RSV-B 陽性414 份（50.1%），RSV-A 與RSV-B 均陽性2 份（0.2%）。RSV 檢出陽性患兒中，男性562 例（68.0%），女性264 例（32.0%）。中位年齡為7 個月，其中＜6 月齡396例（47.9%），6～11 月齡249 例（30.1%），12～23月齡181 例（21.9%）。中位住院時間為6 d。重癥下呼吸道感染患兒206 例（24.9%）。

2.3 RSV 合并其他病毒檢出情況

在2 066 份樣本中，混合感染檢出樣本464份（22.46%），其中2 種病毒合并檢出共403 份（19.51%）。RSV+HRV 組合最常見，檢出123 份（5.95%）。此外，RSV 合并PIV 檢出55 份，合并HBoV 23 份，合并IFV 15 份，合并ADV 4 份，合并HMPV 7 份，合并HCoV 4 份，合并HEV 9 份。3 種病毒混合檢出59 份，4 種病毒混合檢出2 份。

2.4 RSV 檢出組與其他病毒檢出組臨床特征分析

為比較各病毒病原檢出組間的臨床特征，本研究排除了所有合并細(xì)菌檢出的樣本，發(fā)現(xiàn)單一RSV 檢出298 份，RSV 混合其他病毒檢出148 份，其他病毒檢出389 份，病毒檢出陰性241 份。其他病毒檢出指除RSV 外后，IFV、PIV、HCoV、HMPV、HRV、HBoV、ADV、HEV 中 任 一 種 或多種病毒檢出陽性。與其他病毒檢出組和未檢出病毒組比較，RSV 單一檢出組月齡更小，更易發(fā)生呼吸困難、呼吸衰竭及重癥下呼吸道感染（P＜0.0083）；RSV 單一檢出組喘息比例高于未檢出病毒組（P＜0.0083），RSV 混合其他病毒組喘息比例高于其他病毒組和未檢出病毒組（P＜0.0083）。各組間性別、住院時間、早產(chǎn)史等的比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 RSV 單一、混合檢出與其他病毒檢出及未檢出病毒組臨床特征比較

2.5 RSV 單一陽性組與RSV 合并HRV 陽性組的臨床特征比較

RSV 最易合并HRV，因此本研究比較了單一RSV 檢出患兒與RSV 合并HRV 檢出患兒的臨床特征。結(jié)果顯示，RSV 合并HRV 檢出患兒更易出現(xiàn)喘息（P=0.030）。兩組患兒血白細(xì)胞計數(shù)差異雖有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.022），但均在正常范圍內(nèi)。患兒臨床表現(xiàn)、月齡、住院時間、性別構(gòu)成、早產(chǎn)史比例、濕疹史比例、喘息史比例、疾病嚴(yán)重度、血中性粒細(xì)胞比例及血小板計數(shù)等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.6 RSV-A 陽性與RSV-B 陽性患兒的臨床特征比較

在298 例RSV 單一陽性樣本中，有RSV-A 陽性151 例，RSV-B 陽性147 例。RSV-A 檢出陽性患兒中，男性比例更大（P=0.004）。兩組患兒月齡、住院時間、臨床表現(xiàn)及血常規(guī)等實驗室數(shù)據(jù)的比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表2 單一RSV 檢出組與RSV 合并HRV 檢出組患兒臨床特征比較

表3 RSV-A 陽性組與RSV-B 陽性組患兒臨床特征比較

3 討論

RSV 是引起5 歲以下兒童下呼吸道感染最主要的病毒病原體[1]。本研究中下呼吸道感染患兒RSV 檢出率為39.98%，在所檢出的病毒中，其檢出率最高，且RSV 陽性中重癥比例較其他病原體陽性患兒明顯升高，提示RSV 在嬰幼兒下呼吸道感染中的重要地位。有系統(tǒng)綜述報道RSV 在急性呼吸道感染患兒中陽性檢出率為12%～63%[9]，本組病例與之檢出率存在差異可能與納入對象的年齡、病種、病毒檢測方法及地域不同等有關(guān)。

既往文獻(xiàn)報道，在兒童中，RSV 導(dǎo)致的住院率在0～6 月齡患兒中最高，主要集中在2～3 月齡的嬰兒[10]。本研究也有類似發(fā)現(xiàn)，RSV 陽性患兒中，0～6 個月嬰兒占比最高（47.94%）。RSV 幾乎全年均可檢出，我國主要流行于10 月至次年5月[11]。本研究中RSV 在冬季檢出率最高。全球范圍內(nèi)RSV-A 和RSV-B 兩種亞型交替模式各不相同：南非2006～2012 年以“AABABA”規(guī)律流行[12]（流行規(guī)律中“A”指該年度以RSV-A 為主導(dǎo)，“B”指該年度以RSV-B 為主導(dǎo)）；比利時1996～2005年亞型流行模式由“AAB”循環(huán)模式轉(zhuǎn)變?yōu)椤癆B”交替循環(huán)[13]。中國各地區(qū)流行規(guī)律也有差異：北京地區(qū)2006～2013 年以“AABBAAB”規(guī)律流行[14]，與浙南[15]、上海[16]等地區(qū)在同一時間流行亞型基本類似，但北京地區(qū)在2013～2014 年、2015～2016年2 個流行季出現(xiàn)A、B 兩種亞型共同主導(dǎo)的情況[14]。本研究中，2013～2014 年、2014～2015 年、2016～2017 年、2017～2018 年4 個年度RSV 流行亞型分別以RSV-B、RSV-A、RSV-B、RSV-A 為主導(dǎo)，2015～2016 年為RSV-A、RSV-B 共同流行。由此可見，在同一流行季不同地區(qū)，流行亞型不盡相同，并可出現(xiàn)共同流行的情況，因此研制全球通用的RSV 疫苗時應(yīng)覆蓋A、B 兩種亞型。

RSV是引起嬰幼兒喘息最常見的病原體之一。本研究提示，與其他病毒感染患兒相比，RSV 感染患兒月齡更小，出現(xiàn)喘息癥狀可能性更大，且病情較重（呼吸困難、呼吸衰竭、重癥下呼吸道感染比例更大）。高鈺等[17]對重慶地區(qū)2 歲以下的急性下呼吸道感染門診患兒進(jìn)行臨床特征分析，也得出類似結(jié)論。陳嘉韡等[18]也報道RSV 引起的嬰幼兒急性下呼吸道感染病情更重。這可能與RSV 感染后對呼吸道上皮細(xì)胞存在損傷且持續(xù)時間較長、易合并其他病毒感染、繼發(fā)細(xì)菌感染等因素有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在RSV 合并其他病毒的檢出中，HRV 最為常見，且RSV 合并HRV 檢出組比單一RSV 檢出組更易出現(xiàn)喘息。Petrarca 等[19]報道，單一RSV 檢出患兒比RSV 合并其他病毒檢出患兒更易引起發(fā)熱，而多種病毒混合檢出并未增加患兒的疾病嚴(yán)重度及3 年內(nèi)發(fā)生反復(fù)喘息的比例。目前對這一問題仍有爭議。有學(xué)者報道，RSV 合并其他病毒感染與單一RSV 感染相比，患肺炎比例、住院率及機(jī)械通氣比例均更高[20]，而Papenburg 等[21]認(rèn)為兩者病情嚴(yán)重程度無明顯不同。

本研究發(fā)現(xiàn)RSV 2 種亞型引起的下呼吸道感染病情嚴(yán)重度無明顯差異。該問題眾說紛紜，大部分學(xué)者認(rèn)為RSV-A 引起疾病嚴(yán)重度更高[22-23]，轉(zhuǎn)入ICU 及需要輔助通氣的病人比例更高，且RSV-A 感染的細(xì)胞株和動物模型都表現(xiàn)出更高的病毒滴度和炎癥反應(yīng)[24-25]，因此認(rèn)為RSV-A 亞型是重癥感染的危險因素。另有學(xué)者則認(rèn)為RSV-B感染所致病情更重[26]，還有研究并未發(fā)現(xiàn)2 種亞型所致病情的差異[27]。出現(xiàn)結(jié)果異質(zhì)性可能原因在于影響病情嚴(yán)重度的不僅是病毒因素，宿主因素也扮演了重要角色，同時各研究的研究方法、樣本量大小、檢測方法等差異均可能導(dǎo)致結(jié)論的不同。

本研究中，RSV-A 陽性組的男性比例較RSV-B 陽性組更大，而Midulla 等[28]、張拓慧等[14]均未發(fā)現(xiàn)RSV 2 種亞型感染患兒間的性別差異。有研究報道，男性是導(dǎo)致RSV 重癥感染的危險因素之一，但相關(guān)機(jī)制尚不明確，推測可能與男性兒童氣道樹相對狹窄或性激素影響有關(guān)[29-30]。

本研究收集了重慶地區(qū)連續(xù)5 個流行季大樣本量的臨床資料，采用多重PCR 對多種呼吸道常見病毒進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)2013～2018 年重慶地區(qū)RSV-A 與RSV-B 既可分別主導(dǎo)流行，也可共同流行；RSV 是急性下呼吸道感染住院患兒最主要的病毒病原，相較于其他病毒易致重癥下呼吸道感染，合并HRV 檢出時患兒易發(fā)生喘息；RSV-A 和RSV-B 感染所致臨床表現(xiàn)無差異，但RSV-A 更易感染男性患兒，為RSV 的分子流行病學(xué)研究提供了一定線索。本研究未行病毒載量檢測及RSV 基因型分型，后續(xù)研究需進(jìn)一步完善RSV 系統(tǒng)進(jìn)化分析及病毒載量檢測，追蹤RSV 流行情況，探究RSV 分子流行病學(xué)規(guī)律及與臨床特征的關(guān)系，為疫苗研發(fā)提供思路。