嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒的臨床特征及基因分析

王美娟 鐘雪梅 馬昕 寧慧娟 朱丹 宮幼喆 金萌

（首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100020）

嬰兒膽汁淤積癥是嬰兒期最常見的肝膽疾病，國外文獻(xiàn)報道發(fā)病率約1/5 000～1/2 500[1]，其病因復(fù)雜，如診治不及時，會嚴(yán)重影響患兒生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致死亡。而部分肝內(nèi)膽汁淤積癥臨床表現(xiàn)不典型，常規(guī)檢查無特異性，臨床診斷困難。近年來隨著基因檢測技術(shù)的發(fā)展和臨床應(yīng)用，越來越多不明原因的嬰兒膽汁淤積癥得以明確診斷，國外研究表明基因檢測對嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥的診斷有重要價值[2-4]，國內(nèi)尚缺少相關(guān)的研究報道。本研究總結(jié)疑似遺傳代謝性嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒的臨床資料，并用目標(biāo)基因捕獲結(jié)合高通量測序技術(shù)對患兒進(jìn)行基因檢測，分析基因檢測結(jié)果陽性患兒的臨床表現(xiàn)及基因型特點(diǎn)，明確基因檢測在嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥診斷及遺傳咨詢中的作用，提高臨床醫(yī)師對本病的認(rèn)識，為本病的早期診斷提供經(jīng)驗(yàn)。現(xiàn)總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

分析2017 年6 月至2019 年6 月于首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院消化內(nèi)科就診的疑似遺傳代謝性嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）根據(jù)北美兒科學(xué)會推薦，當(dāng)總膽紅素（TBIL）＜85 μmol/L 時，結(jié)合膽紅素（DBIL）＞17 μmol/L；當(dāng)TBIL＞85 μmol/L 時，DBIL 所 占 比例＞20%[5]。（2）起病年齡小于1 歲。（3）入組患兒均行代謝性肝病相關(guān)基因檢測。（4）排除存在膽道閉鎖等肝外膽管病變的患兒。

本研究已獲得患兒父母知情同意，并通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（SHERLL2020014）。

1.2 臨床資料收集

臨床資料采集主要包括（1）患兒性別、起病年齡、就診年齡、出生史、靜脈營養(yǎng)史，大便顏色情況等；（2）實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果：血生化、病原學(xué)檢查等；（3）腹部超聲等。

1.3 基因檢測

經(jīng)患兒監(jiān)護(hù)人同意后，抽取患兒及其父母外周血，提取基因組DNA，制備全基因組文庫并進(jìn)行質(zhì)控。應(yīng)用GenCap 液相捕獲目標(biāo)基因技術(shù)，捕獲代謝性肝病相關(guān)基因的編碼外顯子區(qū)域，對捕獲到的區(qū)域進(jìn)行雙端測序。對測序深度、均一性、探針特異性等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。用GATK軟件對各個樣本的比對數(shù)據(jù)進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)的檢測，對單核苷酸多態(tài)性、插入突變、缺失突變等數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南對變異位點(diǎn)進(jìn)行致病性綜合評估[6]。根據(jù)需要測序的DNA 片段合成引物，用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法進(jìn)行擴(kuò)增，以Sanger 法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料以例和百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（Q1，Q3）]表示，兩組間比較采用 Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

共納入40 例患兒，其中男24 例（60%），女16 例（40%）；中位起病年齡為0.1（0.1，1.0）個月，中位就診年齡為2（2，3）個月；足月兒27 例（68%），早產(chǎn)兒13 例（32%）。40 例（100%）患兒均有黃疸；7 例（18%）出現(xiàn)白陶土色便；7 例（18%）巨細(xì)胞病毒（CMV）DNA 陽性；13 例（32%）發(fā)現(xiàn)致病基因。基因陽性組與基因陰性組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、總膽汁酸（TBA）、TBIL 及DBIL 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 13 例基因陽性患兒的臨床特點(diǎn)和基因分析

13 例患兒中，男6 例，女7 例，均有皮膚黃染；病例4 新生兒期因早產(chǎn)、低體重應(yīng)用靜脈營養(yǎng)史大于2 周；病例6 存在心臟畸形；病例13 新生兒期有腸梗阻，且大便為白陶土樣；2 例患兒CMVDNA 陽性。13 例患兒中，包括3 例SLC25A13基因突變導(dǎo)致的希特林蛋白缺乏癥，3 例JAG1基因突變導(dǎo)致的Alagille 綜合征，3 例ABCB11基因突變導(dǎo)致的進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥2 型，1 例HSD3B7基因突變導(dǎo)致的先天性膽汁酸合成障礙1型，1 例AKR1D1基因突變導(dǎo)致的先天性膽汁酸合成障礙2 型，1 例NPC1基因突變導(dǎo)致的尼曼匹克病，1 例CFTR基因突變導(dǎo)致的囊性纖維化。見表2。

表1 基因陽性組與基因陰性組臨床資料比較

表2 13 例基因陽性患兒的臨床特點(diǎn)及基因結(jié)果

續(xù)表2

病例1 檢測出SLC25A13基因存在復(fù)合雜合突變。c.852_855del(p.R284fs)，為移碼突變，該變異為零效變異，可能導(dǎo)致基因功能喪失，符合PVS1；在千人數(shù)據(jù)庫（http://www.internationalgenome.org/home）、ExAC 數(shù)據(jù)庫（http://exac.broadinstitute.org）、ESP6500 數(shù) 據(jù) 庫（http://evs.gs.washington.edu/EVS/）正常對照人群中該變異頻率極低，符合PM2；HGMD 數(shù)據(jù)庫（http://www.hgmd.cf.ac.uk）已有該位點(diǎn)的致病性報道，符合PS1。c.615+5G＞A(splicing)，為剪接突變，正常對照人群中該變異頻率極低，符合PM2；在HGMD數(shù)據(jù)庫中已有該位點(diǎn)的致病性報道，符合PS1。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，上述變異分別來自患兒父親及母親。故該復(fù)合雜合變異判定為致病性變異。見表2。

病例2 檢測出SLC25A13基因存在復(fù)合雜合突變。c.736delG(p.D246Mfs*3)，為移碼突變，該變異為零效變異，可能導(dǎo)致基因功能喪失，符合PVS1；正常對照人群中該變異頻率極低，符合PM2。IVS16ins3kb，為插入突變，在HGMD 數(shù)據(jù)庫中該變異為已知的致病性變異，符合PS1。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，上述變異分別來自患兒父親及母親。故該復(fù)合雜合變異判定為致病性變異。見表2。

病例3 檢測出SLC25A13基因存在復(fù)合雜合突變，c.1095delT(p.F365Lfs*43)，為移碼突變；該變異為零效變異，可能導(dǎo)致基因功能喪失，符合PVS1；正常對照人群中該變異頻率極低，符合PM2；HGMD 數(shù)據(jù)庫已有該位點(diǎn)的致病性報道，符合PS1。c.1064G＞A(p.R355Q)，為錯義突變，HGMD 數(shù)據(jù)庫已有該位點(diǎn)的致病性報道，符合PS1；多種生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測軟件均為有害，符合PP3。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，上述變異分別來自患兒母親及父親。故該復(fù)合雜合變異判定為致病性變異。見表2。

病例4 檢測出JAG1基因存在c.3521C＞T(p.P1174L)雜合錯義突變，在正常對照人群中該變異頻率極低，符合PM2；多種生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測軟件均為有害，符合PP3。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，患兒母親該位點(diǎn)存在雜合變異，患兒父親該位點(diǎn)無變異。該變異臨床意義未明，結(jié)合患兒臨床，考慮該變異可能致病。見表2。

病 例5 檢 測 出JAG1基 因 存 在c.2906T＞C(p.M969T) 雜合錯義突變，在正常對照人群中該變異頻率極低，符合PM2；HGMD 數(shù)據(jù)庫已有該位點(diǎn)的致病性報道，符合PS1。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，患兒母親該位點(diǎn)存在雜合變異，患兒父親該位點(diǎn)無變異。該變異判定為可能致病性變異。見表2。

病例6 檢測出JAG1基因存在c.439+1G＞A(splicing)雜合剪接突變，在正常對照人群中未見該變異，符合PM2；HGMD 數(shù)據(jù)庫已有該位點(diǎn)的致病性報道，符合PS1。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，患兒父母該位點(diǎn)均無變異，為自發(fā)突變。故判定該變異為致病性變異。見表2。

病例7 檢測出ABCB11基因有復(fù)合雜合突變。c.3334G＞T(p.W1112F)，為錯義突變，該變異位點(diǎn)位于AAA+_ATPase_domain|ABC_transporter-like|Ploop_containing_nucleoside_triphosphate_hydrolase 功能域，符合PM1；正常對照人群中未見該變異，符合PM2；多種生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測軟件為有害，符合PP3。 c.908+1G＞A(splicing)，為剪接突變，該變異為零效變異，可能導(dǎo)致基因功能喪失，符合PVS1；在正常對照人群中該變異頻率極低，符合PM2；HGMD 數(shù)據(jù)庫已有該位點(diǎn)相關(guān)報道，符合PS1。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，上述變異分別來自患兒母親及父親。故該復(fù)合雜合變異判定為致病性變異。見表2。

病例8 檢測出ABCB11基因存在2 個突變。（1）c.2594C＞T(p.A865V)，為純合錯義突變，正常對照人群中該變異頻率極低，符合PM2；多種生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測軟件為有害，符合PP3；經(jīng)家系驗(yàn)證分析，患兒父母均存在該位點(diǎn)雜合變異；故判定該變異為可能致病性變異。（2）c.667C＞T(p.R223C)，為雜合錯義突變，正常對照人群中該變異頻率極低，符合PM2；多種生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測軟件為有害，符合PP3；經(jīng)家系驗(yàn)證分析，患兒父親該位點(diǎn)存在雜合變異，患兒母親該位點(diǎn)無變異；故判定該變異為臨床意義未明。綜合分析該基因變異為可能致病性變異。見表2。

病例9 檢測出ABCB11基因存在復(fù)合雜合突變。c.2594C＞T(p.A865V)，為錯義突變，正常對照人群中該變異頻率極低，符合PM2；多種生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測軟件為有害，符合PP3。c.239T＞C(p.L80P)，為錯義突變。正常對照人群中該變異頻率極低，符合PM2；多種生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測軟件為有害，符合PP3。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，上述變異分別來自患兒母親及父親。故判定該復(fù)合雜合變異為可能致病性變異。見表2。

病例10 檢測出HSD3B7基因存在復(fù)合雜合突變。c.557C＞T(p.T186M)，為錯義突變，在正常對照人群中該變異頻率極低，符合PM2；多種生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測軟件為有害，符合PP3。c.968C＞G(p.T323R)，為錯義突變，正常對照人群中該變異頻率極低，符合PM2；多種生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測軟件為有害，符合PP3。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，上述變異分別來自患兒母親及父親。判定該復(fù)合雜合變異為可能致病性變異。見表2。

病例11 檢測出AKR1D1基因存在復(fù)合雜合突變。c.158A＞G(p.D53G)，為錯義突變，在正常對照人群中該變異頻率極低，符合PM2；多種生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測軟件為有害，符合PP3；HGMD數(shù)據(jù)庫已有該位點(diǎn)相關(guān)報道，符合PS1。c.658A＞C(p.S220R)，為錯義突變，在正常對照人群中該變異頻率極低，符合PM2；多種生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測軟件為有害，符合PP3。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，上述變異分別來自患兒母親及父親。故判定該復(fù)合雜合變異為可能致病性變異。見表2。

病例12 檢測出NPC1基因存在復(fù)合雜合突變。c.2328delT(p.T777Pfs*4)，為移碼突變，正常對照人群中該變異頻率極低，符合PM2；多種生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測軟件為有害，符合PP3。c.2230_2231del(p.V744Sfs*27)，為移碼突變，正常對照人群中該變異頻率極低，符合PM2；HGMD數(shù)據(jù)庫已有該位點(diǎn)相關(guān)報道，符合PS1。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，上述變異分別來自患兒父親及母親。故判定該復(fù)合雜合變異為致病性變異。見表2。

病例13 檢測出CFTR基因存在復(fù)合雜合突變。c.317_324del(p.I106fs)，為移碼突變，該變異為零效變異，可能導(dǎo)致基因功能喪失，符合PVS1；正常對照人群中未見該變異，符合PM2；HGMD數(shù)據(jù)庫已有該位點(diǎn)的致病性報道，符合PS1。c.1456G＞T(p.G486X)，為無義突變，該變異為零效變異，可能導(dǎo)致基因功能喪失，符合PVS1；正常對照人群中未見該變異，符合PM2；HGMD 數(shù)據(jù)庫已有該位點(diǎn)的致病性報道，符合PS1。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，上述變異分別來自患兒母親及父親；故判定該復(fù)合雜合變異為致病性變異。見表2。

3 討論

嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥病因復(fù)雜，早期診斷、早期治療可改善患兒預(yù)后。近年來，高通量測序技術(shù)因其速度快、通量高等特點(diǎn)廣泛應(yīng)用于臨床，在分子生物學(xué)研究及疾病診斷方面發(fā)揮巨大作用。Togawa 等[2]應(yīng)用二代測序技術(shù)對肝內(nèi)膽汁淤積癥嬰兒進(jìn)行基因檢測，28%患兒明確基因診斷。本研究共納入40 例疑似遺傳代謝性嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒，經(jīng)二代基因測序發(fā)現(xiàn)13 例（32%）患兒存在致病基因。13 例基因陽性患兒中1 例生后外周靜脈營養(yǎng)應(yīng)用史大于2 周，2 例CMV-DNA陽性，因此臨床上對存在長期應(yīng)用靜脈營養(yǎng)史、CMV 感染患兒不能忽略遺傳代謝性肝病。

本研究中，3 例患兒明確為SLC25A13基因突變導(dǎo)致的希特林蛋白缺乏癥。希特林蛋白缺乏癥是由SLC25A13基因突變引起的常染色體隱性遺傳病，該基因突變可導(dǎo)致位于肝細(xì)胞線粒體內(nèi)膜的Citrin 蛋白即天冬氨酸/谷氨酸載體 2 型蛋白功能缺陷，從而導(dǎo)致各種代謝紊亂[7]。本病臨床主要表現(xiàn)為肝內(nèi)膽汁淤積性黃疸、肝功能異常、低血糖、凝血功能異常、高甲胎蛋白血癥、多種氨基酸異常等[8]。本病在東亞國家發(fā)病率較高，不同種族之間SLC25A13基因突變存在明顯的遺傳異質(zhì)性[9-10]。迄今為止，已報道106 種SLC25A13基因突變位點(diǎn)，多為點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變[11]。中國患兒常見的突變?yōu)?51del4 和1638ins23 突變。本研究中3 例希特林蛋白缺乏癥患兒均為復(fù)合雜合突變，發(fā)現(xiàn)了6 種基因突變類型，其中c.736delG在HGMD 數(shù)據(jù)庫中未見報道。

本研究中3 例患兒考慮為JAG1基因突變導(dǎo)致的Alagille 綜合征。該病為常染色體顯性遺傳病，與JAG1及NOTCH2基因變異有關(guān)[12]，可有膽汁淤積、心臟雜音、角膜后胚胎環(huán)、蝶狀椎骨、特征性面容等多系統(tǒng)受累的表現(xiàn)，典型肝臟病理表現(xiàn)為小葉間膽管缺乏。經(jīng)典診斷標(biāo)準(zhǔn)需滿足3種以上主要臨床表現(xiàn)，而研究報道[13]存在JAG1基因突變的患兒可僅有1～2 個器官損害，因此基因檢測技術(shù)對本病的診斷有重要意義。本研究中3 例患兒存在JAG1基因突變，1 例患兒突變類型為c.439+1G＞A 剪接突變，該突變?yōu)樽园l(fā)突變，且患兒存在心臟畸形；另2 例患兒未見典型心臟畸形等表現(xiàn)，考慮與本病不全外顯特征有關(guān)[14-15]。

本研究中3 例患兒存在ABCB11基因突變，考慮為進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥2 型。進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥為嬰兒期或兒童期起病的常染色體隱性遺傳性疾病，根據(jù)致病基因不同分為6型。臨床特征為持續(xù)性肝內(nèi)膽汁淤積伴瘙癢，可伴有生長發(fā)育障礙，除進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥3 型（ABCB4基因缺陷）GGT 升高外，其余類型GGT 不高[16]。文獻(xiàn)報道高ALT 和高甲胎蛋白、膽結(jié)石及肝細(xì)胞癌、早期進(jìn)展為肝衰竭等預(yù)示進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥2 型可能性大[17]。本研究中2 例患兒GGT 無明顯升高，ALT 均10 倍以上升高伴甲胎蛋白升高。

以低GGT 為特征的另一種遺傳代謝性膽汁淤積性肝病為先天性膽汁酸合成障礙，其發(fā)生與膽汁酸代謝過程中酶基因缺陷有關(guān)，多為常染色體隱性遺傳，臨床罕見。本研究中2 例分別為HSD3B7基因突變導(dǎo)致的3β-羥基-C27-類固醇脫氫酶缺陷及AKR1D1基因突變導(dǎo)致的Δ4-3-氧固醇-5β-還原酶缺陷，臨床分別確診為先天性膽汁酸合成障礙1 型及2 型。2 例均為復(fù)合雜合突變，突變類型均為錯義突變。2 例患兒均為嬰兒早期出現(xiàn)黃疸，生化檢查示GGT 正常，膽汁酸水平無明顯升高。因初級膽汁酸不僅可抑制毒性代謝產(chǎn)物生成，還可促進(jìn)肝臟清除內(nèi)源性膽汁酸及毒物排出，對膽汁酸合成障礙患兒建議給予初級膽汁酸治療[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)1 例NPC1基因突變導(dǎo)致的尼曼匹克病C 型患兒，本病為臨床罕見的常染色體隱性遺傳性神經(jīng)內(nèi)臟脂質(zhì)沉積病。本例患兒新生兒期出現(xiàn)嚴(yán)重黃疸，體格檢查發(fā)現(xiàn)脾臟明顯增大，骨髓涂片可見泡沫細(xì)胞，基因檢測發(fā)現(xiàn)患兒存在NPC1基因復(fù)合雜合突變，均為移碼突變, 其中c.2328delT 突變?yōu)樾掳l(fā)現(xiàn)的突變類型。另本研究發(fā)現(xiàn)1 例CFTR基因突變導(dǎo)致的囊性纖維化患兒，本病為常染色體隱性遺傳，亞洲人罕見，臨床表現(xiàn)多樣，可表現(xiàn)為胰腺分泌功能障礙及纖維化、肝硬化、新生兒胎糞性腸梗阻、 復(fù)發(fā)性呼吸道感染等[19]。以嬰兒膽汁淤積為主要表現(xiàn)的囊性纖維化臨床罕見，有報道其與膽道閉鎖難以鑒別[20]。本患兒生后發(fā)生腸梗阻，生后1 月余出現(xiàn)黃疸，大便為白陶土樣，影像學(xué)提示膽囊充盈及收縮功能欠佳，臨床表現(xiàn)與膽道閉鎖相似，因此對有腸梗阻病史膽汁淤積患兒需警惕囊性纖維化可能。

本研究通過基因型與臨床表型的相關(guān)性研究進(jìn)一步形成較為明確的遺傳性膽汁淤積患兒的基因Panel，為后續(xù)的臨床工作明確方向，減少患兒家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥病因繁多，臨床表現(xiàn)多樣，需積極尋找引起嬰兒膽汁淤積癥的真正病因，避免漏診。