曹靜 羅佳媛 吳典 趙倩 李明霞

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院新生兒科，新疆烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)兒科學(xué)院，新疆烏魯木齊 830054）

新生兒缺氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension, HPH）是新生兒期缺氧性疾病誘發(fā)的急危重癥，早期表現(xiàn)為肺血管痙攣，擴(kuò)血管等對(duì)癥治療有效；晚期可導(dǎo)致不可逆性肺血管重塑、右心室肥厚甚至功能衰竭[1-3]，病死率高，因此延緩或扭轉(zhuǎn)肺血管重塑是該病救治成功的關(guān)鍵。成人HPH 研究發(fā)現(xiàn)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是該病的起始環(huán)節(jié)，而該細(xì)胞穩(wěn)態(tài)破壞是導(dǎo)致肺血管重塑的關(guān)鍵因素[4-5]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A, VEGF-A）是調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的重要因子，其通過(guò)保護(hù)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能抑制了肺血管重塑進(jìn)程[6-7]。生存素（survivin, SVV）是一種重要的抗凋亡蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)VEGF-A 激活蛋白激酶B/鼠雙微基因2 等信號(hào)通路上調(diào)SVV 表達(dá)，抑制了半胱氨酸蛋白酶（Caspase）的活性，阻斷了細(xì)胞凋亡，維持了細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[8-9]。而在新生兒HPH 發(fā)病機(jī)制中VEGF-A能否通過(guò)調(diào)控SVV 保護(hù)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而抑制肺血管重塑進(jìn)程不清楚。本研究通過(guò)建立HPH新生大鼠模型、腺病毒基因轉(zhuǎn)染等手段深入研究VEGF-A、SVV 在新生大鼠HPH 肺血管重塑中的作用，為阻斷或逆轉(zhuǎn)新生兒HPH 肺血管重塑提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及儀器試劑

96 只健康清潔級(jí)Wistar 新生大鼠，日齡7～10 d，體重20～30 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

BL-420S 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)由成都泰盟科技有限公司提供；Y-MS-51 氧濃度控制系統(tǒng)（主要包括氧濃度控制器和常壓低氧艙）由上海玉研科學(xué)儀器有限公司提供；攜帶和不攜帶VEGF-A基因的腺病毒載體（均標(biāo)記增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）由上海吉?jiǎng)P基因公司提供；VEGF-A 及SVV 單克隆抗體均由英國(guó)Abcam 公司提供。

1.2 新生大鼠分組及氣管內(nèi)轉(zhuǎn)染腺病毒載體

新生大鼠隨機(jī)分為HPH+VEGF-A 組、HPH組和對(duì)照組，各組根據(jù)觀察時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為3、7、10、14 d 亞組，每個(gè)亞組均為8 只大鼠。給予各組新生大鼠腹腔內(nèi)注射100 mg/kg 氯胺酮和10 mg/kg 甲苯噻嗪麻醉后，經(jīng)上門(mén)齒懸掛固定，LED 冷光源照射頸部，向左側(cè)外上方拉出舌體，充分暴露聲門(mén)，氣管導(dǎo)管插入聲門(mén)并固定，插入深度約為上門(mén)齒與喉部的體表距離；將攜帶/不攜帶VEGF-A基因的2×108PFU 腺病毒原液稀釋至0.025 mL，分別注入HPH+VEGF-A 組和HPH 組新生大鼠氣管內(nèi)，對(duì)照組氣管內(nèi)注射等量的0.9%NaCl溶液；隨后大鼠取仰臥位，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼 吸 頻 率90～100 次/min，潮 氣 量4～6 mL/kg；清醒后拔除氣管導(dǎo)管、撤離呼吸機(jī)，24 h 后建立HPH 模型。

1.3 新生大鼠HPH 模型建立

HPH+VEGF-A 組和HPH 組新生大鼠按照成年大鼠[10-11]及本課題組前期造模方法[12-13]建立HPH模型。新生大鼠連同母鼠放入常壓低氧艙，艙內(nèi)輸入氮?dú)夂脱鯕猓S持氧濃度（10.0±0.5）%，溫度22～25℃，濕度60%～70%，每天缺氧8 h，晝夜比12 : 12。對(duì)照組不給予缺氧干預(yù)，飼養(yǎng)條件如上。新生大鼠因缺氧不耐受、氣管插管及合并肺部感染等原因，共死亡14 只，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中已補(bǔ)充新生大鼠以滿足樣本量要求。

1.4 檢測(cè)新生大鼠平均右心室收縮壓

通過(guò)直接測(cè)壓法測(cè)定新生大鼠平均右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure, RVSP）代表平均肺動(dòng)脈壓力[11,14]。新生大鼠常規(guī)麻醉，取仰臥位并固定，行氣管切開(kāi)、插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，打開(kāi)胸腔，暴露心臟，4.5 號(hào)頭皮針遠(yuǎn)端連接壓力感受器及BL-420S 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，針頭刺入右心室心尖部，記錄平均RVSP。

1.5 檢測(cè)攜帶VEGF-A 的腺病毒載體在新生大鼠肺組織中的轉(zhuǎn)染情況

HPH+VEGF-A 組的不同時(shí)間亞組及對(duì)照組3 d 的新生大鼠測(cè)量平均RVSP 后處死，留取右肺中葉組織，常規(guī)制作冰凍切片，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察腺病毒標(biāo)記的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）表達(dá)情況，Image-Pro Plus 軟件分析積分光密度（IOD）與面積（Area）的比值（IOD/Area），代表EGFP的熒光強(qiáng)度，用以評(píng)價(jià)腺病毒在肺組織中的定位效果。

1.6 光學(xué)顯微鏡下觀察肺血管形態(tài)并檢測(cè)肺血管重塑指標(biāo)

各組新生大鼠測(cè)量平均RVSP 后留取左肺組織標(biāo)本，常規(guī)制作石蠟切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺小動(dòng)脈形態(tài)，利用Image-Pro Plus 軟件計(jì)算肺血管重塑指標(biāo)：肺小動(dòng)脈中層血管壁厚度（MT）占肺小動(dòng)脈外徑（ED）的百分比（MT%）和肺小動(dòng)脈中層橫截面積（MA）占總橫截面積（TAA）的百分比（MA%）。

1.7 免疫組化法檢測(cè)肺組織中VEGF-A 和SVV的表達(dá)水平

石蠟切片經(jīng)過(guò)脫蠟、脫水、修復(fù)、冷卻、沖洗后，5%羊血清室溫封閉30 min，一抗孵育（VEGF-A單克隆抗體，稀釋度1 : 1 000；SVV 單克隆抗體，稀釋度1 : 300），4℃過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，在光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像，肺血管內(nèi)皮處棕黃色顆粒為目的蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，Image-Pro Plus軟件檢測(cè)平均光密度值（IOD/Area）代表目的蛋白的表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s,）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間點(diǎn)各組新生大鼠平均RVSP 比較

缺氧3、7、10、14 d 時(shí)，HPH 組平均RVSP明顯高于同日齡對(duì)照組和HPH+VEGF-A 組（P＜0.05），表示成功建立了新生大鼠HPH 模型；缺氧3 d 時(shí)，HPH+VEGF-A 組與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；缺氧7、10、14 d 時(shí)，HPH+VEGF-A 組平均RVSP 高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組新生大鼠平均RVSP 比較 （±s,，mm Hg）

表1 各組新生大鼠平均RVSP 比較 （±s,，mm Hg）

注：[RVSP] 右心室收縮壓。a 示與對(duì)照組比較，P＜0.05；b 示與HPH 組比較，P＜0.05。

組別 n 3 d 7 d 10 d 14 d對(duì)照組 8 17.5±0.5 18.3±1.2 19.7±0.7 21.8±1.4 HPH 組 8 22.1±1.4a 23.1±0.9a 24.2±1.2a 27.2±1.1a HPH+VEGF-A 組 8 19.6±1.0b 20.2±0.7a,b 21.7±0.8a,b 24.3±1.0a,b F 值 25.41 17.73 33.22 25.22 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 攜帶VEGF-A 的腺病毒載體轉(zhuǎn)染新生大鼠肺組織的定位效果

在缺氧3、7、10 d 時(shí)，HPH+VEGF-A 組新生大鼠肺組織可觀察到EGFP 的綠色熒光，隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)熒光強(qiáng)度逐漸衰減，缺氧14 d 時(shí)僅可見(jiàn)微弱的綠色熒光；對(duì)照組3 d 時(shí)肺組織中幾乎看不到綠色熒光（圖1）。對(duì)照組3 d 及HPH+VEGF-A組各時(shí)間點(diǎn)EGFP 綠色熒光強(qiáng)度比較結(jié)果與上述情況一致，見(jiàn)表2。

圖1 攜帶VEGF-A 的腺病毒載體在新生大鼠肺組織的定位效果（激光共聚焦熒光顯微鏡，×200） 對(duì)照組3 d 時(shí)肺組織中幾乎看不到綠色熒光；HPH+VEGF-A 組在缺氧3 d 時(shí)可見(jiàn)明顯的綠色熒光，隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，肺組織內(nèi)熒光強(qiáng)度逐漸減弱，于缺氧14 d 時(shí)綠色熒光不明顯。

表2 各組新生大鼠肺組織熒光強(qiáng)度比較 （±s,）

表2 各組新生大鼠肺組織熒光強(qiáng)度比較 （±s,）

注：a 示與對(duì)照組3 d 時(shí)比較，P＜0.05；b 示與HPH+VEGF-A組3 d 時(shí) 比 較，P＜0.05；c 示 與HPH+VEGF-A 組7 d 時(shí) 比 較，P＜0.05；d 示與HPH+VEGF-A 組10 d 時(shí)比較，P＜0.05。

組別 n IOD/Area對(duì)照組3 d 8 0.005±0.002 HPH+ VEGF-A 組3 d 8 0.057±0.014a 7 d 8 0.047±0.006a 10 d 8 0.040±0.005a,b 14 d 8 0.019±0.008b,c,d F 值 19.129 P 值 ＜0.001

2.3 不同觀察時(shí)間點(diǎn)各組肺血管形態(tài)學(xué)變化

對(duì)照組肺小動(dòng)脈管壁較薄，厚度均勻，內(nèi)皮細(xì)胞排列清晰，中層平滑肌未見(jiàn)明顯增厚；HPH 組從缺氧7 d 可見(jiàn)肺小動(dòng)脈管壁增厚，局部中層平滑肌增厚，隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)有加重趨勢(shì)；HPH+VEGF-A 組從缺氧10 d 可見(jiàn)肺小動(dòng)脈管壁厚度不均勻增加，并隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)有加重趨勢(shì)。見(jiàn)圖2。

2.4 不同時(shí)間點(diǎn)各組肺血管重塑指標(biāo)MT%和MA%的變化

缺氧3 d 時(shí)，各組MT%和MA%比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；缺氧7 d 時(shí)，HPH組MT%和MA%高于對(duì)照組和HPH+VEGF-A 組（P＜0.05），HPH+VEGF-A 組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；缺氧10 d 和14 d 時(shí)，HPH 組及HPH+VEGF-A 組MT%和MA%均高于對(duì)照組（P＜0.05），該兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3～4。

2.5 不同觀察時(shí)間點(diǎn)各組肺組織VEGF-A 及SVV表達(dá)的變化

免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組VEGF-A 在肺血管內(nèi)皮部位棕色陽(yáng)性表達(dá)少，缺氧各時(shí)間點(diǎn)HPH組和HPH+VEGF-A 組VEGF-A 陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組增加，VEGF-A 蛋白表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；缺氧3 d 和7 d，HPH+VEGF-A 組肺血管內(nèi)皮部位VEGF-A 陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)于HPH 組，VEGF-A 蛋白表達(dá)量同樣高于HPH 組（P＜0.05）；缺 氧10 d 和14 d，HPH 組 與HPH+VEGF-A 組 之間VEGF-A 水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3 和表5。

缺氧3 d、7 d 和10 d，HPH 組和對(duì)照組SVV在肺血管內(nèi)皮部位棕色陽(yáng)性表達(dá)差異不明顯，SVV蛋白表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；缺氧14 d，HPH 組SVV 陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)于對(duì)照組，其蛋白表達(dá)量也高于對(duì)照組（P＜0.05）。缺氧各時(shí)間點(diǎn)HPH+VEGF-A 組SVV 在肺血管內(nèi)皮部位陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組增加，其蛋白定量結(jié)果也高于對(duì)照組（P＜0.05）；缺 氧3 d 和7 d，HPH+VEGF-A 組SVV 陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)于HPH 組，其蛋白定量結(jié)果同樣高于HPH 組（P＜0.05）；缺氧10 d 和14 d，HPH組與HPH+VEGF-A 組之間SVV 表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖4 和表6。

圖2 各組新生大鼠肺血管病理變化（蘇木精-伊紅染色，×200） 對(duì)照組新生大鼠肺小動(dòng)脈管壁薄、厚度均勻；HPH 組和HPH+VEGF-A 組新生大鼠分別從缺氧7 d、10 d 開(kāi)始可見(jiàn)肺小動(dòng)脈管壁不均勻增厚，隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)管壁增厚更明顯。箭頭指示部位為肺小動(dòng)脈。

表3 各組新生大鼠MT%比較 （±s,，%）

表3 各組新生大鼠MT%比較 （±s,，%）

注：[MT%]肺小動(dòng)脈中層血管壁厚度占肺小動(dòng)脈外徑百分比。a 示與對(duì)照組比較，P＜0.05；b 示與HPH 組比較，P＜0.05。

組別 n 3 d 7 d 10 d 14 d對(duì)照組 8 44±8 47±6 49±6 52±5 HPH 組 8 45±8 58±7a 63±5a 67±6a HPH+VEGF-A 組 8 45±6 49±7b 56±5a 62±6a F 值 0.06 5.67 12.81 13.80 P 值 0.94 0.01 ＜0.01 ＜0.01

表4 各組新生大鼠MA%比較 （±s,，%）

表4 各組新生大鼠MA%比較 （±s,，%）

注：[MA%]肺小動(dòng)脈中層橫截面積占總橫截面積百分比。a 示與對(duì)照組比較，P＜0.05；b 示與HPH 組比較，P＜0.05。

組別 n 3 d 7 d 10 d 14 d對(duì)照組 8 55±5 55±5 59±4 60±7 HPH 組 8 56±7 64±5a 69±5a 71±5a HPH+VEGF-A 組 8 53±7 58±4b 66±5a 70±5a F 值 0.43 7.32 10.65 8.69 P 值 0.66 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖3 各組新生大鼠肺組織中VEGF-A 蛋白表達(dá)（免疫組化，×200） 對(duì)照組VEGF-A 在肺血管內(nèi)皮部位陽(yáng)性表達(dá)少，缺氧各時(shí)間點(diǎn)HPH 組和HPH+VEGF-A 組VEGF-A 在肺血管內(nèi)皮部位陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組增加；缺氧3 d 和7 d，HPH+VEGF-A 組肺血管內(nèi)皮部位VEGF-A 陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)于HPH 組，缺氧10 d 和14 d，HPH 組與HPH+VEGF-A 組之間VEGF-A陽(yáng)性表達(dá)差異不明顯。箭頭所指為肺血管內(nèi)皮部位VEGF-A 陽(yáng)性表達(dá)呈棕色。

表5 各組新生大鼠肺組織中VEGF-A 表達(dá)比較 （±s,，IOD/Area）

表5 各組新生大鼠肺組織中VEGF-A 表達(dá)比較 （±s,，IOD/Area）

注：[VEGF-A]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A。a 示與對(duì)照組比較，P＜0.05；b 示與HPH 組比較，P＜0.05。

組別 n 3 d 7 d 10 d 14 d對(duì)照組 8 0.086±0.015 0.122±0.003 0.154±0.003 0.134±0.025 HPH 組 8 0.130±0.001a 0.159±0.031a 0.174±0.005a 0.180±0.020a HPH+VEGF-A 組 8 0.193±0.016a,b 0.195±0.022a,b 0.181±0.001a 0.181±0.007a F 值 53.630 11.113 55.538 17.938 P 值 ＜0.001 0.001 ＜0.001 0.001

圖4 各組新生大鼠肺組織中SVV 蛋白表達(dá)（免疫組化，×200） 缺氧14 d，HPH 組新生大鼠肺血管內(nèi)皮部位SVV 表達(dá)較對(duì)照組增加；缺氧3 d、7 d 和10 d，對(duì)照組與HPH 組SVV 陽(yáng)性表達(dá)無(wú)明顯差異。缺氧各時(shí)間點(diǎn)，HPH+VEGF-A組SVV 陽(yáng)性表達(dá)多于對(duì)照組；缺氧3 d 和7 d，HPH+VEGF-A 組SVV 陽(yáng)性表達(dá)較HPH 組增加；缺氧10 d 和14 d HPH 組和HPH+VEGF-A 組SVV 陽(yáng)性表達(dá)差異不明顯。箭頭所指為肺血管內(nèi)皮部位SVV 陽(yáng)性表達(dá)呈棕色。

表6 各組新生大鼠肺組織中SVV 表達(dá)比較 （±s,，IOD/Area）

表6 各組新生大鼠肺組織中SVV 表達(dá)比較 （±s,，IOD/Area）

注：[SVV]生存素。a 示與對(duì)照組比較，P＜0.05；b 示與HPH 組比較，P＜0.05。

組別 n 3 d 7 d 10 d 14 d對(duì)照組 8 0.161±0.027 0.148±0.052 0.141±0.052 0.151±0.025 HPH 組 8 0.156±0.029 0.160±0.042 0.185±0.031 0.210±0.034a HPH+VEGF-A 組 8 0.304±0.050a,b 0.278±0.045a,b 0.233±0.035a 0.229±0.031a F 值 26.000 15.700 6.458 8.992 P 值 ＜0.001 ＜0.001 0.013 0.004

3 討論

新生兒HPH 在新生兒期并不少見(jiàn)，隨著一氧化氮吸入等技術(shù)的應(yīng)用，提高了該病在肺血管痙攣期的救治成功率，然而在肺血管重塑期，迄今仍無(wú)有效的治療方法[3]。成人HPH 研究發(fā)現(xiàn)VEGF-A 通過(guò)保護(hù)肺血管內(nèi)皮功能抑制了HPH 肺血管重塑[6,15]，另有研究表明VEGF-A 通過(guò)調(diào)控SVV 表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞起到了保護(hù)效果[16]。本研究通過(guò)氣管內(nèi)轉(zhuǎn)染攜帶VEGF-A的腺病毒載體提高了HPH 新生大鼠肺組織中VEGF-A 的表達(dá)，上調(diào)了肺組織中SVV 的水平，降低了肺血管重塑，在該病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了保護(hù)性作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，HPH 新生大鼠肺組織中VEGF-A 水平高于對(duì)照組，且隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明VEGF-A 在新生大鼠HPH 發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮了重要作用。進(jìn)一步通過(guò)氣管內(nèi)轉(zhuǎn)染攜帶VEGF-A的腺病毒載體，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記EGFP 的腺病毒載體能夠定位到肺組織，并隨時(shí)間延長(zhǎng)綠色熒光逐漸變?nèi)酰崾鞠俨《玖恐饾u衰減。另外免疫組化結(jié)果顯示，缺氧3 d、7 d，HPH+VEGF-A 組VEGF-A 表達(dá)高于HPH 組，表明外源性VEGF-A 轉(zhuǎn)染成功。但在缺氧10 d、14 d，HPH+VEGF-A 組VEGF-A 表達(dá)與HPH 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示隨著肺組織內(nèi)腺病毒的衰減，外源性VEGF-A 也呈降低趨勢(shì)。

VEGF 是血管內(nèi)皮細(xì)胞的專(zhuān)用肽絲裂原，其家族成員VEGF-A是調(diào)節(jié)血管功能的最關(guān)鍵因子[17-18]。VEGF-A 能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的酪氨酸蛋白激酶受體結(jié)合，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞存活、新生血管形成、血管擴(kuò)張等功能。成人HPH 研究發(fā)現(xiàn)VEGF-A 可能通過(guò)保護(hù)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞阻礙了HPH 疾病進(jìn)程[15]，而應(yīng)用VEGF-A 受體阻斷劑SU5416 聯(lián)合慢性缺氧可能造成內(nèi)皮細(xì)胞存活信號(hào)喪失、凋亡增加，隨之抗凋亡細(xì)胞異常增加，血管閉塞，引發(fā)嚴(yán)重的肺血管重塑[19]。本研究發(fā)現(xiàn)在缺氧各時(shí)間點(diǎn)，HPH+VEGF-A 組平均RVSP 低于HPH 組，而自缺氧7 d 開(kāi)始高于對(duì)照組。由于機(jī)體在無(wú)右心阻塞性疾病情況下，平均RVSP 反映了平均肺動(dòng)脈壓力水平，因而該結(jié)果表明肺組織中VEGF-A高表達(dá)能夠降低HPH 新生大鼠肺動(dòng)脈壓力。由于隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)外源性VEGF-A 有衰減趨勢(shì)，故HPH+VEGF-A 組平均RVSP 高于對(duì)照組，因此有必要進(jìn)一步探討VEGF-A 的治療策略，使肺動(dòng)脈壓力接近正常水平。本研究也發(fā)現(xiàn)，雖然缺 氧10 d、14 d，HPH+VEGF-A 組VEGF-A 水 平與HPH 組比較差異不明顯，但平均RVSP 仍低于HPH 組，推測(cè)其原因可能為：在缺氧早期，肺組織中過(guò)表達(dá)的VEGF-A 通過(guò)抑制肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、擴(kuò)張肺血管等作用抑制了肺血管痙攣，降低了肺動(dòng)脈壓力，后期雖然VEGF-A 有衰減，但仍通過(guò)早期對(duì)肺血管的保護(hù)作用降低了肺動(dòng)脈壓力。此外，在肺血管重塑方面，缺氧7 d，HPH 組新生大鼠出現(xiàn)了肺血管重塑，且隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，肺血管重塑逐漸加重，而HPH+VEGF-A 組在缺氧10 d 發(fā)生肺血管重塑，且程度低于HPH 組，進(jìn)一步說(shuō)明肺組織過(guò)表達(dá)VEGF-A 可能通過(guò)在缺氧早期保護(hù)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，延緩了肺血管重塑，也因此進(jìn)一步降低了肺動(dòng)脈壓力。

SVV 是凋亡抑制蛋白家族最小的成員，在成年人正常分化的細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，但在生長(zhǎng)發(fā)育或增殖的細(xì)胞（如胚胎、腫瘤細(xì)胞等）中廣泛表達(dá)[20]。由于新生大鼠處于生長(zhǎng)發(fā)育期，因此本研究發(fā)現(xiàn)SVV 在對(duì)照組新生大鼠肺組織中有一定表達(dá)。SVV 存在于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體中，在線粒體內(nèi)/外途徑通過(guò)抑制Caspase3、7 和9 而阻斷細(xì)胞凋亡，另外SVV 作為染色體乘客復(fù)合物家族的一部分，在有絲分裂過(guò)程中起著調(diào)節(jié)染色單體分離、微管穩(wěn)定性的作用[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-A 誘導(dǎo)SVV 表達(dá)通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡及穩(wěn)定微管網(wǎng)絡(luò)而降低了化療藥物的作用，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞存活和增殖[22]。而VEGF-A 缺失則通過(guò)下調(diào)SVV 促進(jìn)凋亡因子Caspase3、Bax 等釋放，增加了化療藥物的促凋亡作用[16]。本研究在缺氧3 d、7 d 時(shí)，HPH+VEGF-A 組SVV 表達(dá)高于對(duì)照組和HPH 組，缺氧10 d 和14 d 僅高于對(duì)照組，說(shuō)明HPH 新生大鼠肺組織中VEGF-A 過(guò)表達(dá)促進(jìn)了SVV 表達(dá)升高，而隨著VEGF-A 降低，SVV 也呈下降趨勢(shì)。結(jié)合上述VEGF-A 過(guò)表達(dá)降低了肺血管重塑、肺動(dòng)脈壓力，推測(cè)在缺氧早期VEGF-A上調(diào)SVV 可能發(fā)揮了抑制血管細(xì)胞凋亡、促進(jìn)其存活、維持血管內(nèi)皮完整性的作用，從而延緩了肺血管重塑，降低了肺動(dòng)脈壓力。但隨著外源性VEGF-A 逐漸衰減，SVV 也呈降低趨勢(shì)，肺血管穩(wěn)態(tài)破壞，于缺氧10 d 肺血管重塑發(fā)生，而此時(shí)SVV 表達(dá)仍高于正常大鼠，提示在肺血管重塑期SVV 可能發(fā)揮了促血管細(xì)胞增殖的作用。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)缺氧3 d、7 d 時(shí)，HPH 組SVV 表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異，缺氧10 d 其表達(dá)呈升高趨勢(shì)，缺氧14 d 明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明缺氧誘導(dǎo)SVV 升高落后于VEGF-A，可能原因?yàn)檎Ｐ律笫筇幱谏L(zhǎng)發(fā)育階段，SVV 表達(dá)升高，但缺氧影響了新生大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育，可能干擾了SVV 的表達(dá)，因此在缺氧早期，即使VEGF-A 表達(dá)升高，也并未誘導(dǎo)SVV 上升；而進(jìn)展至肺血管重塑階段，血管細(xì)胞異常增殖，SVV 表達(dá)也隨之上升。上述VEGF-A 調(diào)控SVV 對(duì)肺血管重塑的影響仍需從細(xì)胞水平進(jìn)一步探討該途徑對(duì)肺血管細(xì)胞尤其是內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及增殖的作用。

總之，缺氧早期HPH 新生大鼠肺組織內(nèi)過(guò)表達(dá)VEGF-A 促進(jìn)了SVV 的表達(dá)，延緩了肺血管重塑進(jìn)程，降低了肺動(dòng)脈壓力，在新生大鼠HPH 發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了重要的保護(hù)作用，為新生兒HPH肺血管重塑的靶向干預(yù)提供了參考依據(jù)。