蛋白界面膜及其評價(jià)方法研究進(jìn)展

盧筠夢,趙雪,徐幸蓮

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京，210095)

市面上許多常見的加工食品都是以乳狀液形式存在的多相分散體系，分散體由分散在水相中的油滴組成，如奶油、冰淇淋、醬汁、飲料等。蛋白質(zhì)是這些加工食品中的重要組分，是食品加工過程中良好的綠色天然乳化劑。食品中的蛋白質(zhì)大多是兩親性分子，如酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、明膠、肌原纖維蛋白和豌豆蛋白等[1]，分子表面同時(shí)含有極性和非極性基團(tuán)，既能表現(xiàn)良好的水溶性又能在油相中分散，因此在合適條件下能夠吸附到水油界面，包裹乳化過程中形成的油滴，形成物理屏障，防止乳滴間絮凝和聚結(jié)發(fā)生[2]。通過這種方式在水油界面形成的吸附膜具有黏彈性，稱為蛋白界面膜(protein interfacial film, PIF)。PIF可以降低油滴表面的界面張力，抵抗一定的機(jī)械作用力，PIF中蛋白分子間的靜電斥力和由表面分子伸展引起的空間排阻效應(yīng)是維持乳液穩(wěn)定性的主要作用力[3]。因此，PIF特性與乳液的穩(wěn)定性緊密相關(guān)，良好的乳液穩(wěn)定性有利于維持產(chǎn)品的加工特性和質(zhì)地，這也使得蛋白質(zhì)界面結(jié)構(gòu)和乳狀液性質(zhì)多年來被食品膠體和界面科學(xué)領(lǐng)域廣泛關(guān)注。圖1展示了幾種食品PIF的模型示意圖。

掌握水油界面上蛋白界面膜的物化特性有助于了解蛋白大分子在水油界面的吸附規(guī)律，能夠用于評價(jià)、表征和預(yù)測蛋白乳液穩(wěn)定性，并為優(yōu)化蛋白乳化能力提供理論支持。因此，研究者們采用了多種分析方法和技術(shù)手段用以評價(jià)表征PIF。本文簡要概述了乳液PIF的形成機(jī)制以及影響其特性的內(nèi)源和外源因素，系統(tǒng)綜述了目前用于研究PIF特性的新型手段和方法，包括微觀成像技術(shù)、熱力學(xué)技術(shù)、光譜技術(shù)和界面流變技術(shù)等，為揭示乳液PIF的形成規(guī)律，解析PIF對外界因素的響應(yīng)機(jī)制提供定量和定性的分析方法，為建立PIF與乳液穩(wěn)定性關(guān)系，改善蛋白乳化產(chǎn)品品質(zhì)提供新思路。

a-不規(guī)則蜷曲狀蛋白質(zhì);b-球狀蛋白質(zhì);c-多種蛋白質(zhì)絡(luò)合; d-多層蛋白質(zhì)膜圖1 食品乳液中的蛋白質(zhì)界面膜Fig.1 Protein interfacial films in food emulsions

1 蛋白質(zhì)界面膜

1.1 PIF的形成機(jī)制

PIF的形成可分為3個(gè)階段：第1階段蛋白質(zhì)擴(kuò)散；第2階段蛋白質(zhì)在界面吸附，通過抵抗切向剪切來防止液滴膨脹破裂，此時(shí)蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，體系自由能降低；第3階段蛋白分子在界面發(fā)生結(jié)構(gòu)重排、交聯(lián)并固化成膜防止液滴絮凝，此時(shí)界面網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成，疏水基團(tuán)充分暴露，蛋白分子間相互作用增強(qiáng)[4]。

蛋白分子的典型結(jié)構(gòu)包括球狀及柔軟的無規(guī)則蜷曲狀(圖1)，吸附到水油界面后為獲得較低的體系自由能其構(gòu)象會(huì)發(fā)生明顯變化，大多數(shù)蛋白質(zhì)失去三級(jí)結(jié)構(gòu)，但保留大量二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在界面上的三維結(jié)構(gòu)和柔韌性與在溶液中大不相同。例如，許多球狀蛋白吸附到水油界面后展開，暴露出非極性和含硫氨基酸，蛋白間疏水作用增加，二硫鍵形成[5]。盡管有關(guān)蛋白質(zhì)吸附到乳液界面階段具體的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，及其對蛋白乳液穩(wěn)定性的影響尚未充分揭示，但仍有許多研究討論其中的變化規(guī)律。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)吸附到乳液界面時(shí)，受限的物理空間迫使蛋白質(zhì)呈現(xiàn)出最緊密的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通常是α螺旋或β折疊[6]。蛋白質(zhì)局部滲透進(jìn)入油相的最簡單的構(gòu)象形式是α螺旋，因此盡管部分蛋白(如牛血清蛋白)吸附到水油界面后α螺旋含量下降，但蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)仍然主要由螺旋結(jié)構(gòu)主導(dǎo)。β折疊則是蛋白質(zhì)在水油界面聚集的標(biāo)志，天然蛋白在吸附界面受氫鍵和疏水作用的誘導(dǎo)形成β折疊易于蛋白質(zhì)聚集[7]。此外，水油界面蛋白質(zhì)吸附的主要熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)力是油相中的非極性側(cè)鏈對蛋白質(zhì)疏水殘基的相似相溶[8]，蛋白質(zhì)在界面上的構(gòu)象變化受油相的極性(界面張力γ)影響，吸附在極性較低的油相表面的蛋白質(zhì)更容易發(fā)生構(gòu)象改變，如β乳球蛋白在正十四烷/水界面(γ=53 mN/m)比在橄欖油/水界面(γ=29.5 mN/m)吸附更緊密[9]，這是因?yàn)榈蜆O性油相在蛋白吸附時(shí)更易誘導(dǎo)產(chǎn)生非天然的α螺旋，引起吸附蛋白結(jié)構(gòu)重排。巰基向二硫鍵轉(zhuǎn)化有利于吸附蛋白聚集成膜，部分天然蛋白，如乳清分離蛋白和肌原纖維蛋白，巰基埋藏在分子內(nèi)部，這些蛋白經(jīng)吸附、解折疊后活性巰基暴露，蛋白分子間通過二硫鍵交聯(lián)成膜[10]。因此，含有豐富巰基的半胱氨酸殘基有利于穩(wěn)定PIF的結(jié)構(gòu)，對水油界面吸附的蛋白質(zhì)的構(gòu)象重排有顯著影響，對于沒有巰基或巰基含量較少的混合蛋白質(zhì)，則主要通過疏水相互作用和氫鍵來穩(wěn)定PIF中蛋白質(zhì)間的相互作用[11]。

1.2 影響PIF特性的因素

一般來說，PIF復(fù)雜結(jié)構(gòu)的形成是分子間引力和斥力微妙平衡的結(jié)果，包括靜電作用力、離子鍵、范德化力、氫鍵、疏水效應(yīng)和構(gòu)象熵引起的空間排阻等[12]。產(chǎn)生強(qiáng)烈排斥相互作用的PIF能更好地抑制液滴聚集，維持乳液穩(wěn)定，最主要的穩(wěn)定機(jī)制就是靜電斥力作用和空間排阻作用。靜電斥力是一種長程相互排斥作用，當(dāng)PIF包覆的液滴攜帶同種電荷時(shí)，液滴間存在靜電斥力，這種相互作用的強(qiáng)度通常隨著界面層的厚度和親水性的增加而增加[13]?？臻g排阻則是一種短程相互排斥作用，產(chǎn)生于2個(gè)鄰近液滴表面PIF的重疊，其相互作用的強(qiáng)度也隨著PIF厚度和親水性的增加而增加[14]。相比靜電斥力，空間排阻由于不易受環(huán)境干擾而更穩(wěn)定。因此，任何打破上述吸引力與斥力平衡或?qū)?種穩(wěn)定作用力產(chǎn)生影響的因素均會(huì)影響PIF特性。

影響PIF特性的內(nèi)源因素很多，包括蛋白質(zhì)的組成和種類、表面疏水性、蛋白濃度和電荷特性等。在PIF形成過程中，膜蛋白的構(gòu)象極大地受到其氨基酸殘基分布的限制。通常，蛋白中含有大比例親水性氨基酸殘基時(shí)呈現(xiàn)細(xì)長的棒狀；當(dāng)其中含有大比例疏水殘基時(shí)，蛋白分子傾向于呈現(xiàn)球狀。一旦球狀蛋白吸附到水油界面就開始解折疊暴露更多的氨基酸殘基，隨后形成橫向的蛋白間相互作用，因此球狀蛋白形成的PIF厚度較小且表面活性較高[15]。對于不同蛋白質(zhì)，形成的PIF和穩(wěn)定液滴的方式也存在細(xì)微差異，例如球狀蛋白β-乳球蛋白和α-乳白蛋白形成薄而致密的PIF，主要通過靜電斥力來穩(wěn)定乳液液滴；而酪蛋白則形成厚而分散的PIF，通過空間排阻和靜電斥力來防止乳液絮凝[3]。表面疏水性在PIF形成的第1階段影響蛋白的吸附速率。天然狀態(tài)的蛋白疏水區(qū)域大部分埋藏在分子內(nèi)部，但在PIF形成的第2、3階段，在疏水區(qū)域脫水的熵增驅(qū)動(dòng)下，蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，結(jié)構(gòu)重排使得疏水殘基盡可能地暴露在油相中。蛋白濃度對PIF的影響主要體現(xiàn)在第1階段，由濃度梯度驅(qū)動(dòng)的擴(kuò)散控制吸附動(dòng)力學(xué)可以用Ward-Tordai模型描述，如公式(1)所示。

(1)

式中：kD，擴(kuò)散速率；π，界面表面壓力(界面張力與溶液差)；c0，體相中的蛋白濃度；k，波爾茲曼常數(shù)；T，絕對溫度；D，蛋白擴(kuò)散系數(shù)。

許多研究表明,蛋白濃度越高，擴(kuò)散速率越快。當(dāng)濃度較高時(shí)，蛋白由強(qiáng)靜電斥力主導(dǎo)分子間相互作用，膜蛋白形成更致密的構(gòu)象[16]。PIF的電荷特性決定液滴間靜電作用力的強(qiáng)弱，靜電斥力強(qiáng)度隨著表面電荷數(shù)量的減少而下降，相反，具有足夠高電荷的PIF可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的靜電斥力，從而有效防止乳液中懸浮液滴的接近[17]。為方便研究電荷特性對PIF的影響，通常以“剪切平面”處的電勢(zeta potential，ζ)進(jìn)行表征，代表強(qiáng)烈吸附反離子的液滴在電場中能移動(dòng)的最遠(yuǎn)距離[18]。

外界環(huán)境，如pH、離子強(qiáng)度、溫度和冷凍條件等，也會(huì)對PIF的結(jié)構(gòu)和性能產(chǎn)生顯著影響。氨基和羧基的存在使兩親性蛋白質(zhì)在較低pH下帶正電，在較高pH下帶負(fù)電，在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)pH條件下靜電斥力和離子水化利于蛋白結(jié)構(gòu)展開及巰基的活化，易于形成PIF。當(dāng)pH接近蛋白等電點(diǎn)時(shí)，蛋白分子的展開受到抑制，蛋白溶解度降低，不利于PIF形成，并且由于蛋白之間的疏水作用達(dá)到最大，靜電斥力逐漸消失，此時(shí)蛋白質(zhì)包覆的油滴傾向于相互靠近發(fā)生絮凝，乳液容易失穩(wěn)[19]。許多蛋白類食品乳化產(chǎn)品中含有鹽離子，PIF周圍環(huán)境中離子強(qiáng)度影響靜電斥力的大小和范圍。加入鹽離子可導(dǎo)致乳清分離蛋白PIF所帶負(fù)電荷減少，靜電斥力減小[19]。當(dāng)乳液中含有較高水平鹽離子或者含有多層反離子時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生靜電屏障效應(yīng)，使水油界面上帶電膜蛋白的靜電斥力受到屏蔽[20]。食品產(chǎn)品的加工、儲(chǔ)藏過程中存在溫度波動(dòng)，熱變性溫度可誘導(dǎo)蛋白分子發(fā)生構(gòu)象變化，使最初位于蛋白內(nèi)部的非極性基團(tuán)和巰基暴露，PIF的表面疏水性增加[13]。冷凍是最常見的貯藏方式，但冷鏈技術(shù)不健全易引起貯存期間凍融循環(huán)的發(fā)生，引起乳液物理化學(xué)特性變化。反復(fù)冷凍-解凍阻礙PIF的形成，首先蛋白與油脂交聯(lián)的能力降低，減少了吸附到水油界面的有效蛋白含量。其次，已吸附的蛋白變性程度增大，使蛋白表面疏水性增強(qiáng)，促進(jìn)蛋白相互作用形成大分子蛋白，蛋白溶解度降低，乳化液微粒直徑增大，最終無法形成穩(wěn)定的PIF且乳化能力下降[21]。

綜上，在內(nèi)源因素和外界環(huán)境的共同影響下，若被PIF包覆的油滴的凈吸引力(主要是范德化力和疏水效應(yīng))大于凈排斥力(主要是靜電排斥和空間排阻)，則PIF穩(wěn)定能力下降、液滴聚集，不同油滴表面PIF上的蛋白分子就有可能發(fā)生巰基交換反應(yīng)，形成共價(jià)二硫鍵，將液滴結(jié)合在一起，乳液發(fā)生失穩(wěn)現(xiàn)象[22]。

2 PIF評價(jià)方法研究進(jìn)展

2.1 微觀成像技術(shù)

人的肉眼僅可以分辨大于100 μm的物體，然而食品中許多常用乳化劑微粒的尺寸遠(yuǎn)低于該值。各種顯微成像技術(shù)可觀察這些精細(xì)結(jié)構(gòu)，直觀地提供復(fù)雜系統(tǒng)的相關(guān)信息。最廣泛的用于PIF觀察的有光學(xué)顯微鏡(如激光掃描共聚焦顯微鏡)、電子顯微鏡(如掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡)和原子力顯微鏡等。激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope, CLSM)通過激光掃描合成界面結(jié)構(gòu)的三維立體圖像，用來確定乳液中液滴的空間位置,并獲得關(guān)于絮凝體的詳細(xì)信息[23]。電子顯微鏡的分辨率高于光學(xué)顯微鏡，透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)與光學(xué)顯微鏡原理相似，但是以電子束作光源，用電磁場作透鏡，由于電子束穿透力有限，對樣品的厚度有一定要求。掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)用細(xì)聚焦電子束在樣品表面掃描時(shí)激發(fā)出來的各種物理信號(hào)來調(diào)制成像，只能獲得關(guān)于界面表面結(jié)構(gòu)的二維圖像。原子力顯微鏡(atomic force microscopy, AFM)則具有更高的分辨率，可觀察到更微小的界面結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)聚集體的形態(tài)和大小信息，但是原子力顯微鏡成像技術(shù)要求使用脫水樣品，因此有時(shí)需要結(jié)合動(dòng)態(tài)光散射測量[24]。

李偉偉[25]用CLSM觀察到大豆蛋白形成的乳液粒徑較大，出現(xiàn)橋聯(lián)絮凝現(xiàn)象，從而推測出大豆蛋白吸附速度過慢，蛋白濃度不足以有效覆蓋液滴界面，天然大豆蛋白乳化性能不足。采用TEM觀察大豆肽在乳液中形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)由于其肽鏈分布稀疏，不易在界面上形成高強(qiáng)度的多層吸附膜結(jié)構(gòu)[25]。黃穎等[26]用TEM觀察經(jīng)加熱處理的β-乳球蛋白，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的粒徑逐漸減小，分布密集程度增加，最后呈現(xiàn)纖維化且直徑變粗，表明β-乳球蛋白發(fā)生水解，部分以β折疊結(jié)構(gòu)為主的片段在靜電排斥和疏水作用共同平衡下有序聚集，蛋白分子間相互作用增強(qiáng)，形成的PIF界面強(qiáng)度較高。通過CLSM和SEM觀察比較高壓處理對堿提取鱈魚蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)壓力由20 MPa上升至100 MPa時(shí)，被鱈魚蛋白包裹的油滴直徑顯著降低且分布更加均勻。SEM在30.0 k放大倍數(shù)下還可清晰地觀察到吸附在油滴表面的蛋白微粒[27]。利用AFM對界面吸附平衡后的蛋白膜進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白界面膜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)存在一定的交疊或聚集，結(jié)合其他表面性質(zhì)參數(shù)推斷其表面游離巰基含量較高，易形成二硫鍵導(dǎo)致PIF形成過程中界面分子間發(fā)生交聯(lián)[28]。

2.2 熱力學(xué)方法

蛋白吸附初始階段，靜電力和疏水相互作用下乳液體系釋放大量熱能，驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)繼續(xù)吸附到界面上，達(dá)到平衡狀態(tài)后，電荷中和引起的構(gòu)象變化導(dǎo)致體系從放熱轉(zhuǎn)變?yōu)槲鼰帷Ｒ虼伺c蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性相關(guān)的熱力學(xué)研究有助于揭示PIF的形成規(guī)律。其中，蛋白自然構(gòu)象(折疊態(tài))和變性構(gòu)象(展開態(tài))之間的能量躍遷，是表征蛋白空間結(jié)構(gòu)變化的直接指標(biāo)，也是研究PIF形成過程中蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵。差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)是一種廣泛采用的熱分析技術(shù)，DSC圖譜的峰值溫度Tm代表蛋白變性溫度，反映蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性;焓變H代表引起構(gòu)象變化所需的能量，是吸熱效應(yīng)(如氫鍵的破壞)和放熱效應(yīng)(如疏水相互作用的破壞)的疊加，DSC是直接測量H的唯一方法[29]。采用DSC技術(shù)測定蛋白熱變性情況，結(jié)果表明吸附至水油界面后蛋白變性峰減小或消失[30]。近年來,許多研究期望通過調(diào)控PIF形成來提升乳液穩(wěn)定性，DSC為達(dá)到上述目的提供了檢測手段。根據(jù)蔡汝瑩[31]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加入血漿蛋白、雞蛋分離蛋白、酪蛋白酸鈉可以改變肌原纖維蛋白的Tm，使蛋白內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，形成分子間疏水相互作用，促進(jìn)二硫鍵形成，增強(qiáng)蛋白分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而提高PIF強(qiáng)度。脈沖超聲也可以增強(qiáng)PIF穩(wěn)定性，DSC結(jié)果表明,肌球蛋白的Tm隨處理時(shí)間增加而降低，由于分子間疏水相互作用增加,蛋白分子內(nèi)作用力被破壞，蛋白分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，與此同時(shí),H數(shù)值在脈沖超聲處理的前6 min下降,而后在9～15 min出現(xiàn)回升，證明蛋白質(zhì)發(fā)生解折疊，分子內(nèi)疏水鍵受破壞，分子間疏水鍵形成，促進(jìn)PIF形成[32]。

2.3 光譜技術(shù)

2.3.1 色氨酸熒光光譜

熒光光譜廣泛應(yīng)用于表征蛋白結(jié)構(gòu)和蛋白相互作用，光激發(fā)固有的熒光基團(tuán)至高能狀態(tài)，然后測量樣品吸收光的發(fā)射情況。蛋白中主要的熒光基團(tuán)是色氨酸的吲哚基團(tuán)，其發(fā)射熒光強(qiáng)度對溶劑極性高度敏感，因此色氨酸光譜的變化可用來識(shí)別蛋白在水油界面上吸附時(shí)的構(gòu)象變化。當(dāng)色氨酸殘基從疏水環(huán)境移動(dòng)到親水環(huán)境時(shí)，最大發(fā)射波長發(fā)生紅移；相反色氨酸殘基由親水環(huán)境移向疏水環(huán)境時(shí)發(fā)生藍(lán)移[33]。在295 nm左右的激發(fā)波長下，埋藏在蛋白疏水核或結(jié)合在疏水溶劑中的色氨酸殘基以最大波長約335 nm發(fā)射。而蛋白變性后暴露在親水溶劑中的色氨酸發(fā)射波長紅移至355 nm左右。在普通熒光光譜中，光以90°的入射角激發(fā)樣品，但在乳液中由于大量的光被吸收或散射，發(fā)射的熒光不足以到達(dá)探測器，導(dǎo)致信號(hào)較差。為了避免這一問題，水油乳液中的研究通常采用表面色氨酸熒光光譜。入射角調(diào)整為30°～60°(不設(shè)置45°)，光穿透前10 μm，一部分反射到90°的探測器上，從而獲得良好的信號(hào)。GUO等[34]研究發(fā)現(xiàn),牛血清蛋白在魚油/水界面上的構(gòu)象變化受疏水效應(yīng)驅(qū)動(dòng)，乳液中的熒光發(fā)射光譜出現(xiàn)藍(lán)移現(xiàn)象，這是因?yàn)樯彼釟埢c電子吸收配體間形成氫鍵，蛋白中疏水區(qū)域也被重新定向到油相的疏水區(qū)域。該研究表明PIF的形成與油相的極性相關(guān)，最大發(fā)射波長的移動(dòng)程度可隨油相極性的增加而縮小。而在含10%大豆油的乳液中，大豆分離蛋白吸附到水油界面后,熒光發(fā)射最大位置發(fā)生紅移而非藍(lán)移，排除了色氨酸位于疏水區(qū)域并插入油相的可能性。此外，由于混合蛋白質(zhì)在形成PIF時(shí)發(fā)生蛋白間相互作用，因此光譜上大豆分離蛋白紅移的程度小于組成它的2種蛋白(大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白)各自紅移的距離[33]。

2.3.2 傅里葉變換紅外光譜

水油界面蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)也可以通過傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)進(jìn)行測定。光譜中的峰是化學(xué)鍵振動(dòng)吸收能量的結(jié)果，酰胺I區(qū)(1 580～1 720 cm-1)和酰胺II區(qū)(1 510～1 580 cm-1)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的表征尤為重要，而氫鍵和過渡偶極子間的耦合是調(diào)控蛋白質(zhì)酰胺帶構(gòu)象敏感性的兩大關(guān)鍵因素[35]。典型二級(jí)結(jié)構(gòu)的峰值分布如下：β折疊(1 610～1 631 cm-1)，無規(guī)則卷曲(1 638～1 648 cm-1)，α螺旋(1 649～1 660 cm-1)，β轉(zhuǎn)角(1 660～1 680 cm-1)以及β反向折疊(1 680～1 692 cm-1)。通過高斯函數(shù)可計(jì)算得到相應(yīng)的峰值面積[36]，用于表征不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的比例。FTIR適用于研究各種環(huán)境下的蛋白質(zhì)，其優(yōu)點(diǎn)在于既可觀察連續(xù)相的蛋白質(zhì)，也可觀察特定位點(diǎn)的蛋白質(zhì)，并且該技術(shù)對蛋白質(zhì)體系沒有擾動(dòng)。此外，乳液產(chǎn)生的光散射不會(huì)干擾其信號(hào)，因此FTIR被廣泛應(yīng)用于測量吸附在水油界面上蛋白質(zhì)的構(gòu)象。

FANG等[37]較早使用FTIR研究了β-乳球蛋白吸附到大豆油水油界面的構(gòu)象變化。結(jié)果表明，吸附導(dǎo)致分子內(nèi)β折疊減少，α螺旋不變，無規(guī)則卷曲增加以及分子間β折疊減少。同時(shí)，研究指出環(huán)境pH對乳液有顯著影響， pH 6.0 時(shí)乳液中蛋白較pH 7.0時(shí)更易發(fā)生變性。LEFEVRE等[38]得出相似結(jié)論，pH=6 時(shí)β-乳球蛋白無規(guī)則卷曲和分子間β折疊更多，而pH=7時(shí)α螺旋含量更高。然而在SAKUNO等[39]的研究中，乳球蛋白在二?；视?水和三酰基甘油/水界面的分子間β折疊增加，甚至只能檢測到細(xì)微的結(jié)構(gòu)變化。這些研究的差異在于FTIR在提取蛋白質(zhì)信號(hào)時(shí)需要從乳液光譜信號(hào)中分別減去水相和油相的光譜信號(hào)。由于純油相的信號(hào)與乳液中油相信號(hào)存在差異，而油相濃度又較高，導(dǎo)致最后所得的蛋白質(zhì)信號(hào)存在誤差。SCHESTKOWA等[40]改進(jìn)了FTIR的計(jì)算方法，結(jié)合熒光光譜和懸滴分析法確定了β-乳球蛋白在中鏈三?；视?水乳液的臨界界面質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%～0.31%。

2.3.3 拉曼光譜

拉曼光譜是FTIR的互補(bǔ)技術(shù)，當(dāng)分子的偶極矩隨著分子的振動(dòng)而變化時(shí)，適用FTIR進(jìn)行檢測；而當(dāng)分子的極化率隨著分子的振動(dòng)而變化時(shí)，適用拉曼光譜進(jìn)行檢測[41]。拉曼光譜最有價(jià)值的信息是酰胺I帶(1 650～1 680 cm-1)和III帶(1 240～1 300 cm-1)，前者常被用于鑒定PIF形成前后蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，后者涉及的信息包括C-N拉伸帶和肽鍵平面彎曲振動(dòng)中的N-H，這些波段的頻率主要取決于PIF形成過程中蛋白狀態(tài)、環(huán)境及分子間相互作用[42]。水油界面大豆分離蛋白的拉曼光譜顯示，隨著體系由酸性到堿性變化，酰胺I帶的信號(hào)峰值逐漸增強(qiáng)，表明pH變化引起膜蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化[43]。同時(shí)，拉曼光譜可以提供膜蛋白側(cè)鏈氨基酸的微環(huán)境，包括鏈間二硫帶、色氨酸帶、酪氨酸帶和脂肪族疏水殘基等相關(guān)三級(jí)結(jié)構(gòu)的信息。形成PIF的蛋白質(zhì)通常失去三級(jí)結(jié)構(gòu)而保留多種二級(jí)結(jié)構(gòu)，二硫鍵作為維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的重要二級(jí)鍵，其含量是表征蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的關(guān)鍵信息。500～550 cm-1的伸縮振動(dòng)來源于2個(gè)半胱氨酸形成的二硫鍵，在510、525和545 cm-1左右的峰值分別表征3種不同構(gòu)象中的二硫鍵：鄰式-鄰式-鄰式(g-g-g)、鄰式-鄰式-反式(g-g-t)和反式-鄰式-反式(t-g-t)。此外，脂肪族氨基酸殘基在2 800～3 000 cm-1的C-H伸縮振動(dòng)和1 440～1 465 cm-1的C-H彎曲振動(dòng)也可用于監(jiān)測PIF形成過程中的疏水相互作用及構(gòu)象的轉(zhuǎn)變[13]。比如，光譜在2 930和2 880 cm-1的信號(hào)強(qiáng)度比(I2 930/I2 880)可以反映蛋白吸附到油水界面后分子內(nèi)的C-H鏈偏轉(zhuǎn)/反式構(gòu)象變化，2 853和2 880 cm-1的相對信號(hào)強(qiáng)度比(I2 853/I2 880)則可以反映分子間C-H鏈相互作用[44]。研究表明，添加多糖會(huì)影響PIF的穩(wěn)定性，恰當(dāng)?shù)牡鞍?多糖比例能促進(jìn)更多的蛋白質(zhì)疏水側(cè)鏈插入油相中，有利于提高PIF包裹油滴的穩(wěn)定性[45]。

2.4 界面流變學(xué)

乳化過程不受熱力學(xué)主導(dǎo)，且由于乳化區(qū)域的面積較大，乳液穩(wěn)定性更多表現(xiàn)出動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定性，發(fā)生乳化、絮凝和聚結(jié)等失穩(wěn)現(xiàn)象。因此，從食品工業(yè)角度來看，首要目標(biāo)是提高乳液的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。評價(jià)PIF的界面流變性對表征乳液穩(wěn)定性具有關(guān)鍵意義，它研究的是乳化過程中液滴界面形變及外加應(yīng)力隨時(shí)間變化的關(guān)系，通常通過向液滴施加膨脹應(yīng)力或者剪切應(yīng)力進(jìn)行測量。在低頻率外力擾動(dòng)時(shí)，黏性流動(dòng)液體的彈性模量可忽略不計(jì)，但固體中流動(dòng)行為受到阻礙，彈性模量充分表征其力學(xué)行為。添加乳化劑后，水油界面同時(shí)表現(xiàn)出黏性和彈性特性。通過測量界面張力和彈性模量可以預(yù)測蛋白質(zhì)在水油界面的吸附過程，在蛋白質(zhì)擴(kuò)散階段界面張力和黏彈性模量保持不變；當(dāng)界面單層膜形成并發(fā)生蛋白結(jié)構(gòu)重排時(shí)，界面張力急劇下降，彈性模量急劇增加；若界面“凝膠化”并形成多層吸附的界面膜，界面張力緩慢下降(尤其是球狀PIF)，黏彈性模量緩慢增加。

膨脹流變適用于測定乳液短期穩(wěn)定性，施加外力時(shí)流體的界面面積改變，而界面形狀保持不變[46]。利用Langmuir槽法、液滴擴(kuò)張技術(shù)、界面張力弛豫等方法可研究不溶性單分子層和界面蛋白膜，針對蛋白在界面的吸附建立非牛頓流體行為模型[47]。蛋白界面膜的形成、結(jié)構(gòu)展開和重排都可通過膨脹流變學(xué)監(jiān)測。此外，剪切流變提供了更豐富的中長期穩(wěn)定性信息，在剪切變形中流體的界面形狀改變，而界面面積保持不變[47]。利用流變儀搭配磁棒、雙錐、Du Noüy環(huán)等可對蛋白的界面剪切流變性質(zhì)進(jìn)行檢測，并提供水油界面上分子間和分子內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的信息[48]。ZHU等[49]對比了乳清分離蛋白和牛血清蛋白的界面流變特性，發(fā)現(xiàn)前者的PIF表現(xiàn)出較大的膨脹黏彈性模量，這是因?yàn)槿榍宓鞍拙哂兄旅艿那驙罱Y(jié)構(gòu)，通過交聯(lián)在水油界面形成更穩(wěn)定PIF，而牛血清蛋白由于吸附量低無法形成致密的PIF。ULAGANATHAN等[50]通過滴形分析技術(shù)研究了十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate, SDS)與β-乳球蛋白的競爭性吸附作用，SDS隨著濃度的增加逐漸取代β-乳球蛋白占據(jù)界面主導(dǎo)地位。較低的SDS濃度對界面張力影響不大，但對剪切彈性和黏度有影響，因?yàn)榧羟辛髯儥z測分子間互作比檢測界面張力表現(xiàn)出更高的靈敏度。動(dòng)態(tài)流變測定還可用于研究不同蛋白的界面性質(zhì)和競爭性吸附。對于吸附可逆的蛋白質(zhì)，隨著界面上吸附蛋白先后經(jīng)歷解吸附、隨油滴膨脹重新吸附的過程，界面動(dòng)態(tài)彈性模量隨吸附時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加后略有下降的趨勢[51]。當(dāng)用肌原纖維蛋白置換雞蛋分離蛋白和血漿蛋白時(shí)，界面張力皆顯著下降且低于肌原纖維蛋白界面張力，出現(xiàn)這一結(jié)果的原因是在水油界面上肌原纖維蛋白和其他2種蛋白間發(fā)生競爭吸附，雞蛋分離蛋白和血漿蛋白在油滴表面的PIF相對堅(jiān)固，肌原纖維蛋白僅能取代少量外層吸附蛋白，在整個(gè)置換過程中雞蛋分離蛋白和血漿蛋白仍占主導(dǎo)地位[31]。PIF形成第一階段PIF的流變特性研究目前正處于快速發(fā)展的階段，界面流變技術(shù)可以提供通過其他檢測手段難以獲得的關(guān)于PIF的有效數(shù)據(jù)和信息。

3 結(jié)語與展望

PIF性質(zhì)對水油乳液的穩(wěn)定性有顯著影響，盡管研究者們對界面蛋白構(gòu)象變化及界面流變的研究已取得了一定成果，但其與乳液之間的直接關(guān)系尚未明確，仍需更多詳細(xì)、深入的研究。研究者已通過觀察外觀形貌(微觀成像技術(shù))、尋找結(jié)構(gòu)變化的間接證據(jù)(熱力學(xué)方法)、直接測量構(gòu)象變化(光譜技術(shù))、綜合研究動(dòng)態(tài)吸附過程和界面穩(wěn)定性(界面流變學(xué))，從不同角度測定并分析PIF。微觀成像技術(shù)最直觀地給出了有關(guān)界面膜微觀構(gòu)造和尺寸的信息，其中AFM的應(yīng)用為研究蛋白質(zhì)聚集體和配體提供了極大便利。熱力學(xué)方法為吸附過程中蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化提供了有效的間接證據(jù)，DSC已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究?，F(xiàn)代光譜技術(shù)的出現(xiàn)使蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)信息的獲取成為可能，F(xiàn)TIR用于觀察水油界面上的蛋白質(zhì)吸附行為，提供蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)信息，拉曼光譜補(bǔ)充了界面膜蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈的相關(guān)信息，熒光測量則能有效反映蛋白質(zhì)吸附到水油界面過程中的氨基酸環(huán)境變化。盡管現(xiàn)代光譜技術(shù)迅速發(fā)展，且因其方便快捷的特點(diǎn)而越來越受研究者歡迎，但是尚存在一定局限。例如，熒光光譜無法檢測二級(jí)結(jié)構(gòu)且制樣耗時(shí)。水相中蛋白質(zhì)的FTIR光譜容易受到極性水溶劑的干擾。拉曼光譜固有的拉曼散射可能影響光譜的分辨率，長時(shí)激光輻射產(chǎn)生的熱量也可能改變蛋白質(zhì)構(gòu)象從而影響測量精度。界面流變學(xué)的發(fā)展使蛋白質(zhì)界面性質(zhì)研究向前邁進(jìn)一大步，該技術(shù)通過結(jié)合介觀和微觀尺度上的參數(shù)信息，解決了流體-流體界面蛋白質(zhì)構(gòu)象變化及其表面流變行為的相關(guān)問題。但對于復(fù)雜PIF的動(dòng)力學(xué)問題，僅憑界面流變技術(shù)無法徹底解決，需要進(jìn)一步建立能正確描述復(fù)雜界面動(dòng)力學(xué)的模型。因此，綜合使用這些技術(shù)將形成優(yōu)勢互補(bǔ)，為PIF的定量結(jié)構(gòu)分析提供更準(zhǔn)確有效的信息。

雖然環(huán)境因素對PIF結(jié)構(gòu)影響的研究較多，但相關(guān)的乳液穩(wěn)定性調(diào)控方法及響應(yīng)機(jī)制仍有待建立。現(xiàn)有研究中，通過調(diào)控PIF的形成過程提升乳液穩(wěn)定性，通過改變蛋白構(gòu)象，增強(qiáng)蛋白柔韌性，提高蛋白乳化活性，引起水油界面中吸附蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)變化，從而提高蛋白乳化特性。常見的調(diào)控方法有超高壓處理技術(shù)、超聲處理技術(shù)、酸堿處理技術(shù)、糖基化修飾技術(shù)等。未來PIF的相關(guān)研究工作可從以下展開：第一，提高目標(biāo)乳液體系的多樣性，包括系統(tǒng)性探究不同水油比例和不同蛋白來源的乳液PIF。當(dāng)前大多數(shù)有關(guān)PIF的研究都是基于水包油的乳液體系，體系中油相比例較低而水相比例較高，探究高油相比例的PIF形成情況有利于更好理解PIF對油包水乳液穩(wěn)定性的作用機(jī)制和規(guī)律。此外，現(xiàn)有的PIF研究對象集中于水溶性蛋白，如β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、牛血清蛋白、卵清蛋白、寡聚蛋白等，而以肉源性蛋白為代表的鹽溶性蛋白形成的PIF研究則較少，相關(guān)的PIF形成機(jī)制需要進(jìn)一步明確。第二，建立適用于復(fù)雜流體的PIF分析模型。上文已證明界面流變特性對PIF表征的重要性，及其用于建立蛋白乳化液宏觀與微觀聯(lián)系的有效性。一些研究者嘗試建立數(shù)學(xué)分析模型，通過關(guān)聯(lián)PIF的黏彈性性質(zhì)、微結(jié)構(gòu)參數(shù)、組成和界面張力來預(yù)測蛋白對乳液的穩(wěn)定作用，廣泛應(yīng)用的有Young-Laplace方程、Ward-Tordai方程、一階唯象方程、梅森模型等，未來仍需建立更精確的模型用于描述復(fù)雜PIF的吸附行為和特性。第三，發(fā)展基于計(jì)算機(jī)科學(xué)和信息技術(shù)的動(dòng)態(tài)界面監(jiān)測技術(shù)。目前對PIF界面流變性能的監(jiān)測實(shí)驗(yàn)中界面相對靜止，蛋白質(zhì)可以有序吸附，而實(shí)際情況下蛋白質(zhì)吸附到水油界面形成PIF是一個(gè)動(dòng)態(tài)的乳化過程，相鄰液滴間有拉普拉斯作用力且可能存在共享相同PIF等情況。因此PIF的未來發(fā)展依賴于電子信息技術(shù)的發(fā)展、智能分析軟件的開發(fā)以及全面的動(dòng)態(tài)界面監(jiān)測設(shè)備的設(shè)計(jì)。