生態(tài)發(fā)酵技術(shù)原理與應(yīng)用

杜如冰，任聰，吳群，徐巖*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,釀造微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)研究室,江蘇 無錫,214122)

傳統(tǒng)發(fā)酵食品營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，分布在全球不同的國家和地區(qū)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球發(fā)酵食品種類多達(dá)200余種，在人類飲食結(jié)構(gòu)中扮演著重要角色。根據(jù)原料分類，可將發(fā)酵食品分為發(fā)酵酒精飲料、發(fā)酵豆制品、發(fā)酵奶制品、發(fā)酵面制品、發(fā)酵茶、發(fā)酵蔬菜和發(fā)酵肉制品(表1)。以高梁、大米、大豆、蔬菜等為原料的發(fā)酵食品多來源于以農(nóng)業(yè)為主的東方國家，例如中國的白酒、黃酒和食醋，日本的清酒和納豆以及韓國的泡菜等；以動(dòng)物乳、動(dòng)物肉等為原料的發(fā)酵食品，如干酪、火腿等多來源于以畜牧業(yè)為主的西方國家[1]。

部分傳統(tǒng)發(fā)酵食品技藝已經(jīng)傳承數(shù)千年，早期用于食品的長期保存，現(xiàn)多用于獨(dú)特風(fēng)味食品的加工。雖然發(fā)酵食品類別多、分布廣，但發(fā)酵技藝存在著相似之處：通常將環(huán)境中或者原料自身攜帶的微生物作為發(fā)酵劑，在發(fā)酵過程中，微生物群落通過降解原料中的多糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)產(chǎn)生葡萄糖、氨基酸等小分子進(jìn)而代謝產(chǎn)生醛類、醛類、酸類、酯類等豐富的風(fēng)味物質(zhì)，賦予產(chǎn)品豐富的營養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的感官特征。因此，釀造微生物(組)直接影響了發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)和質(zhì)量，但是自然接種的發(fā)酵技藝不利于食品生產(chǎn)的穩(wěn)定、安全和控制[2]。近年來，微生物組學(xué)、風(fēng)味化學(xué)、發(fā)酵工學(xué)等領(lǐng)域的研究讓人們對(duì)參與食品發(fā)酵的微生物組成、結(jié)構(gòu)、功能以及菌群過程控制有了深入的認(rèn)識(shí)，逐步解析了傳統(tǒng)發(fā)酵食品的釀造機(jī)理，為傳統(tǒng)食品發(fā)酵技術(shù)的升級(jí)革新提供了充足的理論基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，本綜述定義了一種新型的發(fā)酵技術(shù)——生態(tài)發(fā)酵技術(shù)，系統(tǒng)介紹了生態(tài)發(fā)酵技術(shù)的原理與應(yīng)用，并闡述了提出該技術(shù)的必要性和可行性，期望推動(dòng)生態(tài)技術(shù)在不同釀造系統(tǒng)中的應(yīng)用，加快傳統(tǒng)發(fā)酵食品的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型和升級(jí)。

1 傳統(tǒng)發(fā)酵食品的特征

1.1 傳統(tǒng)發(fā)酵食品技藝特征

以蒸餾酒(中國白酒和威士忌)為例(圖1)，中國白酒是典型的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，在制作過程中將高粱等原料經(jīng)蒸煮、糊化等工藝處理后，以固態(tài)形式置于窖池中進(jìn)行密閉自然發(fā)酵[3]；威士忌是典型的現(xiàn)代發(fā)酵食品，在生產(chǎn)過程中將發(fā)芽、存放、糖化后的谷類或者麥類原料搗碎，制成麥芽汁，以液態(tài)形式置于發(fā)酵罐中進(jìn)行密閉發(fā)酵[4]。傳統(tǒng)發(fā)酵食品工藝具有如下特征：

(1)傳統(tǒng)發(fā)酵多采用自然接種的發(fā)酵方式。如在白酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵微生物主要來源于“曲”和環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，參與發(fā)酵過程的63%～91%細(xì)菌和20%～39%真菌是由發(fā)酵環(huán)境中的地面和操作工具所提供[5]。而在威士忌發(fā)酵過程中則是以人工添加的純種酵母作為發(fā)酵劑，且對(duì)無菌環(huán)境要求較高。發(fā)酵過程中來源于環(huán)境的雜菌污染容易導(dǎo)致生產(chǎn)失敗[6]。

圖1 中國白酒發(fā)酵傳統(tǒng)工藝與威士忌發(fā)酵工藝的比較Fig.1 Comparison of Baijiu and Whisky fermentation technology

(2)傳統(tǒng)食品發(fā)酵屬于多菌種混合發(fā)酵體系(表1)。如在白酒發(fā)酵過程中，可以檢測到豐富的霉菌(Aspergillus、Mucor、Rhizopus和Rhizomucor等)、酵母菌(Saccharomyces、Candida、Issatchenkia、Pichia、Zygosomyces和Schizosaccharomyces等)和細(xì)菌(Lactobacillus、Pediococcus、Weissella以及Bacillus等)[7]，在上述多種微生物共同作用下完成邊糖化邊發(fā)酵的發(fā)酵過程。而威士忌則是在發(fā)酵前完成糖化，由單種或多種純種酵母菌完成。

(3)傳統(tǒng)發(fā)酵食品品質(zhì)控制為終端控制，即僅能對(duì)最終的產(chǎn)品進(jìn)行測評(píng)。如在白酒發(fā)酵過程中，原料入池后無法對(duì)發(fā)酵過程中的參數(shù)以及參與發(fā)酵的微生物進(jìn)行實(shí)時(shí)調(diào)控，控制產(chǎn)品品質(zhì)。

與現(xiàn)代發(fā)酵的威士忌相比，中國白酒由于復(fù)雜的發(fā)酵工藝和發(fā)酵菌群使產(chǎn)品呈現(xiàn)出更豐富的風(fēng)味、更高的營養(yǎng)和更好的口感。同時(shí)，發(fā)酵系統(tǒng)與自然環(huán)境的長時(shí)間交互形成了獨(dú)特的發(fā)酵食品微生態(tài)，蘊(yùn)含著基于釀造環(huán)境、生產(chǎn)原料與微生物之間相互作用的復(fù)雜釀造機(jī)制。

1.2 傳統(tǒng)發(fā)酵工藝亟需技術(shù)革新

目前，由于基于純種微生物的發(fā)酵過程對(duì)環(huán)境依賴性較小、生產(chǎn)周期較短、操作方式簡單，在工業(yè)生產(chǎn)上已實(shí)現(xiàn)機(jī)械化、自動(dòng)化和智能化，大大提高了生產(chǎn)效率，例如威士忌。而基于自然接種的發(fā)酵過程周期長、微生物組成復(fù)雜、環(huán)境依賴性較強(qiáng)，阻礙了生產(chǎn)效率的提高?，F(xiàn)在有些自然發(fā)酵食品已嘗試使用純種微生物接種方式取代自然接種，例如日本醬油，將傳統(tǒng)自然接種的制曲工藝改為人工接種，提高了生產(chǎn)的可控性。雖然我國發(fā)酵食品領(lǐng)域也對(duì)自然接種的發(fā)酵工藝進(jìn)行革新例如麩曲白酒生產(chǎn)，但是由于不同發(fā)酵產(chǎn)品涉及不同的制作工藝和復(fù)雜的微生物群體，目前大多數(shù)傳統(tǒng)發(fā)酵食品產(chǎn)業(yè)依然沿襲粗放的傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)式操作模式進(jìn)行生產(chǎn)，使得傳統(tǒng)發(fā)酵食品行業(yè)的產(chǎn)品生產(chǎn)穩(wěn)定性問題始終沒有很好地解決。

通過選育源于自然發(fā)酵劑的功能微生物，直接代替自然發(fā)酵劑并不能保證產(chǎn)品質(zhì)量，同時(shí)需要考慮釀造環(huán)境微生物對(duì)發(fā)酵過程的影響。以中國白酒為例，目前通過擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模是提高生產(chǎn)效率的主要方式，但實(shí)踐證明在使用相同發(fā)酵劑的條件下，由于新老廠區(qū)環(huán)境微生物的不同，新廠區(qū)的出酒率以及產(chǎn)品品質(zhì)明顯低于老產(chǎn)區(qū)[8]。因此，提高新產(chǎn)區(qū)產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)率需要長時(shí)間馴化和篩選特定的環(huán)境微生物，例如源于地面、操作工具[5]或窖泥等環(huán)境的微生物。

由于開放式的操作工藝，產(chǎn)品存在潛在的食品安全隱患。如普洱茶發(fā)酵過程中，環(huán)境中某些真菌的富集可能造成真菌毒素的污染[9]；在白酒發(fā)酵過程中同樣存在真菌毒素的污染隱患，研究顯示大曲制作過程中自然接種上的青霉屬、曲霉屬等部分微生物存在真菌毒素代謝能力，可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品中真菌毒素的積累[10]。這些由微生物引起的安全隱患造成了生產(chǎn)過程控制成本增加。因此，以發(fā)酵微生物組為核心的發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新是未來傳統(tǒng)釀造食品產(chǎn)業(yè)升級(jí)的必然趨勢。

2 生態(tài)發(fā)酵技術(shù)

2.1 生態(tài)發(fā)酵技術(shù)的定義

基于自然接種的發(fā)酵過程一般難以人為控制接種微生物種類，近年來傳統(tǒng)發(fā)酵微生物生態(tài)學(xué)與微生物組學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，傳統(tǒng)發(fā)酵科學(xué)機(jī)理得以解析，更多的釀造功能微生物被分離培養(yǎng)，為克服自然接種的局限性，理性構(gòu)建新一代多菌種發(fā)酵技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。生態(tài)發(fā)酵技術(shù)指運(yùn)用微生物生態(tài)學(xué)和微生物組學(xué)原理，通過優(yōu)化發(fā)酵工藝，對(duì)以最優(yōu)配比純種微生物復(fù)合菌劑接種并對(duì)發(fā)酵菌群進(jìn)行演替定向控制的發(fā)酵過程控制技術(shù)，實(shí)現(xiàn)微生物群落各功能種群協(xié)同生長與代謝，以較高效率生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)品。上述定義為狹義的生態(tài)發(fā)酵技術(shù)，強(qiáng)調(diào)了復(fù)合菌劑在生產(chǎn)中的應(yīng)用。生態(tài)發(fā)酵技術(shù)的外延還包括：①自然接種的傳統(tǒng)發(fā)酵體系釀造微生物群落的解構(gòu)；②發(fā)酵微生物菌群的重構(gòu)。因此，生態(tài)發(fā)酵技術(shù)體系包括了上游

的釀造微生物菌群解構(gòu)技術(shù)、中游的核心釀造微生物菌群重組技術(shù)和下游的發(fā)酵過程控制技術(shù)。需要特別指出，生態(tài)發(fā)酵技術(shù)與以往研究中多菌種發(fā)酵技術(shù)的重要區(qū)別在于生態(tài)發(fā)酵技術(shù)強(qiáng)調(diào)了對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵體系機(jī)理的解析，以更為理性的方式重構(gòu)復(fù)合多菌種菌劑，在發(fā)酵過程中進(jìn)行發(fā)酵參數(shù)檢測和控制，所生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)不低于傳統(tǒng)自然接種發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)。

基于合成微生物組的生態(tài)發(fā)酵技術(shù)可在一定程度上減少對(duì)原始環(huán)境微生物富集過程的依賴性，生產(chǎn)過程穩(wěn)定性較高；相對(duì)于開放式的傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)，生態(tài)發(fā)酵技術(shù)中參與發(fā)酵過程的微生物均需要進(jìn)行安全指標(biāo)測試，保證產(chǎn)品安全。同時(shí)，高底物分解能力、高風(fēng)味代謝能力菌株的組合可以提高發(fā)酵性能。因此，基于合成微生物組的生態(tài)發(fā)酵技術(shù)具有高穩(wěn)定性、高安全性和高效率的特點(diǎn)。

2.2 生態(tài)發(fā)酵體系的核心技術(shù)體系

生態(tài)發(fā)酵技術(shù)體系包括了上游的釀造微生物群落解構(gòu)技術(shù)、中游的核心功能微生物菌群重組技術(shù)和下游的發(fā)酵過程控制技術(shù)(圖2)。

圖2 生態(tài)發(fā)酵技術(shù)原理Fig.2 Principle of ecological fermentation technology

(1)上游技術(shù)

上游技術(shù)的主要目的在于傳統(tǒng)發(fā)酵體系中微生物菌群解構(gòu)(組成、結(jié)構(gòu)、功能)，菌種的安全、發(fā)酵性能的評(píng)價(jià)。同時(shí)分離獲取菌種，構(gòu)建核心功能微生物菌種數(shù)據(jù)庫，為中游核心功能微生物菌群的重構(gòu)提供組裝依據(jù)和菌種。

近年來，研究人員對(duì)食品發(fā)酵微生物菌群的組成及演替規(guī)律進(jìn)行了大量研究。研究發(fā)現(xiàn)參與發(fā)酵過程的微生物組成較為復(fù)雜。如在清香型白酒發(fā)酵中，有722個(gè)細(xì)菌物種分類單元(operational taxonomic units，OTUs)和1 504個(gè)真菌OTUs參與發(fā)酵，通過物種信息注釋，他們屬于包括Lactobacillus、Weissella、Lactococcus屬在內(nèi)的49個(gè)細(xì)菌屬和Saccharomyces、Candida、Schizosaccharomyces在內(nèi)的34個(gè)真菌屬[26]；在蝦醬發(fā)酵中，研究人員發(fā)現(xiàn)有3 593個(gè)OTUs參與，平均每個(gè)樣本中能檢測到多達(dá)513個(gè)OTUs[27]。雖然參與發(fā)酵的微生物組成復(fù)雜，但在發(fā)酵過程中微生物菌群存在一定的演替規(guī)律，例如在清香型白酒發(fā)酵過程細(xì)菌屬中，發(fā)酵起始微生物是以Pseudomonas和Bacillus為主，隨著發(fā)酵時(shí)間的推移，Lactobacillus逐步演變?yōu)榻^對(duì)優(yōu)勢微生物(相對(duì)豐度>80%)；真菌屬中Pichia是整個(gè)發(fā)酵過程的優(yōu)勢微生物(平均豐度>10%)，其次是Geotrichum、Saccharomyces等酵母[26]。相似的現(xiàn)象同樣也在其他香型白酒中發(fā)現(xiàn)，芝麻香型白酒發(fā)酵過程中發(fā)酵起始細(xì)菌屬以Bacillus、Staphylococcus等非乳桿菌屬為優(yōu)勢微生物，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，Lactobacillus成為絕對(duì)優(yōu)勢微生物(相對(duì)豐度>80%)；真菌屬Pichia、Saccharomyces是整個(gè)發(fā)酵過程中的優(yōu)勢微生物[28]。在特定釀造環(huán)境下微生物菌群的演替規(guī)律穩(wěn)定性是發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定的保證，同時(shí)也表明存在潛在的功能微生物組成以及動(dòng)力學(xué)演替規(guī)律，這種規(guī)律為使用合成微生物組代替自然菌群提供一種可能。

在菌種功能研究中，科研人員在不同的發(fā)酵系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了大量的功能菌種或菌群并得到純培養(yǎng)物。在食醋發(fā)酵體系中，乙偶姻是食醋產(chǎn)品的重要風(fēng)味成分，LU等人[29]發(fā)現(xiàn),Acetobacterpasteurianus和4種Lactobacillus(L.buchneri，L.reuteri，L.fermentum和L.brevis)是乙偶姻合成的功能微生物群。在白酒釀造中，氨基甲酸乙酯是2A類致癌物，對(duì)人體存在潛在的致癌性和毒性，廣泛存在于酒、醋、醬油和干酪等發(fā)酵產(chǎn)品中。CUI等[30]在白酒發(fā)酵酒醅中篩選出具有氨基甲酸乙酯及其前體尿素降解能力的LysinibacillussphaericusMT33，該菌株可代謝產(chǎn)生940 U/L的氨基甲酸乙酯水解酶和1 580 U/L的脲酶。同時(shí)，相關(guān)工作人員在研究過程中積累了多種可代謝產(chǎn)生關(guān)鍵風(fēng)味化合物的功能微生物菌種(菌群)，例如，萜烯類化合物產(chǎn)生菌(Saccharomycescerevisiae)、對(duì)甲酚產(chǎn)生菌群(Clostridiumbutyricum，Clostridiumtyrobutyricum，Clostridiumaminovalericum和Eubacteriumcontortum)、己酸產(chǎn)生菌(ClostridiumkluyveriN6)、地衣素產(chǎn)生菌(BacilluslicheniformisATCC 14580)、四甲基吡嗪產(chǎn)生菌(BacillussubtilisCCTCC M 208157)、蛋白酶產(chǎn)菌(AspergillushennebergiiHX08)、硫化物產(chǎn)生菌群(SaccharomycescerevisiaeJZ109，LactobacillusbuchneriJZ-JN-2017)、產(chǎn)醬香芽孢桿菌(BacilluslicheniformisMT6，BacilluslicheniformisMT15)、Surfactin產(chǎn)生菌(BacillusamyloliquefaciensMT45)、土味素控制菌群(Bacillussubtilis2-16，Bacillusamyloliquefaciens1-45)等。功能微生物的鑒定和挖掘?yàn)橹杏渭夹g(shù)合成微生物組提供可選擇的菌種。風(fēng)味化學(xué)研究中，不同特征的風(fēng)味成分不斷被鑒定，近期研究發(fā)現(xiàn)醬香型白酒中的咸菜味香氣是由8種不同化合物形成[31]，然而各種物質(zhì)的形成機(jī)制以及相對(duì)應(yīng)的功能微生物尚不清晰。因此，需要進(jìn)一步完善功能微生物的數(shù)據(jù)庫。

(2)中游技術(shù)

中游技術(shù)旨在基于功能微生物構(gòu)建合成微生物菌群，篩選出最優(yōu)配比的純種微生物復(fù)合菌劑，包括設(shè)計(jì)、組裝、優(yōu)化和測試4個(gè)模塊。

目前，研究人員已在部分自然發(fā)酵食品體系嘗試?yán)煤铣晌⑸锝M代替自然發(fā)酵菌群，對(duì)促進(jìn)傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)流程的簡化，提高生產(chǎn)機(jī)械化程度具有積極的作用。中國白酒通常采用大曲、小曲或麩曲作為發(fā)酵劑，經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵、固態(tài)蒸餾、儲(chǔ)存勾兌而成。徐巖等[32]建立了以功能微生物Rhizopusoryzae，Saccharomycescerevisiae，Pichiaanomala和Issatchenkiaorientalis為基礎(chǔ)的最小功能微生物菌群作為發(fā)酵劑的小曲清香型生產(chǎn)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的機(jī)械化改造，推動(dòng)小曲清香型白酒的產(chǎn)業(yè)升級(jí)。另外，WANG等[26]選擇5種微生物作為初始發(fā)酵劑(Lactobacillusacetotolerans，Pichiakudriavzevii，Geotrichumcandidum，Candidavini和Saccharomycescerevisiae)，在不接觸環(huán)境的條件下實(shí)現(xiàn)了微生物演替規(guī)律和風(fēng)味特征的重現(xiàn)，這項(xiàng)研究結(jié)果表明合成微生物菌群可以在一定程度上減小傳統(tǒng)食品發(fā)酵對(duì)釀造環(huán)境的依賴。該推測同樣在豆醬發(fā)酵體系得到驗(yàn)證：近期，JIA等[33]選擇Aspergillusoryzae，Bacillussubtilis，Staphylococcusgallinarum，Weissellaconfusa，Zygosaccharomycesrouxii作為起始發(fā)酵劑，重現(xiàn)了原位釀造微生物菌群的功能。另外，針對(duì)西方食品發(fā)酵，研究人員也進(jìn)行了使用合成微生物群落替代自然發(fā)酵菌群的嘗試，并取得較好的效果。在奶酪發(fā)酵中，選擇參與發(fā)酵的6種高豐度微生物(Staphylococcus、Brevibacterium、Brachybacterium、Candida、Penicillium和Scopulariopsis，在超過50%的樣本中平均豐度>1%)作為起始發(fā)酵劑，成功復(fù)制了原始發(fā)酵菌群的演替規(guī)律[19]。可可豆是全球重要的發(fā)酵食品之一，ANDREW等[34]以功能組裝為原則構(gòu)建含有5種微生物的合成微生物組進(jìn)行模擬發(fā)酵(Saccharomycescerevisiae、Lactobacillusplantarum、Lactobacillusfermentum、Acetobacterpasteurianus和Acetobactertropicalis)，結(jié)果顯示該5種微生物能夠模擬可可豆原位發(fā)酵過程中微生物演替規(guī)律和化學(xué)變化[35]。以上研究表明了用合成微生物組替代自然菌群的可行性。

但是目前合成微生物組技術(shù)體系的構(gòu)建依然處于起步階段。在實(shí)際應(yīng)用階段需要考慮以下方面：目前多數(shù)發(fā)酵食品的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系是多基于風(fēng)味特征、口感、色澤等非統(tǒng)一量化的參數(shù)為依據(jù)，而在設(shè)計(jì)合成微生物組時(shí)需要提出明確的、可量化的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)作為功能定義，以此為依據(jù)設(shè)計(jì)并評(píng)價(jià)合成微生物組。因此，需要推行食品領(lǐng)域質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的精準(zhǔn)量化和標(biāo)準(zhǔn)化。雖然傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物組研究已取得較大的進(jìn)展，不同發(fā)酵食品微生物演替規(guī)律被揭示，但是依然存在包括微生物間相互作用以及高階互作在內(nèi)的關(guān)鍵風(fēng)味形成機(jī)制的研究空白，這將給合成微生物組的設(shè)計(jì)帶來困難。合成微生物組的研究并不能一蹴而就的，不能期望所設(shè)計(jì)的合成微生物組一次性達(dá)到既定的工作目標(biāo)。合成微生物組的最終應(yīng)用需要經(jīng)過設(shè)計(jì)、構(gòu)建、優(yōu)化、測試多個(gè)回合來獲取必要的釀造原理，不斷對(duì)合成微生物組進(jìn)行改造和優(yōu)化，最終形成適合應(yīng)用的合成微生物組。

(3)下游技術(shù)

下游技術(shù)是以合成微生物組為發(fā)酵劑應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，包括合成微生物組的放大培養(yǎng)以及發(fā)酵過程控制，是科研成果與實(shí)際生產(chǎn)結(jié)合的重要環(huán)節(jié)。

目前，在發(fā)酵食品生產(chǎn)過程中，存在各種形式的菌種放大和保存方式，例如純種大曲、菌粉/麩曲、菌液等。最為典型的是已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的酸奶發(fā)酵劑(一種商業(yè)菌粉)，極大地方便了酸奶的制作過程，例如在市場流行的安琪十二菌型酸奶發(fā)酵劑、川秀雙歧桿菌七菌型發(fā)酵劑以及五菌型發(fā)酵劑等。但需要注意的是，在應(yīng)用過程中不同發(fā)酵食品應(yīng)根據(jù)微生物的特性以及自身的釀造工藝采取不同的放大策略，同時(shí)要綜合考慮在放大和儲(chǔ)存中，微生物活性和功能的變化。但對(duì)于傳統(tǒng)發(fā)酵食品菌種的培養(yǎng)和放大工藝，目前尚缺少系統(tǒng)的研究，如在白酒釀造領(lǐng)域和黃酒釀造領(lǐng)域，直投式復(fù)合菌劑的技術(shù)仍然處于初步開發(fā)階段。

目前的研究表明，通過調(diào)整發(fā)酵參數(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的控制，包括原料和理化參數(shù)。食品風(fēng)味一方面由微生物代謝產(chǎn)生，另一方面由原料直接帶入。原料質(zhì)量的差異會(huì)直接影響最終產(chǎn)品的風(fēng)味，因此生產(chǎn)中對(duì)嚴(yán)格把關(guān)原料質(zhì)量是穩(wěn)定產(chǎn)品品質(zhì)的基本保證。發(fā)酵原料為發(fā)酵微生物菌群提供可利用的營養(yǎng)物質(zhì)，不同特征的原料會(huì)影響發(fā)酵過程中微生物菌群的結(jié)構(gòu)和功能[36]，最終影響產(chǎn)品的特征，例如原料中的還原糖組成[37]以及碳氮比例[38]等。理化參數(shù)在一定程度上驅(qū)動(dòng)微生物群落組裝和功能演替。以溫度為例，在酸面團(tuán)發(fā)酵時(shí)，控制發(fā)酵溫度在21 ℃可使得成熟的酸面團(tuán)完全由乳酸菌組成，在其繁殖過程中能夠抑制其他菌群的生長[39]；在干酪發(fā)酵過程中，提高干酪成熟溫度可促進(jìn)蛋白水解、脂解和氨基酸分解代謝相關(guān)基因的表達(dá)，提高干酪的成熟率[40]。除此之外，還包括發(fā)酵過程中的pH[41]、水分[19]、微生物代謝產(chǎn)物[42]、鹽度[33]等理化參數(shù)。因此，生產(chǎn)中原料的選擇以及工藝參數(shù)的控制，對(duì)維持發(fā)酵微生物群落功能的穩(wěn)定性至關(guān)重要。

生產(chǎn)參數(shù)的檢測手段也正隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步不斷被開發(fā)和優(yōu)化，并應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品行業(yè)。例如應(yīng)用無線溫度傳感器在線檢測白酒窖池發(fā)酵溫度變化、應(yīng)用低場核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)在線檢測固態(tài)發(fā)酵體系中的水分含量[43]。同時(shí)生產(chǎn)參數(shù)的數(shù)據(jù)已用于構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，推動(dòng)生產(chǎn)工藝的進(jìn)一步優(yōu)化。例如在白酒生產(chǎn)中，JIN等[44]基于生產(chǎn)參數(shù)構(gòu)建了以Han-Levenspiel方程為基礎(chǔ)的數(shù)學(xué)模型，準(zhǔn)確地預(yù)測淀粉、乳酸、乙醇的含量變化。另外，很多企業(yè)已引入智能化生產(chǎn)線，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵食品智能化和數(shù)字化生產(chǎn)，提高發(fā)酵過程控制的時(shí)效性和有效性。例如，勁牌有限公司較早的進(jìn)行機(jī)械化工藝改革，實(shí)現(xiàn)了管理信息化、過程數(shù)據(jù)化、操作自動(dòng)化[45]。今世緣酒業(yè)采用自動(dòng)化圓盤制曲系統(tǒng)、自動(dòng)化生產(chǎn)線、智能裝甑、自動(dòng)分流接酒等現(xiàn)代化生產(chǎn)工藝，實(shí)現(xiàn)了白酒的機(jī)械化和自動(dòng)化生產(chǎn)[46]。山東景芝股份有限公司將數(shù)字化釀造工藝管理系統(tǒng)應(yīng)用于濃香型白酒機(jī)械化、自動(dòng)化和智能化釀造生產(chǎn)中，實(shí)現(xiàn)對(duì)各道工序關(guān)鍵工藝參數(shù)的數(shù)字化管控，確保了白酒釀造生產(chǎn)的定量化、精細(xì)化和標(biāo)準(zhǔn)化操作[47]。

2.3 生態(tài)發(fā)酵技術(shù)的研究方法學(xué)體系

(1)微生物組學(xué)技術(shù)

隨著高通量測序、分析、統(tǒng)計(jì)學(xué)的發(fā)展，形成了包括宏組學(xué)、分析化學(xué)、分子生物學(xué)以及統(tǒng)計(jì)學(xué)在內(nèi)的微生物組學(xué)技術(shù)。傳統(tǒng)發(fā)酵食品領(lǐng)域涉及的微生物組學(xué)技術(shù)主要用于研究參與發(fā)酵過程微生物的組成、結(jié)構(gòu)和功能，服務(wù)于生態(tài)發(fā)酵上游技術(shù)。應(yīng)對(duì)復(fù)雜的發(fā)酵微生物菌群，擴(kuò)增子測序技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的微生物群落研究手段。該技術(shù)時(shí)對(duì)特定長度的PCR產(chǎn)物或者捕獲的片段進(jìn)行測序，分析序列中的變異，用于研究微生物菌群的組成和結(jié)構(gòu)。例如通常選擇16S rRNA V4、V3-V4區(qū)通用引物研究細(xì)菌菌群組成，選擇ITS 1區(qū)、ITS 2的通用引物研究真菌組成。得益于高通量、低成本的優(yōu)點(diǎn)，擴(kuò)增子測序技術(shù)已逐步取代了基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的可培養(yǎng)方法以及基于分子生物學(xué)的DGGE等方法。宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏蛋白組學(xué)主要用于在不同水平上研究微生物菌群功能分布。宏基因組(metagenome)被定義為區(qū)域內(nèi)全部微生物遺傳物質(zhì)的總和，既包括轉(zhuǎn)錄活性基因也包括非轉(zhuǎn)錄活性基因，屬于DNA水平。宏轉(zhuǎn)錄組(metatranscriptome)則是測定微生物群落宏基因組中在特定時(shí)刻下的具有轉(zhuǎn)錄活性基因的存在數(shù)量，屬于RNA水平。宏蛋白質(zhì)組(metaproteome)是測定環(huán)境樣本中全部微生物蛋白質(zhì)的總和，屬于蛋白質(zhì)水平。在應(yīng)用中，研究人員通過重構(gòu)目標(biāo)產(chǎn)物的合成或分解代謝網(wǎng)絡(luò)，基于測序結(jié)果中的物種以及功能注釋，判定相應(yīng)途徑的功能微生物，可在分子水平解析釀造機(jī)制。同時(shí)，在構(gòu)建新型化合物或未知代謝途徑化合物的代謝途徑時(shí)，同位素示蹤技術(shù)以及基因工程等均是可采用的技術(shù)手段。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析同樣也應(yīng)用于微生物功能的判定，例如應(yīng)用較多的雙向正交偏最小二乘回歸模型(bidirectional orthogonal partial least squares regression，O2PLS)、偏最小二乘回歸模型(partial least-squares regression，PLS)、斯皮爾曼相關(guān)性等。微生物組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為揭示釀造機(jī)制及挖掘功能微生物提供了強(qiáng)有力的支撐，允許研究人員針對(duì)不同科學(xué)需要、實(shí)際條件選擇可行的技術(shù)和分析方法。

(2)合成微生物組工程技術(shù)

合成微生物組工程技術(shù)包括了合成微生物組的設(shè)計(jì)、組裝、優(yōu)化和測試。特別指出，合成微生物組工程技術(shù)需要對(duì)生產(chǎn)目標(biāo)具有明確的功能定義，即設(shè)定可量化和測定的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，作為評(píng)價(jià)合成微生物組功能的依據(jù)。自上而下(top-down design)和自下而上(bottom-up design)是設(shè)計(jì)合成微生物組的常用原則。自上而下的設(shè)計(jì)原則是指通過調(diào)控環(huán)境變量，利用生態(tài)位的選擇改變現(xiàn)有微生物組組成和功能，達(dá)到設(shè)定目標(biāo)，突出了環(huán)境選擇的重要性。自下而上則是要求以功能為導(dǎo)向構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)，劃分功能模塊，并確定相應(yīng)模塊的關(guān)鍵功能物種，從而實(shí)現(xiàn)微生物組的功能組合，突出理性設(shè)計(jì)的重要性。目前，自下而上的設(shè)計(jì)策略普遍被接受和應(yīng)用。合成微生物組的組裝過程即根據(jù)設(shè)定的生產(chǎn)目標(biāo)選擇相應(yīng)的功能微生物，合成功能微生物菌群，并考慮菌群的功能魯棒性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等問題。合成微生物組的優(yōu)化過程則是在小試或者中試規(guī)模優(yōu)化微生物組合、接種量以及接種比例，基于正交試驗(yàn)響應(yīng)面分析、數(shù)學(xué)模型等統(tǒng)計(jì)工具預(yù)測最優(yōu)組合。合成微生物組的測試過程則是對(duì)預(yù)測最優(yōu)組合的合成微生物組進(jìn)行功能測定，并與事先設(shè)定的功能定義比較。

(3)菌種放大和發(fā)酵過程控制技術(shù)

菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)是發(fā)酵生產(chǎn)的第一道工序(種子制備)。工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模越大，單次發(fā)酵所需的種子就越多。因此，菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的就是要為每次發(fā)酵投料提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。純種曲制作技術(shù)、麩曲制作技術(shù)、發(fā)酵菌粉制作技術(shù)等固態(tài)形式的菌種放大技術(shù)，菌株液態(tài)培養(yǎng)技術(shù)等液態(tài)形式的菌種放大技術(shù)均是應(yīng)用于不同傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的菌種擴(kuò)大培養(yǎng)方法。其中細(xì)菌和酵母等既可以使用固態(tài)形式的菌種放大技術(shù)也可以使用液態(tài)形式的菌種放大技術(shù)。由于霉菌在液態(tài)基質(zhì)培養(yǎng)條件下的產(chǎn)酶特征不同于固態(tài)基質(zhì)，因此以產(chǎn)酶作為主要功能的霉菌需要選擇固態(tài)菌種放大技術(shù)。

發(fā)酵過程控制技術(shù)是穩(wěn)定發(fā)酵過程的基本保證。發(fā)酵過程控制技術(shù)包括發(fā)酵參數(shù)檢測技術(shù)和發(fā)酵參數(shù)控制技術(shù)，是實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵過程智能化、自動(dòng)化、機(jī)械化的基礎(chǔ)。技術(shù)核心在于學(xué)習(xí)模型的構(gòu)建(即解析發(fā)酵參數(shù)與發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的對(duì)應(yīng)關(guān)系)，通過調(diào)控發(fā)酵參數(shù)實(shí)時(shí)控制發(fā)酵過程，形成發(fā)酵參數(shù)收集、深度學(xué)習(xí)、發(fā)酵過程控制、發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用的良性循環(huán)。

3 展望：生態(tài)發(fā)酵技術(shù)未來研發(fā)方向

(1)生態(tài)發(fā)酵技術(shù)中菌種的選擇。確定功能菌種是實(shí)現(xiàn)合成微生物組發(fā)酵的關(guān)鍵因素。目前，食品發(fā)酵過程中微生物的組成研究主要依賴于擴(kuò)增子測序技術(shù)。但是由于擴(kuò)增長度的限制(<500 bp)，該方法較難實(shí)現(xiàn)種水平、株水平的微生物組成分析，僅能達(dá)到屬水平或者OTU水平，這使得無法準(zhǔn)確確定功能微生物菌種信息[48]。另外，基于PCR的測序技術(shù)存在不可避免的引物偏好性、引物覆蓋度不全的問題,這將對(duì)解析微生物組成以及后續(xù)的分析帶來誤差。不依賴PCR的鳥槍測序(宏基因組測序)能夠有效地避免了PCR過程帶來的誤差；另外，可用的三代測序延長了測序的長度，提高了物種分辨能力，是未來釀造微生物組研究的發(fā)展方向。

(2)未培養(yǎng)微生物的可培養(yǎng)化是實(shí)現(xiàn)生態(tài)發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵步驟。大部分自然界中的微生物(～99%)仍然難以培養(yǎng)，如中國白酒發(fā)酵系統(tǒng)的窖泥環(huán)境中存在大量未培養(yǎng)、功能未知的釀造功能微生物。目前，針對(duì)不可培養(yǎng)微生物對(duì)培養(yǎng)條件的嚴(yán)格依賴性，研究人員發(fā)明了5種可實(shí)現(xiàn)原位培養(yǎng)的技術(shù)：擴(kuò)散室、分離芯片(iChip)、Trap技術(shù)、I-Tip技術(shù)以及膠囊包埋技術(shù)(GMDs)。2012年，GREUB 等[49]提出可培養(yǎng)組學(xué)的概念，實(shí)現(xiàn)微生物篩選條件的多樣化、鑒定過程的高通量，解決了微生物篩選鑒定的高成本和低通量的問題。目前，運(yùn)用可培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)已基本實(shí)現(xiàn)了腸道微生物的可培養(yǎng)化[50]。將原位培養(yǎng)技術(shù)以及可培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品領(lǐng)域，有利于完善釀造食品功能微生物數(shù)據(jù)庫。

(3)發(fā)酵過程自動(dòng)化和智能化。首先，需要對(duì)發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行創(chuàng)新。目前，發(fā)酵過程中參數(shù)收集的困難阻礙了對(duì)發(fā)酵機(jī)制認(rèn)識(shí)以及實(shí)驗(yàn)中不同生產(chǎn)方案的應(yīng)用反饋。例如在白酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵容器為地下的密閉窖池，發(fā)酵過程中的理化參數(shù)收集需要以多次破壞的封閉體系為代價(jià)，多次的開窖取樣可能會(huì)對(duì)產(chǎn)品產(chǎn)生影響。使用具有發(fā)酵參數(shù)(含氧量、含水量、溫度、酸度等)采集和控制功能的集成發(fā)酵設(shè)備，可以在不破壞原有發(fā)酵狀態(tài)的前提下，快速、方便、密集地對(duì)發(fā)酵過程中各理化因子指標(biāo)的變化進(jìn)行在線跟蹤和調(diào)控，這將更有利于解析發(fā)酵機(jī)制，更有利于實(shí)時(shí)控制發(fā)酵過程，進(jìn)而指導(dǎo)如何提高產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)率。其次，需要提高產(chǎn)品生產(chǎn)的靶向性和多樣性。生態(tài)發(fā)酵技術(shù)使得傳統(tǒng)發(fā)酵擺脫環(huán)境的限制，可以在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)，如不同的合成微生物組組成、接種比例、不同的原料等。同時(shí)新型的發(fā)酵設(shè)備方便了發(fā)酵過程中參數(shù)的收集。因此，可通過整合不同方案中的發(fā)酵參數(shù)以及對(duì)應(yīng)的產(chǎn)品特征，構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，編寫以發(fā)酵參數(shù)為輸入，產(chǎn)品特征為輸出的程序，并搭建用戶界面，構(gòu)建產(chǎn)品靶向設(shè)計(jì)平臺(tái)。應(yīng)用中以可檢測、可控制的參數(shù)為基礎(chǔ)，在線模擬生產(chǎn)過程和預(yù)測產(chǎn)品特征，一方面指導(dǎo)更合理地設(shè)計(jì)生產(chǎn)方案，提高生產(chǎn)效率；另一方面可用來設(shè)計(jì)更加多樣化的產(chǎn)品，以滿足消費(fèi)者多元化的需求。