超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定陳年老茶中16種真菌毒素殘留

劉文靜，黃 彪，傅建煒*，韋 航，黃財(cái)標(biāo)

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省茶葉質(zhì)量檢測(cè)與技術(shù)推廣中心，福建 福州 350003）

中國(guó)是茶葉的生產(chǎn)、出口和消費(fèi)大國(guó)，近年來(lái)關(guān)于茶葉尤其普洱茶、茯磚茶等發(fā)酵茶中真菌毒素污染已引起消費(fèi)者的關(guān)注[1]。雖然茶葉加工過程干燥環(huán)節(jié)可能殺滅茶中的大多數(shù)微生物，但若包裝、貯藏不當(dāng)，尤其茶葉吸濕受潮之后，仍可能受到真菌侵害并產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物[2]。陳年老茶亦稱年份茶，是指存儲(chǔ)一段時(shí)間后具有保健功能的茶葉，由于其需要存儲(chǔ)過程較長(zhǎng)，存儲(chǔ)不當(dāng)將有可能導(dǎo)致茶葉發(fā)霉變質(zhì)，產(chǎn)生毒素。迄今發(fā)現(xiàn)超過400 種真菌毒素[3]，主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和伏馬毒素等，這些毒素對(duì)人體具有致畸、致癌、致突變、中毒性腎損害、肝細(xì)胞毒性、免疫抑制和生殖紊亂等慢性毒性[4-6]。有研究表明茶葉中主要污染的真菌毒素為黃曲霉毒素[7]、赭曲霉毒素[8]、伏馬毒素[9]、玉米赤霉烯酮[10]、T-2毒素[11]等。

目前，茶葉中真菌毒素的檢測(cè)方法主要包括薄層色譜法[12-13]、酶聯(lián)免疫法[14-15]、液相色譜法[9,16]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17-18]等。其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)與其他方法相比，定量更加準(zhǔn)確，選擇性和靈敏度也更高，已逐漸取代傳統(tǒng)的液相色譜方法應(yīng)用于茶葉中真菌毒素的檢測(cè)。采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已建立了茶葉的赭曲霉毒素[18-19]、黃曲霉毒素[20-21]和玉米赤霉烯酮[22-23]的檢測(cè)方法。但上述檢測(cè)方法均針對(duì)單一毒素進(jìn)行檢測(cè)，而同時(shí)檢測(cè)不同茶葉中多類、多組分真菌毒素低污染殘留的分析方法鮮見報(bào)道，一些真菌毒素如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇[11,24]、玉米赤霉烯酮[25]仍然以酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢測(cè)，由于茶葉中多酚類物質(zhì)及其他次生代謝產(chǎn)物的干擾，酶聯(lián)免疫法存在假陽(yáng)性結(jié)果，還需進(jìn)行色譜確證[5]。QuEChERS（quick, easy, cheap,effective, rugged, and safe）技術(shù)是由化學(xué)家Lehotay和Anastassiadas于2003年提出[26]，目前，根據(jù)真菌毒素和樣品基質(zhì)的理化特性，開發(fā)多真菌毒素的QuEChERS技術(shù)正逐漸成為真菌毒素研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[27]。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)茶葉中可能出現(xiàn)的16 種真菌毒素收集不同茶葉生產(chǎn)廠家的陳年老茶為研究對(duì)象，建立QuEChERS技術(shù)進(jìn)行前處理，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定陳年老茶中16 種真菌毒素的方法，以期為陳年老茶的安全衛(wèi)生分析提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陳年老茶購(gòu)自福建省各茶葉店、茶廠。烏龍茶38 份：其中2005—2010年間存儲(chǔ)茶葉樣品16 份，2011—2015年間存儲(chǔ)的樣品17 份，2016—2018年間存儲(chǔ)的樣品5 份。白茶53 份：其中1993—2010年間存儲(chǔ)茶葉樣品16 份，2011—2015年間存儲(chǔ)的樣品18 份，2016—2018年間存儲(chǔ)的樣品19 份。紅茶30 份：2004—2010年間存儲(chǔ)茶葉樣品12 份，2011—2015年間存儲(chǔ)的樣品11 份，2016—2018年間存儲(chǔ)的樣品7 份。茶葉粉碎后貯藏于馬口鐵茶葉罐中。

16 種毒素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、伏馬毒素B3、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、赭曲霉毒素A、雜色曲霉毒素、桔青毒素、雪腐鐮刀菌烯醇、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、HT-2毒素、T-2毒素，上述16 種標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自美國(guó)Romer公司。

QuEChERS提取鹽包（4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸二鈉鹽水合物）、dSPE凈化管（150 mg硫酸鎂、25 mg PSA、25 mg C18、7 mg GCB）、Oasis PRIME HLB小柱（3 mL，150 mg）、Oasis HLB凈化柱（6 mL，150 mg）、甲酸（質(zhì)譜純）美國(guó)Waters公司；PriboFast?Multi-Toxin IAC多毒素免疫親和柱 中國(guó)Pribolab公司；Mycosep 226柱（AflaZon+Multifunctional Coumns, 25 per pkg） 美國(guó)Romer Labs公司；GHP濾膜（0.2 μm） 美國(guó)頗爾公司。

甲醇、乙腈（均為質(zhì)譜純） 德國(guó)Merck公司；超純水（實(shí)驗(yàn)室一級(jí)水）由Millipore超純水機(jī)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC H-Class超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱（100.0 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美國(guó)Waters公司；TDL-5-A型低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器公司；Direct-Q?3UV型純水儀中國(guó)密理博有限公司 。

1.3 方法

1.3.1 茶葉樣品處理

茶葉樣品粉碎后過篩至粒度250 μm備用，每份樣品量需大于1 kg，稱取5 g茶葉樣品裝入50 mL離心管中，加入10 mL水和10 mL甲酸-乙腈（10∶90，V/V）溶液置于自動(dòng)振蕩器中振搖10 min。加入QuEChERS提取鹽包，振搖1 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行待凈化。安裝Oasis PRIME HLB小柱，取約0.5 mL上清液通過Oasis PRIME HLB小柱，棄去濾液，然后再取1 mL上清液，再次通過小柱并收集濾液。將濾液移到含有混合吸附劑的dSPE凈化管中，10 000 r/min離心10 min，濾液過0.2 μm濾膜，待上機(jī)進(jìn)樣。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：將16 種真菌毒素分別用甲醇稀釋至質(zhì)量濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃以下避光保存，根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要，各取不同體積毒素儲(chǔ)備液配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作液置于10 mL棕色儲(chǔ)液瓶中，避光備用。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3C18柱，柱溫40 ℃；樣品溫度15 ℃，進(jìn)樣體積2 μL，分析時(shí)間8 min；流速0.4 mL/min；流動(dòng)相A：0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫程序：0～0.5 min，98% A，2% B；0.5～5.0 min，98%～5% A，2%～95% B；5～8 min，5%A，95% B；8.0～8.01 min，5%～98% A，95%～2% B；8.01～10 min，98% A，2% B。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式；毛細(xì)管電壓1.5 kV；錐孔氣流：氮?dú)?，流?0 L/h；離子源溫度1 2 0 ℃；脫溶劑氣溫度5 0 0 ℃，流量1 000 L/h；碰撞氣：高純氬氣。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)16 種真菌毒素分子的化學(xué)電離性質(zhì)，分別在電噴霧離子源正/負(fù)模式下采用全掃描模式方式選擇母離子、子離子掃描模式對(duì)子離子及碰撞能量、錐孔電壓等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)所有毒素在正離子模式下響應(yīng)值均高于負(fù)離子模式，最終確定16 種真菌毒素的母離子、定性離子和定量離子參數(shù)，見表1。伏馬毒素B2與伏馬毒素B3，離子通道相接近，保留時(shí)間分別在5.22 min和3.03 min可以有效分離，其余化合物在各自的離子通道下不存在相互干擾，符合歐盟2002/657/EC號(hào)決議《質(zhì)譜分析方法鑒定點(diǎn)數(shù)》中對(duì)待測(cè)物定性及定量的要求。

表1 不同真菌毒素檢測(cè)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for 16 mycotoxins

2.2 流動(dòng)相的選擇

分別選擇甲醇-純水和乙腈-純水作為洗脫流動(dòng)相，比較2 個(gè)流動(dòng)相體系對(duì)分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)表明：以甲醇-純水為流動(dòng)相時(shí)，黃曲霉毒素B1、伏馬毒素B1的響應(yīng)值顯著降低；乙腈-純水為流動(dòng)相時(shí)，伏馬毒素B2、伏馬毒素B3無(wú)法完全分離?？梢娨约兯鳛榱鲃?dòng)相時(shí)，離子化效率較差，靈敏度低。為增強(qiáng)各組分物質(zhì)離子化強(qiáng)度，本實(shí)驗(yàn)在水溶液種添加甲酸（終體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入0.1%甲酸溶液有利于抑制真菌毒素與色譜柱的靜電作用，避免拖尾現(xiàn)象，伏馬毒素峰形對(duì)稱性明顯得到改善；并可以增強(qiáng)黃曲霉毒素的響應(yīng)值。因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，16 種毒素的色譜峰形和響應(yīng)強(qiáng)度均理想，保留時(shí)間穩(wěn)定，離子通道相接近的伏馬毒素B2與伏馬毒素B3可以充分分離。色譜條件優(yōu)化后的真菌毒素總離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 真菌毒素總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of mixture of 16 mycotoxins

2.3 提取條件優(yōu)化

在實(shí)驗(yàn)過程中，提取溶劑的選擇直接影響回收率的高低，為了獲得盡可能高的回收率，必須選擇提取效率高的溶劑。本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈、甲醇作為提取溶劑，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇作為質(zhì)子化溶劑相比乙腈具有更好的溶解性，但易將茶葉中的酸、醇、酚類物質(zhì)提取出來(lái)而導(dǎo)致提取液中雜質(zhì)較多；乙腈提取液相比甲醇提取液的脂肪和色素較少，有利于后續(xù)步驟的鹽析和凈化，最終選擇乙腈作為提取溶劑。

部分毒素含羧基基團(tuán)，對(duì)提取溶劑中酸度敏感，因此添加甲酸到提取溶劑中可以增強(qiáng)伏馬毒素、赭曲霉毒素等含有羧基集團(tuán)毒素的穩(wěn)定性及回收率。從表2可知，提取溶劑中的甲酸含量對(duì)不同種類毒素回收率的影響不同，其中，4 種黃曲霉毒素、雜色曲霉毒素和鐮刀菌烯醇受甲體積分?jǐn)?shù)度變化的影響較小；其余10 種毒素均隨提取劑中甲酸濃度的增加而增加，但是當(dāng)提取劑中甲酸體積分?jǐn)?shù)達(dá)15%時(shí)，雪腐鐮刀菌烯醇、桔青毒素、玉米赤霉烯酮、HT-2毒素、T-2毒素的回收率下降，且與甲酸體積分?jǐn)?shù)10%時(shí)相比達(dá)差異顯著水平（P＜0.05）。因此本實(shí)驗(yàn)選擇10%甲酸-乙腈作為提取溶劑。

表2 16 種真菌毒素在不同甲酸含量提取劑下的回收率Table 2 Recoveries of 16 mycotoxins extracted by acetonitrile with different formic acid concentrations

2.4 凈化柱選擇

采用Oasis PRIME HLB凈化柱第一步凈化，可以有效去除茶葉中大分子脂類雜質(zhì)，再通過dSPE凈化管，凈化管含硫酸鎂成分可去除基質(zhì)中水分，PSA去除茶葉基質(zhì)中的糖類和酸性成分，C18主要吸收剩余殘留脂類成分，GCB主要去除茶葉中色素成分，應(yīng)用上述凈化方法可以達(dá)到滿意回收率效果。本實(shí)驗(yàn)以烏龍茶提取液配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液比較多毒素免疫親和柱[28]、Mycosep 226柱[29]、Oasis HLB凈化柱和Oasis PRIME HLB凈化柱，結(jié)果如表3所示，多毒素免疫親和柱可測(cè)的毒素種類不能覆蓋全部待測(cè)的16 種毒素，且前處理較為復(fù)雜，回收率低；Mycosep 226柱凈化對(duì)黃曲霉毒素G2和玉米赤霉烯酮回收率較低，去除色素效果也不理想；Oasis HLB小柱凈化效果不理想，并對(duì)毒素有吸附作用，導(dǎo)致回收率低，達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求。因此本實(shí)驗(yàn)采用Oasis PRIME HLB凈化柱結(jié)合dSPE凈化管方法可以降低茶葉復(fù)雜基質(zhì)對(duì)毒素提取的干擾，達(dá)到凈化效果。

表3 4 種凈化柱對(duì)16 種真菌毒素回收率的影響Table 3 Effects of 4 purification columns on the recoveries of 16 mycotoxins

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

圖2 16 種真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)Fig. 2 Matrix effects of 16 mycotoxins

以不含毒素的烏龍茶、紅茶、白茶作為基質(zhì)空白，采用相同處理方法加入毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和流動(dòng)相溶液，利用二者標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值評(píng)價(jià)不同茶葉基質(zhì)對(duì)毒素的基質(zhì)效應(yīng)，比值一般在0.8～1.2定為基質(zhì)效應(yīng)不明顯，當(dāng)比值大于1.2視為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，比值小于0.8視為基質(zhì)抑制效應(yīng)[30]，測(cè)定結(jié)果如圖2所示，3 類茶葉中伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、伏馬毒素B3、HT-2毒素和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇基質(zhì)效應(yīng)均大于1.2，增強(qiáng)效應(yīng)的毒素種類約占31.3%，因此必須去除茶葉的基質(zhì)干擾。本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校準(zhǔn)定量，根據(jù)成分補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)，提高實(shí)驗(yàn)回收率水平。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限結(jié)果

依據(jù)樣品中16 種毒素基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)弱，配制不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以不同種茶葉空白基質(zhì)提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品母液，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。按照1.3.3節(jié)條件進(jìn)樣分析，以各組分的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，分別繪制出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。根據(jù)質(zhì)譜MRM模式下響應(yīng)不同，將配制好的最低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到茶葉樣品進(jìn)行處理進(jìn)樣，根據(jù)真菌毒素在不同茶葉基質(zhì)中最低添加濃度計(jì)算本方法的檢出限，根據(jù)茶葉基質(zhì)標(biāo)曲的最低點(diǎn)確定本方法的定量限。結(jié)果顯示，16 種真菌毒素的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液在各自范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。由表4可知，方法檢出限在0.03～7.00 μg/kg之間，其中，黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、展青霉素、赭曲霉毒素A及玉米赤霉烯酮的檢出限和定量限均低于GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量中的指標(biāo)》[31]。

表4 真菌毒素的線性方程、檢出限和定量限（n=6）Table 4 Linear equations, LODs and LOQs of 16 mycotoxins in tea (n= 6)μg/kg

2.7 方法的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

由于不同種類茶葉的基質(zhì)效應(yīng)具有一定的差別，因此茶葉中不同種類真菌毒素的定量限不同。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)真菌毒素在不同種類茶葉中定量限，設(shè)計(jì)低、中、高3 個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。如表5所示，16 種真菌毒素的加標(biāo)回收率為63.4%～109.7%，RSD為1.7%～11.3%，說明本實(shí)驗(yàn)方法滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表5 不同種類茶葉的加標(biāo)回收率及精密度（n=3）Table 5 Recoveries and precision of 16 mycotoxins spiked into different tea samples (n= 3)

續(xù)表5

2.8 茶葉實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)福建省各地區(qū)共計(jì)121 份陳年老茶樣品（烏龍茶38 份、白茶53 份、紅茶30 份），其中1 份烏龍茶樣品檢出黃曲霉毒素B1，含量為34.0 μg/kg，參考GB 2761—2017的限量標(biāo)準(zhǔn)（5.0～20.0 μg/kg）超過限量值[31]，1 份紅茶樣品檢出赭曲霉毒素A，含量為1.6 μg/kg，參考GB 2761—2017的標(biāo)準(zhǔn)（5.0 μg/kg）未超限量值[31]。陳年老茶貯藏年份較長(zhǎng)，放置環(huán)境發(fā)生變化或包裝損壞都可能導(dǎo)致茶葉受到真菌污染從而產(chǎn)生毒素危害人類健康。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定不同種類陳年老茶中16 種真菌毒素的方法。樣品經(jīng)甲酸-乙腈（10∶90，V/V）溶液提取，加入QuEChERS鹽包振搖離心，提取液過OASIS PRIME HLB小柱和dSPE凈化管處理，以ACQUITY UPLC HSS T3C18色譜柱分離，采用電噴霧正離子模式掃描，MRM模式測(cè)定，茶葉基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，外標(biāo)法定量。16 種真菌毒素在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。采用QuEChERS方法提取結(jié)合OASIS PRIME HLB小柱和dSPE凈化管雙重凈化的前處理方法，成本遠(yuǎn)低于目前普遍采用的免疫親和柱，操作更簡(jiǎn)單，無(wú)需活化和平衡步驟，可除去大部分基質(zhì)干擾物，并且溶液流速更快，使得整個(gè)操作更順暢、更快速；采用高靈敏的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法同時(shí)測(cè)定16 種真菌毒素，提取時(shí)間短，20 min內(nèi)即可完成，極大的提高測(cè)試的通量；經(jīng)過優(yōu)化后方法16 種真菌毒素的檢出限達(dá)到0.03～7.00 μg/kg，靈敏度較高，能滿足產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督的要求。

QuEChERS是一種快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、高效、可靠和安全的分散固相萃取技術(shù)[32]，分為提取、鹽析和凈化3 個(gè)步驟，提取是QuEChERS技術(shù)重要的組成部分，提取液的提取效率決定著最終分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)于極性范圍敏感的目標(biāo)樣品提取時(shí)，需在提取液中添加輔助試劑（乙酸、甲酸和甲醇等）以增強(qiáng)聯(lián)合提取的效果[33]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在甲酸添加量為1%～10%范圍內(nèi)，16 種毒素回收率的平均值呈上升趨勢(shì)，超過10%略有下降，因此選擇10%甲酸-乙腈作為提取溶劑，使16 種真菌毒素均有較高的回收率。

本實(shí)驗(yàn)在陳年老茶中檢出真菌毒素，說明陳年老茶存在真菌毒素污染的安全隱患，目前針對(duì)茶葉中毒素的限值還沒有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，因此極有必要建立茶葉中的真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。