不對稱PCR 技術(shù)結(jié)合免疫層析法快速檢測產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌

山 珊，黃昭鴻，黃艷梅，劉道峰，劉成偉，黃運紅，龍中兒,*

（1.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌市鄱陽湖濕地微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，江西 南昌 330022；2.江西業(yè)力醫(yī)療器械有限公司，江西 南昌 330008；

3.江西省疾病預(yù)防控制中心，江西省食源性疾病診斷溯源重點實驗室，江西 南昌 330029）

產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌（Shiga toxin-producingEscherichia coli，STEC），亦稱腸道出血性大腸埃希氏菌，是一種分泌志賀毒素并引起宿主腸黏膜上皮細(xì)胞形成黏附及擦拭性損傷的致瀉性大腸埃希氏菌[1-2]，其致病能力極強(qiáng)，100 個STEC即可引起感染，造成出血性結(jié)腸炎或血性腹瀉，嚴(yán)重者可進(jìn)一步發(fā)展為溶血性尿毒綜合征[3-5]。STEC主要的致病因子志賀毒素（Shiga toxin，Stx）包括2 種[6]：Stx1和Stx2，其中Stx2更易引起出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒綜合征[7-8]。Stx能與腎細(xì)胞上的Gb3或Gb4受體特異性結(jié)合，阻斷宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成。由于一些反芻動物（如牛、羊等）體內(nèi)細(xì)胞缺少這類受體，被感染后出現(xiàn)臨床癥狀的幾率低，因此成為了STEC感染的最大宿主[9]，人往往通過食用了攜帶STEC的肉制品或飲用了被牛、羊糞便污染的水或綠葉蔬菜而被感染[10-11]。由于STEC擁有多樣化的感染宿主與傳播途徑，全球每年有280萬 人感染STEC，其中3 890 例發(fā)展為溶血性尿毒綜合征，導(dǎo)致230 人死亡[12]。2017年4月，在美國有25 人因食用了被STEC污染的蔬菜而生病，事件最終導(dǎo)致9 人入院治療，2 人病情惡化為溶血性尿毒綜合征，1 人腎衰竭，1 人死亡，范圍波及12 個州。2018年7月美國又發(fā)生了一起食用被STEC污染的牛肉中毒事件，此次事件總共造成18 人感染，6 人住院，其中一位來自佛羅里達(dá)州的病人因引起了溶血性尿毒綜合癥而死亡。迅速確定STEC的污染來源可有效縮小疫情的范圍，而建立簡便高效的檢測方法是STEC溯源的關(guān)鍵[13]。

目前針對于STEC的檢測方法主要包括免疫學(xué)檢測法[14-15]和分子生物學(xué)法[16-18]。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)[19-20]和免疫層析技術(shù)[21]是免疫學(xué)檢測法的2 個主要檢測手段。免疫學(xué)檢測法是基于STEC菌體表面特異性抗原（O、H抗原）的不同，通過抗原抗體間特異性識別而達(dá)到鑒定的目的，操作簡單快速，但其檢測范圍狹窄，只能檢測特定血清型的STEC，抗體制備成本高，且容易存在一定的假陽性。分子生物學(xué)法主要依靠聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)對STEC的標(biāo)志性毒力基因stx1與stx2進(jìn)行識別?；赑CR技術(shù)的分子生物學(xué)法檢測手段眾多[22-24]，可滿足不同的實驗需求。陸蕓等[25]針對stx1和stx2基因序列設(shè)計PCR引物以及Taqman探針，建立了一種雙重?zé)晒舛縋CR技術(shù)檢測志賀毒素stx1和stx2基因的方法，結(jié)果顯示對非產(chǎn)志賀毒素腸道菌均無特異性擴(kuò)增，且陽性檢出率優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)法。Singh等[26]建立了一種基于高分辨熔解曲線的雙重?zé)晒釶CR技術(shù)檢測stx1與stx2，成功地從人工接種的碎牛肉樣品中檢出STEC，該方法需要利用特殊的飽和熒光染料與雙鏈DNA分子進(jìn)行結(jié)合，在緩慢升溫解鏈的過程中飽和熒光染料與雙鏈DNA分子解離，不同DNA序列解鏈溫度亦不同，從而產(chǎn)生不同的熒光信號值變化，形成相應(yīng)的熔解曲線。分子生物學(xué)法[27-28]檢測技術(shù)效果好，特異性強(qiáng)，檢出陽性率高，但大多數(shù)方法的檢測結(jié)果判讀依賴于熒光定量PCR儀，成本較高，不能直觀地對結(jié)果進(jìn)行判定；其他一些依賴于核酸電泳進(jìn)行結(jié)果判定的檢測技術(shù)雖然成本不高，但有些基因片段大小相近，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確辨別目的條帶，同時電泳過程中的所添加的核酸染料對人體也有一定的危害。

不對稱PCR技術(shù)是向PCR體系中加入不等量的一對引物進(jìn)行目標(biāo)基因的擴(kuò)增，在擴(kuò)增后期中生成大量目標(biāo)基因單鏈DNA（single-strained DNA，ssDNA）[29]。利用不對稱PCR技術(shù)產(chǎn)生帶有標(biāo)記物的單鏈DNA，通過結(jié)合其他技術(shù)如光學(xué)SPR生物傳感器[30]、納米金比色法[31]、電化學(xué)DNA生物傳感器[32]等實現(xiàn)快速靈敏檢測目標(biāo)基因片段的目的。本實驗使用生物素標(biāo)記的毒力基因stx1與stx2的下游引物對目標(biāo)基因進(jìn)行不對稱PCR擴(kuò)增，生物素化的目標(biāo)單鏈DNA與聚苯乙烯微球標(biāo)記的目標(biāo)基因的上游引物特異性結(jié)合形成結(jié)合物，結(jié)合物上的生物素與試紙條檢測線上鏈霉親和素結(jié)合而使檢測線顯色。此方法具有選擇性高且快速、準(zhǔn)確和安全的優(yōu)點，結(jié)果判定便利、直觀，可實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測的目的，適用于基層實驗室使用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源

菌種來源及編號見表1。

表1 菌種來源及編號Table 1 Sources and codes of strains used in this study

1.1.2 試劑

嗎啉乙磺酸 上海麥克林生化科技有限公司；磷酸鹽緩沖液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、肉湯培養(yǎng)基、鏈霉親和素 北京索萊寶科技有限公司；表面羧基化的紅色聚苯乙烯微球DC100R 上海輝質(zhì)生物科技有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國Sigma公司；聚乙二醇20000、甘氨酸、葡聚糖、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、脫脂乳、明膠 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TAKARA細(xì)菌基因組提取試劑盒；魚血漿阻斷劑 上海怡恒生物科技有限公司；11342-025N硝酸纖維膜（NC膜，流速為570 mL/（min·cm2）） 德國Sartorius公司；聚酯膜（濾紙）、樣本墊、結(jié)合墊、吸水紙、PVC底板 上海金標(biāo)生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

EPS PCR儀 德國Eppendorf公司；HZ100R高速離心機(jī) 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；BE-1200旋轉(zhuǎn)混合儀 其林貝爾儀器制造有限公司；Tu-10恒溫金屬浴 上海一恒儀器設(shè)備有限公司；CORNING LSE小型高速離心機(jī) 美國Corning公司；HGS510劃膜噴金機(jī)、HGS-201可編程切條機(jī)和試紙條灰度檢測儀 杭州峰航科學(xué)儀器有限公司；SPX-150BIII生化培養(yǎng)箱天津市汞斯特儀器有限公司；LZDM壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；Airstream?生物安全柜 新加坡ESCO公司；QIAxcel Advanced全自動實時毛細(xì)管電泳儀德國QIAGEN公司；Synergy超純水系統(tǒng) 德國Merker Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 引物的設(shè)計

根據(jù)GB 4789.6—2016《食品微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》[33]中STEC標(biāo)志性毒力基因stx1與stx2的序列進(jìn)行引物及探針的設(shè)計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并測序，如表2所示。

表2 引物及探針序列Table 2 Sequences of primers and probes used in this study

1.3.2 菌株的培養(yǎng)和DNA提取

細(xì)菌菌株在5 m L L B 肉湯培養(yǎng)基中3 7 ℃振蕩（150 r/min）過夜培養(yǎng)12 h。采用TAKARA公司細(xì)菌基因組提取試劑盒，對細(xì)菌菌株進(jìn)行DNA抽取，具體操作按說明書進(jìn)行。

1.3.3 免疫層析試紙條的制備

利用HGS510劃膜噴金機(jī)在NC膜上噴涂一定質(zhì)量濃度的鏈霉親和素（1 mg/mL，0.74 μL/cm）作為檢測線；將濾紙、結(jié)合墊、NC膜、吸水紙按順序貼于PVC底板上，切成3.9 mm寬的免疫層析試紙條。制備好的試紙條置于密封袋中，干燥陰涼條件下保存。

1.3.4 聚苯乙烯微球的標(biāo)記

取4 μL表面羧基化的紅色聚苯乙烯微球（40 mg/mL）至1 mL嗎啉乙磺酸緩沖液中（0.1 mol/L，pH 6.0），25 ℃超聲5 min；加入4 μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（10 mg/mL，0.1 mol/L嗎啉乙磺酸緩沖液）溶液，25 ℃超聲5 min后將其放置混合儀上混合反應(yīng)15 min；加入4 μL氨基標(biāo)記的上游引物（NH2C6-stx1F或NH2C6-stx2F，100 μmol/L），25 ℃振蕩孵育6 h后離心（4 ℃、15 000 r/min、30 min），棄上清液，加入900 μL的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液復(fù)溶；加入一定量的封閉劑混合反應(yīng)30 min；再加入100 μL PEG20000溶液（1%，超純水）混合反應(yīng)30 min；最后離心30 min后棄上清液（4 ℃、15 000 r/min），加入100 μL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，置于4 ℃冰箱待用。

1.3.5 不對稱PCR體系的建立

以STEC基因組DNA作為模板，分別對stx1和stx2進(jìn)行不對稱PCR條件的優(yōu)化，以獲取相應(yīng)的生物素標(biāo)記的目標(biāo)單鏈DNA。在普通PCR條件的基礎(chǔ)上，加入稀釋后的上游引物與正常濃度的下游引物（濃度2 μmol/L）；反應(yīng)體系為：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+Plus），5 μL；dNTP Mixture（2.5 mmol/L），2 μL；PrimeSTAR HS DNA聚合酶（2.5 U/μL），0.25 μL；模板，1 μL；稀釋后的stx1F和stx2F上游引物2.5 μL，同時加入等量的生物素標(biāo)記的下游引物Biotin-stx1R、Biotin-stx2R（濃度均為2 μmol/L），補充超純水至25 μL。PCR反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性5 min；變性、退火、延伸（98 ℃，10 s；60 ℃、5 s，72 ℃，30 s）×45 個循環(huán)；最后72 ℃，延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行觀察。實驗對不對稱PCR上、下游引物濃度添加比例進(jìn)行優(yōu)化，上游引物與相應(yīng)的下游引物濃度比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10；對不對稱PCR循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，循環(huán)數(shù)梯度設(shè)置為n=35、45、55、65；對不對稱PCR退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，退火溫度梯度設(shè)置為55～65 ℃；上、下游引物加入量梯度設(shè)置為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 μL，stx1和stx2生物素化的下游濃度均為2 μmol/L，PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行觀察。

1.3.6 免疫層析實驗

用超純水將不對稱PCR產(chǎn)物稀釋100 倍，取稀釋后的PCR產(chǎn)物92 μL，加入NH2C6-stx1F和NH2C6-stx2F分別標(biāo)記的聚苯乙烯微球各4 μL混勻，室溫靜置10 min后加入10 μL PVP溶液（10%，超純水），混勻后加入免疫層析試紙條樣本墊，反應(yīng)20 min，使用灰度分析儀讀取檢測線灰度值。

1.3.6.1 封閉劑添加種類的優(yōu)化

評價7 種不同封閉劑對聚苯乙烯微球的封閉效果，包括BSA、甘氨酸、葡聚糖、OVA、脫脂乳、明膠和魚血漿阻斷劑，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，添加量為50 μL。選取stx1不對稱PCR產(chǎn)物作為實驗組，對照組以超純水代替不對稱PCR產(chǎn)物。

1.3.6.2 封閉劑添加量的優(yōu)化

在BSA為最優(yōu)封閉劑的基礎(chǔ)上，繼續(xù)考察BSA添加量對聚苯乙烯微球封閉效果的影響，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，添加量分別為10、20、50、70、100 μL。選取stx1不對稱PCR產(chǎn)物作為實驗組，對照組以超純水代替不對稱PCR產(chǎn)物。

1.3.7 免疫層析試紙條檢測stx基因

選取編號為CICC10668（stx1陽性）、CICC10669（stx2陽性）、CICC10670（stx1/stx2陽性）3 株不同的STEC菌株以及1 株腸道聚集性大腸埃希氏菌CICC24186（不含stx基因）菌株于LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行劃線培養(yǎng)18 h，挑取單菌落提取基因組DNA作為待檢測模板，在優(yōu)化的條件下進(jìn)行stx基因檢測實驗。

1.3.8 特異性實驗

以江西省疾控中心菌種庫中23 株菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行特異性實驗，評價該檢測方法的特異性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每次實驗至少重復(fù)3 次，所得數(shù)據(jù)均用Excel軟件進(jìn)行記錄與處理，使用Origin 9.0軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不對稱PCR上、下游引物添加比例的優(yōu)化

圖1 stx1和stx2不同引物濃度添加比的免疫層析檢測灰度值Fig. 1 Gray values of immunochromatography at different concentration ratios between stx1 and stx2 primers

圖2 stx1（A）和stx2（B）不同引物濃度添加比的不對稱PCR產(chǎn)物毛細(xì)管電泳圖Fig. 2 Capillary electrophoresis profiles of aPCR products at different concentration ratios between stx1 (A) and stx2 (B) primers

在利用不對稱PCR技術(shù)制備目標(biāo)單鏈DNA的過程中，當(dāng)限制性引物（上游引物）耗盡時，剩余過量的下游引物則以擴(kuò)增前期所產(chǎn)生的雙鏈DNA為模板，擴(kuò)增出所對應(yīng)的目標(biāo)單鏈DNA，因此上、下游引物的添加比例是影響單鏈DNA產(chǎn)量的關(guān)鍵因素?？疾靤tx1與stx2的最佳引物濃度添加比，結(jié)果如圖1、2所示。隨著下游引物添加量的增加，stx1相應(yīng)單鏈PCR的產(chǎn)量隨之升高（圖2A），stx1在stx1F∶Biotin-stx1R濃度比為1∶7時，其制備的目標(biāo)單鏈DNA進(jìn)行免疫層析時的灰度值最高結(jié)果（圖1），灰度平均值為464.6。當(dāng)stx2F∶Biotin-stx2R添加濃度比為1∶4時，制備的stx2的目標(biāo)單鏈DNA進(jìn)行免疫層析時的灰度值最高，灰度平均值為383.3。繼續(xù)提高stx2基因下游引物的添加量，相應(yīng)目標(biāo)單鏈DNA的隨之減少，并出現(xiàn)了其他副產(chǎn)物（圖2B）。導(dǎo)致免疫層析效果下降。

2.2 不對稱PCR循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

圖3 stx1和stx2不對稱PCR不同循環(huán)數(shù)的免疫層析檢測灰度值Fig. 3 Gray values of immunochromatography at different aPCR cycles for stx1 and stx2

在不對稱PCR過程中，循環(huán)擴(kuò)增末期會產(chǎn)生大量的單鏈DNA產(chǎn)物，對不對稱PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖3、4所示。實驗結(jié)果顯示隨著循環(huán)數(shù)的增加，stx1目標(biāo)單鏈DNA產(chǎn)物含量越多（圖4），同時免疫層析法檢測stx1的結(jié)果（圖3）顯示當(dāng)循環(huán)數(shù)為65，檢測線的灰度平均值最高為582.4；對于stx2組，當(dāng)循環(huán)數(shù)為55時，檢測線的灰度平均值最高為344.3，當(dāng)循環(huán)數(shù)為65時，stx2的目標(biāo)單鏈DNA產(chǎn)物免疫層析灰度值下降（圖3），可能由于不對稱PCR循環(huán)數(shù)增加導(dǎo)致單鏈擴(kuò)增效率不高，因此目標(biāo)單鏈DNA產(chǎn)物濃度下降，故選取循環(huán)數(shù)為55。

圖4 stx1、stx2不同循環(huán)數(shù)的不對稱PCR產(chǎn)物毛細(xì)管電泳圖Fig. 4 Capillary electrophoresis profiles of stx1 and stx2 aPCR products at different PCR cycles

2.3 不對稱PCR退火溫度的優(yōu)化

圖5 stx1、stx2不對稱PCR不同退火溫度的免疫層析檢測灰度值Fig. 5 Gray values of immunochromatography of stx1 and stx2 aPCR products at different annealing temperatures

圖6 stx1（A）和stx2（B）不同退火溫度的不對稱PCR產(chǎn)物毛細(xì)管電泳圖Fig. 6 Capillary electrophoresis profiles of aPCR products of stx1 (A)and stx2 (B) at different annealing temperatures

如圖5、6所示，stx2的最優(yōu)退火溫度為55 ℃，檢測線灰度值為362，stx1組在退火溫度55～65 ℃期間，其檢測線的平均灰度值均高于stx2組，當(dāng)退火溫度為59 ℃時所測得檢測線的平均灰度值最大為557。結(jié)果顯示較低的退火溫度對stx2制備的目標(biāo)單鏈DNA進(jìn)行檢測更有利。最終選取55 ℃作為不對稱PCR反應(yīng)的退火溫度。

2.4 不對稱PCR引物加入量的優(yōu)化

圖7 stx1和stx2不對稱PCR不同引物加入量的免疫層析檢測灰度值Fig. 7 Gay values of immunochromatography of stx1 and stx2 aPCR products at different amounts of primers

圖8 stx1和stx2不同引物加入量的不對稱PCR產(chǎn)物毛細(xì)管電泳圖Fig. 8 Capillary electrophoresis of aPCR products at different primer ratios between stx1 and stx2

不對稱PCR體系中引物的添加量影響整個擴(kuò)增過程中目標(biāo)單鏈DNA產(chǎn)物的生成量，適當(dāng)提升引物加入量能夠增加擴(kuò)增末期時所產(chǎn)生目標(biāo)單鏈DNA。因此，對不對稱PCR體系中引物加入量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖7、8所示。隨著體系中引物濃度的增加，目標(biāo)單鏈DNA產(chǎn)物的生成量也隨之增加，當(dāng)stx1與stx2引物（上游引物濃度為2 μmol/L）加入量為3 μL時，stx1的檢測線灰度值最高為600（圖7），stx2的檢測線灰度值最高為440，繼續(xù)提高引物的濃度，對免疫層析效果沒有顯著影響。

2.5 封閉劑對檢測結(jié)果的影響

聚苯乙烯微球具有較強(qiáng)的物理吸附作用，合適的封閉劑可最大程度地減小實驗過程中的非特異性吸附作用。如圖9、10所示，在7 種封閉劑中，當(dāng)以甘氨酸和葡聚糖作為封閉劑時，陰性組中會出現(xiàn)微弱的非特異性條帶。以O(shè)VA和魚血漿阻斷劑作為封閉劑的實驗組20 min后檢測線灰度值較高，但在有效顯色時間內(nèi)（20 min之內(nèi)）顯色速率慢于BSA實驗組（圖10）。明膠作為封閉劑會嚴(yán)重影響聚苯乙烯微球上DNA探針與目標(biāo)單鏈DNA的特異性結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致實驗組無法顯色，因此選用BSA作為最終封閉劑。

圖9 不同封閉劑作用下的stx1聚苯乙烯微球免疫層析檢測灰度值Fig. 9 Gray values of immunochromatography with different blocking agents for stx1 polystyrene microspheres

圖10 不同封閉劑作用下的stx1聚苯乙烯微球免疫層析動力學(xué)曲線Fig. 10 Kinetic curves for immunochromatography with different blocking agents for stx1 polystyrene microspheres

2.6 BSA添加量對檢測結(jié)果的影響

圖11 不同量的BSA封閉聚苯乙烯微球免疫層析檢測灰度值Fig. 11 Gray values of immunochromatography with different amounts of BSA as a blocking agent for polystyrene microspheres

少量的封閉劑導(dǎo)致聚苯乙烯微球表面封閉面積不足，進(jìn)而產(chǎn)生非特異性吸附，過多的封閉劑會影響聚苯乙烯微球上DNA探針與目標(biāo)單鏈DNA的特異性結(jié)合。如圖11所示，當(dāng)BSA添加量為20 μL時，檢測線的灰度值達(dá)到最大，為577，同時陰性對照組未出現(xiàn)條帶，隨著BSA添加量的增加，陽性組檢測線灰度值有不同程度地下降。

2.7 免疫層析試紙條檢測stx基因

圖12 免疫層析法檢測stx基因灰度值Fig. 12 Gray values of immunochromatography for detection of stx gene

利用所建立的方法對4 株菌株進(jìn)行stx基因檢測，結(jié)果如圖12所示，利用該方法可快速分型檢測到STEC。

2.8 特異性實驗

為驗證本實驗建立并優(yōu)化的快速分型STEC法的特異性，選取23 株菌株進(jìn)行stx基因的檢測，結(jié)果如表3所示。23 株菌中STEC CICC10670、CICC10668和CICC0669呈現(xiàn)stx陽性，其他非攜帶stx基因的菌株為陰性；結(jié)果顯示該方法可準(zhǔn)確檢測到含有STEC標(biāo)志性毒力基因stx的菌株，且具有良好的特異性。

表3 免疫層析技術(shù)特異性實驗檢測結(jié)果Table 3 Specificity evaluation of the immunochromatographic test

3 結(jié) 論

通過建立一種基于不對稱PCR結(jié)合免疫層析技術(shù)快速檢測STEC標(biāo)志性毒力基因stx的方法，可實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確分型STEC的目的。該方法操作簡便、檢測成本低、檢測結(jié)果準(zhǔn)確以及特異性良好等特點，適用于基層實驗室使用。