QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測禽源性食品中氟蟲腈及其代謝物

戴盡波，沈 潔，何嘯峰，聶榮榮，董文靜，梁沁嫻

（梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗所，廣東 梅州 514071）

氟蟲腈是一種廣譜性苯基吡唑類殺蟲劑，由原法國羅納-普朗克公司于1987年開發(fā)，并于1993年進入中國[1]，由于其對有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯、氨基甲酸酯類農(nóng)藥具有抗性的昆蟲具有很高的敏感性，且與現(xiàn)有的農(nóng)藥無交叉抗性，被廣泛用于農(nóng)業(yè)和城市病蟲害防治中。氟蟲腈可通過氧化、還原和水解過程降解，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜。研究表明，氟蟲腈代謝產(chǎn)物在人體中的保留時間比氟蟲腈母體更長，生物蓄積性更強，內分泌破壞力更高[2-5]。

禽類養(yǎng)殖的過程中，養(yǎng)殖戶為了防止跳蚤、螨蟲、虱子等寄生蟲引起動物患病，會違規(guī)使用氟蟲腈作為殺蟲劑用于養(yǎng)殖場的消毒清潔。但使用的氟蟲腈會殘留于飼料、環(huán)境水源及泥土中，之后又隨之被禽類動物吸收進入體內，造成氟蟲腈及其代謝物在禽類體內不斷蓄積，形成氟蟲腈及其代謝物殘留[6]。歐盟等國家和地區(qū)對于禽類食品中氟蟲腈及其代謝物設定了嚴格的最大限量，其中歐盟規(guī)定氟蟲腈和氟蟲腈砜總計的最大殘留限量值僅為0.005 mg/kg[7]；國際食品法典委員會規(guī)定禽蛋中氟蟲腈的最大殘留限量值為0.02 mg/kg，禽肉中則為0.01 mg/kg[8]。GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定禽肉類最大殘留限量0.01 mg/kg；禽蛋及禽類內臟則為0.02 mg/kg[9]。為保障禽類產(chǎn)品安全，需建立一種快速、靈敏、準確的氟蟲腈殘留量檢測方法，為建立禽類產(chǎn)品風險評估分析提供可靠技術支持。

目前，食品中氟蟲腈及其代謝物的測定方法主要有氣相色譜法[10-11]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法[12-14]、液相色譜-質譜聯(lián)用法[15-17]，這些方法中常用的前處理方法有液-液萃取[18]、固相萃取[19]、固相微萃取[10]、QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）[13,20-21]。

QuEChERS技術因高效、快速、成本低等特點，被廣泛地應用于農(nóng)獸藥殘留檢測領域[22]。QuEChERS前處理常用試劑凈化材料主要是十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、N-丙基乙二胺吸附劑（primary secondary amine，PSA），可滿足大部分食品中農(nóng)獸藥殘留的檢測，但是對于脂肪、磷脂、蛋白含量較高的動物性食品，經(jīng)QuEChERS前處理后，仍會出現(xiàn)較大的基質干擾，影響靈敏度和測準確度。寧霄等[20]采用傳統(tǒng)QuEChERS前處理技術應用于動物源性食品中氟蟲腈及其代謝物殘留檢測，結果顯示該方法基質效應在0.873～1.461之間，特別是在雞肉和雞肝中呈明顯的基質增強效應，檢測靈敏度為5 μg/kg，平均加標回收率在75.7%～104.5%之間，相對標準偏差在1.3%～10.4%之間；郝杰等[23]建立基于QuEChERS前處理技術的雞蛋、雞肉中氟蟲腈及其代謝物殘留檢測方法，結果顯示該方法的基質效應在-16.9～9.66之間，說明該QuEChERS方法存在很強的基質效應，方法定量限為1 μg/kg；羅亮[24]研究了3 種食品中氟蟲腈及其代謝物殘留檢測方法，樣品經(jīng)QuEChERS方法提取后，經(jīng)氣相色譜-質譜檢測，該方法檢出限為4.5 μg/kg，回收率在72.1%～112.4%之間，相對標準偏差均小于7.0%。

綜上所述，目前用于檢測動物性食品中氟蟲腈的QuEChERS前處理方法存在基質效應大，檢測靈敏度及準確度較低的問題，針對上述問題本研究將新型材料多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotube，MWCNT）和碳十八鍵合鋯膠（Z-Sep+）應用于禽類食品中氟蟲腈及其代謝物QuEChERS前處理方法中，二氧化鋯是唯一同時具有表面酸性位和堿性位的過渡金屬氧化物，具有路易斯酸?堿的特性，氧化鋯包覆硅膠和Z-SEP+是新型固相吸附劑，它對脂類化合物如甘油酯和磷脂、色素具有很強的吸附力[25]；MWCNT是由幾層到幾十層石墨烯片同軸卷曲而成的無縫管狀物，其π-π作用、疏水作用、大的比表面積及其中空結構使其能夠有選擇、可逆地吸附某些化合物，特別是對親脂分子有很強的吸附力[26-27]。

本研究先通過Plackett-Burman試驗篩選出QuEChERS前處理中顯著影響化合物回收率的因素，再用響應面法優(yōu)化顯著影響的用量，建立改良QuEChERS結合超高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定禽類食品中的氟蟲腈及代謝物的方法，經(jīng)方法學驗證，該方法可用于禽類產(chǎn)品中氟蟲腈及其代謝物殘留的快速定量測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋、雞肉、雞肝 市購。

氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、氟甲腈 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；乙腈（色譜純） 美國ACS恩科化學；NaCl、無水MgSO4（均為分析純） 上海國藥集團化學試劑有限公司；C18、PSA 天津博納艾杰爾科技有限公司；Z-Sep+美國Supelco公司；MWCNT南京先豐納米科技公司。

1.2 儀器與設備

LCMS-8040高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜聯(lián)用儀（配電噴霧離子源及LCMS solution3.2）、AUW220型電子分析天平 日本島津企業(yè)管理有限公司；ST16R高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司；UC-7100S型數(shù)控超聲波清洗器 美瑞泰克科技有限公司；S25旋渦混勻器 德國IKA公司；Milli Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Shim-pack XR-ODS（2.0 mm×75 mm，1.7 μm）；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；流動相：A 為乙腈，B 為水；梯度洗脫條件：0 ～0.5 m i n，50%～70% A，50%～30% B；0.5～3.0 min，70% A，30% B；3.0～3.5 min，70%～99% A，30%～1% B；3.5～4.5 min，99% A，1% B；4.5～5.0 m in，99%～50% A，1%～50% B；5.0～6.0 min，50% A，50% B；進樣量10 μL。

1.3.2 質譜條件

電噴霧離子源；正離子掃描；多反應監(jiān)測掃描模式；離子噴霧電壓4.5 kV；霧化氣為氮氣，流速3.0 L/min；干燥氣為氮氣，流速15 L/min；碰撞氣為氬氣；脫溶劑管溫度250 ℃；加熱模塊溫度400 ℃。氟蟲腈及其代謝物的檢測參數(shù)見表1。

表1 氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物質譜參數(shù)Table 1 MS parameters for detection of fipronil and its metabolites

1.3.3 標準溶液的配制

分別準確吸取質量濃度為100 μg/mL氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜標準溶液各1 mL，用乙腈稀釋至100 mL，搖勻，制成1 μg/mL的混合標準中間液，-20 ℃保存，保存期1 個月。

1.3.4 樣品前處理

準確稱取5 g經(jīng)充分均質的樣品于50 mL離心管中，加入5 mL水，渦旋混勻30 s，加入25 mL乙腈，混勻，超聲提取5 min，隨后加入鹽包（含4 g無水MgSO4及1 g NaCl），渦旋混勻1 min，4 ℃、10 000 r/min離心5 min。準確取1 mL上清液至2 mL凈化管（含50 mg Z-Sep+、13 mg MWCNT、150 mg無水MgSO4），渦旋混合30 s，5 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔過濾后，待測。

1.3.5 Plackett-Burman試驗與單因素試驗

采用Plackett-Burman試驗（n=20），對QuEChERS前處理方法中乙腈提取體積、超聲時間、無水MgSO4質量、NaCl質量、凈化體積、C18質量、Z-Sep+質量、MWCNT質量8 個因素進行考察，試驗設計如表2所示，響應值為3 次平行試驗氟蟲腈及其代謝物回收率的平均值。

根據(jù)Plackett-Burman試驗結果，對篩選出的顯著影響因素：乙腈體積、Z-Sep+質量、MWCNT質量進行單因素試驗，以縮小后續(xù)響應面試驗優(yōu)化范圍。

表2Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 2 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Plackett-Burman design

1.3.6 Box-Behnken響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，確定待優(yōu)化因素大致的最佳范圍，對其進行Box-Behnken響應面試驗設計，每個因素進行3 個不同水平的試驗，因素與水平設計如表3所示。

表3Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 3 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.7 基質效應評估與方法學驗證

基質是指樣品中除目標物之外的其他成分，會對目標物的分析過程造成干擾，并影響結果的準確性，這些影響即稱之為基質效應。本實驗通過空白加入法考察基質效應，取雞蛋、雞肝、雞肉3 種樣品按照1.3.4節(jié)前處理，得到的空白基質溶液分別配制3 條基質標準曲線，將所得曲線的斜率按下式計算得到絕對基質效應：

式中：Sm為基質配制的校準曲線斜率；Ss為純溶劑配制的校準曲線斜率。若基質效應小于100%，則存在基質抑制效應，若基質效應大于100%，則存在基質增強效應。

2 結果與分析

2.1 質譜參數(shù)優(yōu)化

由于氟蟲腈及其代謝物結構中含有較多電負性強的基團——鹵代原子，在強吸電基團作用下分子易去質子化，形成負離子。選擇負離子模式，依次將氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜的標準溶液（0.5 μg/mL）直接注入質譜中，進行一級質譜掃描，4 種化合物容易去質子化形成m/z分別為435.00、387.10、451.00和419.00的[M-H]-離子，將這些分子離子峰選作前體離子進行二級質譜掃描，得到二級質譜信息，選取響應強度高、干擾小的兩對離子作為定量離子和定性離子，優(yōu)化的質譜參數(shù)如表1所示。

2.2 Plackett-Burman試驗結果

通過Plackett-Burman設計可對試驗中大部分因素進行初步篩選，從而可用較少的實驗次數(shù)，從眾多因素中快速篩選顯著影響實驗結果的因素[28]。本研究考察乙腈體積、超聲時間、無水MgSO4質量、NaCl質量、凈化體積、C18質量、Z-Sep+質量、MWCNT質量8 個因素在QuEChERS前處理方法中的作用，將回收率作為響應值。運用Minitab 18軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，結果用標準化帕累托圖表示，從圖1可以看出，4 種化合物均有3 個因素的標準化效應值超過了基準參照線（圖中虛線），分別為Z-Sep+質量、MWCNT質量、乙腈體積，表明這3 個因素對回收率影響顯著。從圖1a、b、d可看出，影響氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈亞砜回收率因素顯著性為Z-Sep+質量＞MWCNT質量＞乙腈體積；從圖1c可看出，影響氟蟲腈砜回收率因素顯著性為Z-Sep+質量＞乙腈體積＞MWCNT質量。此外，實驗結果中發(fā)現(xiàn)與未使用Z-Sep+處理組相比，Z-Sep+處理組色譜圖更干凈，信噪比值更大；與未使用MWCNT處理組相比，使用MWCNT凈化后的提取液顏色更淺，凈化效果明顯。在后續(xù)試驗中這3 種因素作為主要因素進一步優(yōu)化。

圖1 試驗因素標準化效應帕累托圖Fig. 1 Pareto charts of the standardized effects

2.3 單因素試驗結果

圖2 各因素對回收率的影響Fig. 2 Effect of the three selected variables on the recovery of analytes

根據(jù)Plackett-Burman試驗結果，選擇乙腈體積、MWCNT質量、Z-Sep+質量3 個因素進行單因素試驗優(yōu)化，每個因素設置5 個水平，確定其最佳值所處范圍供響應面法參考，結果如圖2所示。由圖2a可知，隨乙腈體積的增加，回收率呈上升趨勢，但乙腈體積超過25 mL時，回收率超過100%，故選擇乙腈體積20 mL；圖2b顯示，Z-Sep+質量為0～75 mg時，回收率上升，超過75 mg，4 種分析物回收率均有所下降，故Z-Sep+質量為75 mg；由圖2c可知，當MWCNT質量為10 mg時，4 種分析物的回收率最高，超過10 mg，回收率呈現(xiàn)下降趨勢，MWCNT質量選為10 mg。

2.4 Box-Behnken響應面試驗結果

在Plackett-Burman及單因素試驗結果的基礎上，選擇乙腈體積、MWCNT質量和Z-Sep+質量進行3因素3水平的Box-Behnken響應面優(yōu)化試驗，應用Minitab 18軟件對數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析，建立二次響應模型，得到的4 種化合物回收率對自變量A、B、C的多元二次回歸模型，擬合回歸方程如下：

氟蟲腈擬合方程：R=121.4+1.86A-0.58B-0.74C-0.12A2-0.006 1B2+0.052C2+0.058AB-0.076AC+0.022BC。

氟甲腈擬合方程：R=175.4-3.81A-0.31B-1.85C-0.01B2+0.063AB+0.049BC。

氟蟲腈砜擬合方程：R=194.4-5.61A-0.46B-3.749C+0.076A2-0.006 9B2+0.13C2+0.052AB+0.033BC。

氟蟲腈亞砜擬合方程：R=141.6-1.80A-0.2B-2.315C-0.009 2B2+0.046AB-0.11AC+0.05BC。

為檢測二次回歸模型的有效性，對回歸方程進行方差分析和顯著性檢測，結果如表4所示，4 種模型的P值均小于0.01，說明該回歸模型影響極顯著，3 個自變量乙腈提取體積（A）、Z-Sep+（B）、MWCNT（C）在4 種模型中的P值均小于0.01，說明以上變量對回收率影響極顯著，在相應的置信水平下，擬合模型的F值超過ANOVA表中F值的1.5 倍，表明該模型影響顯著[29]。4 種分析物的模型F值均大于1.5 倍F0.95（F0.95=3.63），且回歸系數(shù)R2和調整回歸系數(shù)值高（氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜模型對應R2分別為0.993 6、0.975 4、0.982 6、0.985 7，分別為0.982 2、0.931 1、0.951 4、0.959 9）表明因變量和3 個自變量之間的多元回歸關系很顯著，擬合度好，可用于分析和預測各因素對4 種分析物回收率的影響。

表4 二次模型方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial model

根據(jù)擬合的回歸方程式進行響應面分析，并繪制變量之間相互作用的響應面圖，結果如圖3所示。響應面的斜率越大，表明該因素對結果的影響更大[30]。圖3a1可看出，氟蟲腈回收率隨著乙腈體積的增加而下降，隨著Z-Sep+質量先增加后降低；圖3a2可以看出，回收率隨乙腈體積或MWCNT質量的增加而增加，從曲線斜率看乙腈體積對回收率的影響更大；圖3a3可以看出，從曲面斜率看，BC交互影響因素比AC顯著。分析各交互因素對氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜對回收率的影響，分析結果與氟蟲腈結果相似。

通過Minitab 18軟件響應優(yōu)化器，當4 種化合物回收率目標為100%時，確定最佳QuEChERS條件為乙腈體積25 mL、Z-Sep+質量50 mg和MWCNT質量13 mg，該最優(yōu)條件下氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜的回收率預測值分別為108.3%、103.2%、100.0%、100.0%。采用優(yōu)化后的參數(shù)進行驗證實驗，經(jīng)6 次平行實驗后測得平均回收率分別為98.8%、98.5%、97.7%、102.2%，除氟蟲腈差異較大，其余3 種化合物與模型預測值差異不明顯；說明擬合模型優(yōu)化出的QuEChERS條件較為準確。

圖3 各因素交互作用對回收率影響的響應面圖Fig. 3 Response surface plots showing the interactive effects of the selected variables on the recovery of analytes

2.5 基質效應

表5 氟蟲腈及其代謝物基質效應、檢出限、定量限Table 5 Matrix effects, LODs and LOQs for fipronil and its metabolites

考察氟蟲腈及其代謝物在雞肝、雞肉、雞蛋3 種食品中的基質效應，結果見表5。從不同樣品基質看，雞肝的基質效應最大，4 種化合物的基質效應在82.3%～87.25%之間，呈基質抑制效應，其次為雞蛋，雞肉中基質效應最小，基本不存在干擾，與寧霄[20]、郝杰[23]等研究相比，基質效應大大降低。從檢測對象看，氟蟲腈的基質效應最大，呈基質抑制效應，其次為氟甲腈，其余2 種基質效應不明顯。為克服基質效應，本研究使用基質加標法進行定量測定。

2.6 方法學驗證

2.6.1 方法的線性、檢出限、定量限結果

添加不同質量濃度混合標準溶液至空白樣品進行測試，以目標峰RSN=3時確定為檢出限，RSN=10為定量限，3 種樣品基質中4 種化合物的具體結果見表5。在0.1～5 μg/L質量濃度范圍內，氟蟲腈及其代謝物的線性關系良好，線性相關系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.1～0.2 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg，低于GB 2763—2019規(guī)定禽肉類最大殘留限量0.01 mg/kg，禽蛋及禽類內臟則為0.02 mg/kg。

2.6.2 方法的回收率與精密度

選取雞肉、雞蛋、雞肝3 種空白樣品，不同添加量的混合標準溶液，使添加量達到0.5、2、25 μg/kg，每個添加水平平行6 次，計算各化合物的平均回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），由表6可知，4 種化合物在雞蛋平均加標回收率在78.9%～113.5%之間，RSD在2.10%～7.60%之間，方法具有較好的回收率和重復性。證明此樣品前處理方法及超高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法靈敏、準確、有效，適用于禽源性食品中氟蟲腈及其代謝物殘留的同時測定。

表6 雞蛋、雞肝、雞肉基質中氟蟲腈及其代謝物平均回收率和精密度（n= 6）Table 6 Average recoveries and precision of fipronil and its metabolites from spiked egg, chicken liver, and chicken (n= 6)

2.6.3 實際樣品分析結果

隨機購買市售雞肝、雞肉、雞蛋共20 份樣品，應用本方法測定氟蟲腈及其代謝物殘留，樣品中均未檢出氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈亞砜殘留，有一份雞蛋中檢出氟蟲腈砜0.81 μg/kg，未超過GB 2763—2019中所規(guī)定氟蟲腈在雞蛋中的最大殘留限量20 μg/kg。陽性樣品提取離子色譜圖如圖4所示。

圖4 陽性樣品的氟蟲腈（a）、氟甲腈（b）、氟蟲腈砜（c）和氟蟲腈亞砜（d）的定量離子提取離子流圖Fig. 4 Extracted ion chromatograms of fipronil (a), fipronil desulfinyl (b),fipronil sulfone (c) and fipronil sulfide (d) in positive samples

3 結 論

本研究將QuEChERS新型凈化材料Z-Sep+、MWCNT用于禽源性食品樣品前處理，通過Plackett-Burman試驗和響應面Box-Behnken方法確定最佳前處理條件，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定禽源性食品中氟蟲腈及其代謝物殘留的分析方法。本方法前處理速度快，無需復雜凈化手段，基質效應小，經(jīng)方法學驗證，該方法的回收率、精密度、線性、定量限、檢出限等均滿足痕量殘留檢測的要求，可用于禽源性食品中氟蟲腈及其代謝物殘留的快速定量測定。