韓金志，姚思羽，沈 昊，孟曉潔，朱秋享，汪少蕓

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院, 福建 福州 350108)

0 引言

乳酸菌已廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵與保鮮，大量研究表明，部分乳酸菌如植物乳桿菌、 棒狀乳桿菌、 德氏乳桿菌等可產(chǎn)生胞外細(xì)菌素(抗菌肽)[1-4]. 目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于Plantaricin、 Lactococcin、 Lactocin等乳酸菌源細(xì)菌素的分離純化、 結(jié)構(gòu)鑒定與抑菌活性等研究已有大量報(bào)道[5-6]. 乳酸菌細(xì)菌素因具有來源廣、 抗菌活性強(qiáng)、 安全性高等特點(diǎn)，是一類具有廣闊開發(fā)前景的綠色生物抗菌劑[2].

研究發(fā)現(xiàn)，大部分乳酸菌細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陽性菌(G+菌)具有抑菌活性，僅少數(shù)細(xì)菌素如Plantaricin MG、 Lactocin XN8-A等可抑制革蘭氏陰性菌(G-菌)[5, 7]. 不同乳酸菌源細(xì)菌素的抑菌作用靶點(diǎn)和主要抗菌途徑存在差異，對(duì)于G+菌主要通過破壞菌體細(xì)胞壁膜，使核酸、 蛋白質(zhì)、 離子等細(xì)胞內(nèi)容物泄漏或阻礙細(xì)胞壁合成等，導(dǎo)致細(xì)胞死亡. 如Lacticin Q可快速結(jié)合到菌體細(xì)胞膜外側(cè)，并由細(xì)胞膜外側(cè)向內(nèi)側(cè)遷移形成類似脂質(zhì)觸發(fā)器結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞膜上形成巨大環(huán)孔，導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)泄露[8]. Lactococcin A等Ⅱa型細(xì)菌素可以與甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)結(jié)合，在細(xì)胞膜上形成孔洞，造成離子泄漏，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9-10]. Nisin通過與細(xì)胞壁主要組分肽聚糖合成中的重要中間物脂質(zhì)Ⅱ結(jié)合從而抑制其生物合成； 此外，Nisin與脂質(zhì)Ⅱ靶向結(jié)合，在細(xì)胞上膜形成孔洞，導(dǎo)致菌體溶解死亡[11-12]. 也有少數(shù)乳酸菌細(xì)菌素以菌體DNA、 生物被膜等為作用靶點(diǎn)，發(fā)揮抗菌作用. 如來源于干酪乳桿菌的細(xì)菌素F1可通過破壞菌體細(xì)胞膜并與DNA結(jié)合兩種途徑作用于金黃色葡萄球菌[13]. Lactocin AL705可作為群體感應(yīng)抑制劑阻礙單增李斯特菌形成生物被膜從而發(fā)揮抑菌作用[14]. 目前，關(guān)于乳酸菌細(xì)菌素對(duì)G-菌抗菌作用途徑研究的報(bào)道較少. 研究表明，此類細(xì)菌素主要通過破壞菌體細(xì)胞膜或干擾外膜正常生理功能等對(duì)G-菌發(fā)揮抑菌作用. 如Lactocin XN8-A主要以菌體的細(xì)胞壁膜為作用靶點(diǎn)，形成壁膜穿孔，對(duì)大腸桿菌發(fā)揮抑菌作用[6]. Plantaricin MG可消除鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞膜上的跨膜電位(ΔΨ)和pH梯度(ΔpH)，并形成離子通道導(dǎo)致K+、 磷酸鹽、 ATP以及紫外吸收物質(zhì)等泄漏[15]. 當(dāng)Nisin與EDTA聯(lián)用時(shí)，EDTA螯合細(xì)胞外膜脂多糖中的Mg2+使脂多糖流失并導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增大，從而賦予Nisin對(duì)沙門氏菌等G-菌的抑菌作用[16].

目前，只有乳酸鏈球菌素(Nisin)和Pediocin PA-1兩種乳酸菌源細(xì)菌素被批準(zhǔn)可用作食品防腐劑，但在我國(guó)僅Nisin被允許應(yīng)用于食品，而Nisin只對(duì)G+菌具有抑菌活性，限制了其在以G-菌為優(yōu)勢(shì)腐菌的食品保鮮中的應(yīng)用. 本研究著重探討從傳統(tǒng)酸菜中篩選出一株產(chǎn)生細(xì)菌素且對(duì)G+菌與G-菌具有較強(qiáng)抑菌活性的植物乳酸菌，并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)生的植物乳桿菌素進(jìn)行分離純化、 結(jié)構(gòu)鑒定及抑菌活性檢測(cè)，可為從我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中發(fā)掘乳酸菌細(xì)菌素提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1材料

產(chǎn)自吉林省榆樹市的傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜.

1.1.2試劑

LB肉湯培養(yǎng)基、 MRS肉湯培養(yǎng)基產(chǎn)自廣東環(huán)凱生物科技有限公司； 乳酸菌鑒定生化管購自青島海博生物技術(shù)有限公司； 氯化鈉、 瓊脂粉、 葡萄糖購自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司； 細(xì)菌DNA提取試劑盒購自美國(guó)Omega Bio-Tek公司； 乳酸鈉鏈球菌素(Nisin)購自上海麥克林生化科技有限公司.

1.1.3菌種

本實(shí)驗(yàn)中所使用指示菌的名稱、 編號(hào)、 培養(yǎng)條件以及來源等詳細(xì)信息見表1.

表1 指示菌信息

1.2 試驗(yàn)設(shè)備與儀器

本實(shí)驗(yàn)中所用到的主要儀器設(shè)備具體見表2.

表2 主要儀器與設(shè)備

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1產(chǎn)抗菌物質(zhì)乳酸菌的篩選

取10 g泡菜經(jīng)破碎，加入無菌生理鹽水梯度稀釋后，涂布于MRS固體平板上，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)18 h. 挑取單菌落置于MRS液態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，離心取上清，排除有機(jī)酸、 過氧化氫等物質(zhì)干擾后，以金黃色葡萄球菌為指示菌通過測(cè)定抑菌圈，篩選產(chǎn)抑菌物質(zhì)的菌株.

1.3.2主要生化反應(yīng)鑒定

菌株劃線接種于MRS瓊脂平板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用接種針挑取單菌落分別接種于七葉苷、 纖維二糖、 麥芽糖、 甘露醇等生化管中，用封口膜密封，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h.

1.3.3植物乳桿菌FZU122的16SrDNA測(cè)序分析

植物乳桿菌FZU122接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃條件下經(jīng)活化、 轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期. 取1～2 mL培養(yǎng)液9 600 r·min-1離心1 min，棄上清，菌體細(xì)胞使用細(xì)菌總DNA提取試劑盒，參照說明書提取利用總DNA. 采用16 S rDNA基因引物[F(5’- AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)，R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)] 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5 μL PCR產(chǎn)物以0.01 g·mL-1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳.

1.3.4植物乳桿菌FZU122產(chǎn)抗菌物質(zhì)抑菌譜檢測(cè)

植物乳桿菌FZU122接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，離心取上清，分別以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、 阪崎克羅諾腸桿菌、 鼠傷寒沙門氏菌等為指示菌，測(cè)定抑菌圈.

1.3.5醇沉水提法分離菌株FZU122發(fā)酵液細(xì)菌素

發(fā)酵液經(jīng)9 600 r·min-1條件下4 ℃離心10 min，得到發(fā)酵液上清，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45 ℃條件下將其體積濃縮5～10倍. 在濃縮發(fā)酵液中加入95%無水乙醇，攪拌均勻，最終使無水乙醇的濃度為75%，于4 ℃靜置醇沉12 h； 離心后棄去沉淀，保留上清，45 ℃條件下旋蒸濃縮3～5倍.

1.3.6SephadexLH-20凝膠層析分離FZU122細(xì)菌素

取50 g Sephadex LH-20干粉于65%(體積分?jǐn)?shù)，以下同)乙醇中浸泡24 h，充分溶脹，裝填入層析柱. 以超純水(UP水)作為流動(dòng)相，流速設(shè)定為0.5 mL·min-1，開啟蠕動(dòng)泵，平衡2～3個(gè)柱體積后，將流動(dòng)相改為20%色譜級(jí)甲醇，將紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)調(diào)節(jié)至280 nm，平衡至少2個(gè)柱體積至吸光值不變并調(diào)零. 樣品稀釋2倍，并過0.45 μm濾膜. 上樣5 mL，用20%色譜級(jí)甲醇作為流動(dòng)相，以0.2 mL·min-1等度洗脫，每管收集10 min，并檢測(cè)各管洗脫液的抑菌活性.

1.3.7RP-HPLC分離純化FZU122細(xì)菌素

將上述具有抑菌活性的組分，在50 ℃條件下旋蒸濃縮1倍左右，經(jīng)0.22 μm濾頭過濾. 流動(dòng)相A設(shè)定為UP水，流動(dòng)相B為色譜級(jí)甲醇. 梯度洗脫條件：0～30 min，甲醇5%～100%； 流速1 mL·min-1； 進(jìn)樣量20 μL，柱溫為室溫. 收集各個(gè)洗脫峰，濃縮后采用微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定多肽濃度，并以鼠傷寒沙門氏菌為指示菌，測(cè)定抑菌圈.

1.3.8Plantaricin-fzu122結(jié)構(gòu)鑒定

收集抑菌活性物質(zhì)送至上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心，依據(jù)已報(bào)道的技術(shù)方法[17-18]采用納升液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀表征細(xì)菌素分子量、 氨基酸序列.

1.3.9Plantaricin-fzu122最小抑菌濃度測(cè)定

參考Han等[19]報(bào)道的方法測(cè)定Plantaricin-fzu 122對(duì)以上菌株的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC). 指示菌株接種至LB液體培養(yǎng)基37 ℃、 180 r·min-1條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，以新鮮的LB液體培養(yǎng)基將菌體細(xì)胞數(shù)值調(diào)至108(OD600=0.4～0.5)，進(jìn)一步稀釋至105待用； 細(xì)菌素Plantaricin-fzu 122(純度≥90%)經(jīng)LB液體培養(yǎng)基稀釋不同濃度后，以50 μL菌液和50 μL不同濃度抗菌肽溶液置于96孔板板孔內(nèi)混合均勻，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，通過酶標(biāo)儀測(cè)定菌液OD600值，以沒有菌體生長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)的細(xì)菌素濃度即為細(xì)菌素對(duì)于該菌株的MIC，同時(shí)以Nisin為陽性對(duì)照組.

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)抗菌物質(zhì)的乳酸菌篩選結(jié)果

圖1 瓊脂擴(kuò)散抑菌試驗(yàn)篩選結(jié)果 Fig.1 Results of antimicrobial test by well agar diffused method

以金黃色葡萄球菌為指示菌，經(jīng)測(cè)定抑菌圈初步篩選得到98株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的菌株(見圖1). 其中，62株菌的發(fā)酵液上清抑菌圈直徑在8～10 mm之間，36株菌的發(fā)酵液上清抑菌圈直徑均大于10 mm. 由發(fā)酵液上清抑菌圈直徑均大于10 mm的菌株中選擇其一進(jìn)行后續(xù)研究，根據(jù)其初期編號(hào)將這株菌株命名為FZU122.

2.2 生物學(xué)鑒定結(jié)果

乳酸菌FZU122的生化檢測(cè)結(jié)果如表3所示，株菌FZU122在所測(cè)試碳的水化合物中經(jīng)發(fā)酵后均呈陽性，可初步判定菌株FZU122屬于乳桿菌屬.

表3 乳酸菌FZU122的生化檢測(cè)結(jié)果

圖2 乳酸菌FZU122總DNA的葡聚糖凝膠電泳圖Fig.2 Sephadex gel electrophoresis of total DNA of Lactobacillus FZU122

菌株FZU122總DNA經(jīng)16 S rDNA基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.01 g·mL-1瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果(見圖2)顯示PCR產(chǎn)物在1 500 bp處有一條明顯條帶.

菌株FZU122的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示為一段由1 503 bp核苷酸組成的堿基序列. 經(jīng)同源性比對(duì)，并采用MEGA X 10.1構(gòu)建菌株FZU122的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖3)，結(jié)果表明菌株FZU122經(jīng)鑒定為一株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，可命名為植物乳桿菌FZU122(L.plantarumFZU122).

圖3 乳酸菌FZU122系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree derived from the 16S rDNA sequence of Lactobacillus plantarum FZU122

2.3 L. plantarum FZU122的發(fā)酵液上清抑菌譜

圖4 L. plantarum FZU122發(fā)酵液上清的抑菌譜Fig.4 Antimicrobial spectrum of the fermentation supernatant of L. plantarum FZU122

L.plantarumFZU122的發(fā)酵液上清抑菌譜如圖4所示，L.plantarumFZU122的發(fā)酵液上清對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、 豬霍亂沙門氏菌、 鼠傷寒沙門氏菌、 腸炎沙門氏菌、 阪崎克羅諾腸桿菌等食源性致病菌均具有抑菌活性. 這表明L.plantarumFZU122在發(fā)酵液中產(chǎn)生具有抑菌活性的物質(zhì).

2.4 Sephadex LH-20凝膠分離

L.plantarumFZU122發(fā)酵液粗提物經(jīng)Sephadex LH-20凝膠色譜分離，各組分抑菌結(jié)果如圖5所示. 由圖5可見，第58管到第62管中的分離組分具有抑菌活性. 將抑菌活性較強(qiáng)的第60管分離組分合并收集，并采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后置于4 ℃保存?zhèn)溆?

2.5 HPLC分析譜圖及不同組分的抑菌活性

將上述經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離的組分，采用反相HPLC進(jìn)一步分離并獲得不同組分的圖譜. 收集不同保留時(shí)間的組分，經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥后采用UP水復(fù)溶，經(jīng)抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，其中3號(hào)峰對(duì)應(yīng)的分離組分對(duì)鼠傷寒沙門氏菌具有抑菌活性，如圖6所示. 收集3號(hào)峰分離組分備用.

圖5 發(fā)酵液粗提物經(jīng)分離后各管分離液的抑菌圈Fig.5 Inhibition zones of the fractions in different tubes isolated from the fermentation supernatant

圖6 粗提物經(jīng)HPLC分析圖譜及不同組分的抑菌活性Fig.6 HPLC analysis of the crude extract and the antibacterial activity of different fractions

2.6 細(xì)菌素Plantaricin-fzu 122的質(zhì)譜分析結(jié)果

采用納升液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)上述3號(hào)峰分離組分進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖7所示. 結(jié)果顯示，鑒定到一條由10個(gè)氨基酸組成的多肽，其氨基酸序列為ARLGLPVHVV，相對(duì)分子質(zhì)量為1 059.655 3，并帶有2個(gè)正電荷，將其命名為Plantaricin-fzu 122.

圖7 L. plantarum FZU122產(chǎn)細(xì)菌素Plantaricin-fzu 122的質(zhì)譜分析結(jié)果Fig.7 QTrap LC-MS/MS of the fragment of Plantaricin-fzu 122 produced by L. plantarum FZU122

2.7 細(xì)菌素Plantaricin-fzu 122的最小抑菌濃度

最小抑菌濃度是常用于評(píng)估抗菌素抑菌活性的一項(xiàng)重要指標(biāo)，列于表4. Plantaricin-fzu 122對(duì)12株指示菌均表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性: 對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的最小抑菌濃度為8 μg·mL-1，對(duì)于大腸埃希氏菌 ATCC25922、 甲型副傷寒沙門氏菌CMCC(B) 50093以及金黃色葡萄球菌ATCC 29213的最小抑菌濃度為32 μg·mL-1，對(duì)于其他指示菌的最小抑菌濃度則均為16 μg·mL-1. 其中，Plantaricin-fzu 122對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC與Nisin相近，表明該細(xì)菌素對(duì)食品中常見致病菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性.

表4 Plantaricin-fzu 122的最小抑菌濃度

3 結(jié)語

微生物的污染繁殖與代謝活動(dòng)是引起食品腐敗變質(zhì)與食源性疾病的最主要原因之一. 化學(xué)合成類食品防腐劑因存在食品安全風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)掘、 綠色、 安全的乳酸菌源細(xì)菌素，用于食品防腐保鮮，控制食源性致病菌的滋生與污染，保障食品安全具有重要意義. Plantaricin-fzu 122是一種具有新氨基酸序列的植物乳桿菌素，綠色安全且抑菌譜廣、 抗菌活性強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌、 沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌等多種食源性腐敗與致病菌均具有良好的抑菌活性，是一類具有廣闊開發(fā)潛力與應(yīng)用前景的生物源食品防腐劑.