李 瑩， 夏麗丹， 包明琢， 張燕林， 周垂帆

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，福建 福州350003；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，福建 福州350003；3.福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州350002；4.福建長汀紅壤丘陵生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，福建 福州350002)

近年來，生物質(zhì)炭作為一種高效、經(jīng)濟友好的土壤改良劑，在增加土壤碳封存、改善土壤質(zhì)量、提高作物產(chǎn)量和保證糧食安全等方面受到廣泛關(guān)注[1-2].生物質(zhì)炭常見的制備方式主要包括高溫限氧熱解[1]和水熱碳化[3].目前，常規(guī)高溫限氧獲得的裂解炭在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域的應用研究更為廣泛[1-2].但近年來，水熱炭由于其制備原料不受水分含量的限制[3-4]，且在制備過程中具有產(chǎn)率高、耗能低、CO2釋放量少等優(yōu)勢，在能源嚴重短缺的當下受到越來越多的關(guān)注[5].與裂解炭相比，水熱炭具有許多不同的結(jié)構(gòu)和表面特征，如弱酸性、低孔隙率、較低的熱穩(wěn)定性和更強的疏水性等[4，6-7].水熱炭的能源優(yōu)勢和環(huán)保特性使其在土壤改良領(lǐng)域具有廣闊的應用前景.

生物質(zhì)炭的施入對土壤關(guān)鍵功能的生態(tài)效應已成為許多研究的重要課題.但相對于裂解炭研究的廣泛性，對水熱炭的相關(guān)研究則明顯匱乏.水熱炭通常呈弱酸性[7]，且具有更多的含氧官能團和較不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[5]，在進入土壤后會釋放出較高濃度的可溶性有機質(zhì)，可能對土壤環(huán)境產(chǎn)生危害[6].同時也有研究發(fā)現(xiàn)，水熱炭攜帶大量潛在的有害物質(zhì)(如呋喃、糠醛、酚類和一些金屬)，對生物表現(xiàn)出一定毒性[7-8].由于相關(guān)研究缺乏，不同水熱炭對土壤環(huán)境的影響效應亟需進一步研究確定.

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的部分，在提高土壤質(zhì)量方面發(fā)揮著重要作用.其中，土壤細菌占到微生物組分的70%～90%，被公認為是土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預警和敏感指標[9].良好的土壤細菌群落結(jié)構(gòu)能夠改善土壤理化性質(zhì)、提高土壤肥力，從而起到改良土壤的作用[10]，O′neill et al[11]研究表明，生物質(zhì)炭可以豐富土壤細菌群落，提高土壤微生物多樣性.烏英嗄等[12]研究也表明，施用生物炭能夠改變土壤原有細菌群落組分，在增加了一些特異細菌種類的同時，還在一定程度上抑制了原有細菌的生長.但目前關(guān)于生物質(zhì)炭對土壤微生物群落影響的報道基本都是關(guān)于裂解炭的，而鮮有對水熱炭的相關(guān)研究，這極大地限制了水熱炭在土壤生態(tài)改良中的應用和推廣.

鐵氧化物是土壤重要的組成部分，廣泛存在于自然界中[13].眾多研究證實，鐵氧化物表面帶有可變電荷，比表面積較大且活性較高，可通過表面吸附改變化學物質(zhì)的環(huán)境行為[14-15]；更重要的是，鐵氧化物的礦物學機制控制著生態(tài)環(huán)中的營養(yǎng)、有害元素和化合物的生物地球化學循環(huán)[16]，尤其對土壤有機碳的穩(wěn)定和周轉(zhuǎn)起著關(guān)鍵性作用[17].那么，鐵氧化物的存在是否會導致生物質(zhì)炭(尤其是水熱炭)對土壤環(huán)境的影響發(fā)生變化，是否會消除水熱炭對土壤環(huán)境的負面效應，目前尚不可知.基于此，本研究選用北方農(nóng)田棕壤土，采用土壤中廣泛存在的針鐵礦，即羥基氧化鐵，分別添加水熱炭、裂解炭、玉米秸稈、鐵氧化物開展室內(nèi)培養(yǎng)試驗，研究鐵氧化物與不同制備方式產(chǎn)生的生物質(zhì)炭對土壤理化性質(zhì)的影響.采用高通量測序手段研究不同處理下土壤細菌豐富度、群落組成及結(jié)構(gòu)，分析不同制備方式產(chǎn)生的生物質(zhì)炭及其與鐵氧化物的混合物對土壤細菌群落的影響，旨在進一步為生物質(zhì)炭應用于改良生態(tài)環(huán)境提供一定的依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品來源

供試土壤樣品取自山東省臨沂市沂南縣孫祖鎮(zhèn)孫祖五村(118°35′E，35°52′N)表層土壤(0 ～20 cm)，該地位于山東省中南部，屬暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候，近5 a 年平均氣溫14.36 ℃，年平均降水量775.36 mm，年平均日照時數(shù)2 149.2 h，該區(qū)主要農(nóng)作物為稻谷.鮮土取回后，去除混雜的石塊和植物殘留根系，過2 mm 篩后置于4 ℃待用.其中，土壤pH 為5.84，可溶性有機碳含量為51.62 mg·kg-1，全磷和全鉀含量分別為1.82 和56.68 g·kg-1，有效磷和有效鉀含量分別為25.65 和152.01 mg·kg-1.

1.2 外源添加物的制備

鐵氧化物(α-FeOOH)的制備:參照謝發(fā)之等[18]的方法制備.在現(xiàn)配的50 mL 1 mol·L-1Fe(NO3)3中，邊攪拌邊迅速加入90 mL 5 mol·L-1KOH，待生成紅褐色的Fe(OH)3后，再加入860 mL 純水攪拌均勻后密封置于70 ℃的恒溫干燥箱中陳化反應60 h.反應結(jié)束后取出冷卻，洗滌沉淀物至洗滌液呈中性，70 ℃下干燥后用研缽磨細過0.1 mm 篩備用.

玉米秸稈的制備:取北方農(nóng)田廢棄物玉米秸稈，用純水洗凈后烘干、粉碎過1 mm 篩備用.

水熱炭的制備:以過1 mm 篩的玉米秸稈粉末為原料，在1 L 的水熱反應釜中以1 ∶10 的比例(質(zhì)量比)加入秸稈和純水，在250 ℃自生壓力下，經(jīng)水熱反應獲得秸稈水熱炭.

裂解炭的制備:以過1 mm 篩的玉米秸稈粉末為原料，將其盛入500 mL 的有蓋坩堝中，在馬弗爐中于500 ℃下炭化4 h 獲得秸稈裂解炭.

玉米秸稈、水熱炭和裂解炭的基本性質(zhì)見表1.

表1 不同生物質(zhì)炭、玉米秸稈的基本性質(zhì)Table 1 Basic properties of biochar and maize straw

1.3 試驗設計

試驗共設置8 個處理，即空白對照(CK)、添加3%水熱炭(HC)、添加3%裂解炭(BC)、添加3%玉米秸稈(MS)、添加1%鐵氧化物(Fe)、添加3%水熱炭與1%鐵氧化物的混合物(HC-Fe)、添加3%裂解炭與1%鐵氧化物的混合物(BC-Fe)、添加3%秸稈與1%鐵氧化物的混合物(MS-Fe)，每個處理重復4 次.土壤培養(yǎng)試驗參考Schulz et al[19]的方法.稱取100 g 過2 mm 篩的鮮土分別與水熱炭、裂解炭、玉米秸稈等外源添加物混合，置于三角瓶中，用保鮮膜封口并用尖頭鑷子在瓶口扎4～6 個小洞以供土壤有氧呼吸，最后置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行無光照培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每隔2～3 d 稱重補水，使土壤水分含量保持在田間持水量的70%，培養(yǎng)120 d 后結(jié)束培養(yǎng)，一部分土樣保存于4 ℃下，用于土壤理化性質(zhì)的測定，另一部分保存于-80 ℃下，用于高通量測序分析土壤細菌群落組成.

1.4 土壤理化指標的測定

土壤pH 采用電位法測定，水土比為2.5 ∶1(質(zhì)量比).硝態(tài)氮()和銨態(tài)氮()用2 mol·L-1KCl 浸提，有效磷用0.03 mol·L-1NH4F— 0.025 mol·L-1HCl 浸提，均采用SAN++全自動連續(xù)流動分析儀(荷蘭斯卡拉公司)測定；可溶性有機碳用2 mol·L-1KCl 浸提，采用TOC 測定儀(日本島津公司)測定；有效鉀用2 mol·L-1HNO3浸提，用TSW-990AFG 型原子吸收分光光度計(北京普析通用有限公司)測定.

1.5 土壤細菌16S rDNA 的擴增和高通量測序

采用MOBIO 強力土壤DNA 提取試劑盒提取DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的DNA，用Nano-Drop 2000 型超微量分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司)檢測樣品質(zhì)量，取30 ng 進行PCR 擴增.采用引物(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG、GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對16S rDNA V3～V4 區(qū)進行測序.PCR反應體系25 μL，含2 μL DNA、上下游引物各1 μL、3 μL BSA、12.5 μL 2×Taq Plus Master Mix、5.5 μL ddH2O.PCR 反應程序為:94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共28 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存.設置3 次生物學重復.將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒(愛思進公司)切膠回收PCR 產(chǎn)物，用Tris HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測，而后進行Miseq 文庫構(gòu)建，最后由北京奧維森科技有限公司使用Illumina Misep PE300 測序平臺進行高通量測序.

1.6 數(shù)據(jù)處理

Miseq 測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控、拼接及去除嵌合體、短序列后得到優(yōu)質(zhì)序列.利用Uclust 軟件，以97%的序列相似度標識并聚類為操作分類單元(operational taxonomic units， OTU)，采用RDP Classifier 算法對OTU 代表序列進行比對，得到每個OTU 對應的物種分類信息.通過基于方差分解法的主成分分析[18]反映處理間的距離，從而比較不同菌群組成的差異.基于OTU 聚類結(jié)果，使用QIIME 軟件計算樣品的Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù).利用Canoco 4.5 軟件對土壤性質(zhì)及土壤細菌群落的豐度做冗余分析，得到其中的相關(guān)關(guān)系.

本研究中的土壤理化性質(zhì)結(jié)果采用Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用IBM SPSS Statistics 23.0 統(tǒng)計軟件進行方差分析和Person 相關(guān)性分析，運用Excel 2010 軟件作圖.圖表中的數(shù)據(jù)均為平均值±標準偏差或標準誤差.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下土壤理化性質(zhì)的變化

由表2 可知:與CK 相比，單獨施用玉米秸稈、裂解炭和水熱炭均顯著提高了土壤可溶性有機碳和有效鉀的含量(P＜0.05)；單獨施用玉米秸稈和裂解炭顯著提高了土壤的pH(P＜0.05)，施用水熱炭未明顯改變土壤的pH；單獨施用裂解炭顯著提高了土壤和有效磷的含量，顯著降低了的含量(P＜0.05)，施用水熱炭顯著降低了含量，顯著提高了含量(P＜0.05).

表2 不同處理下土壤的理化性質(zhì)1）Table 2 Physical and chemical properties of soil under different treatments

相較于CK 處理，無論是否施用玉米秸稈或生物質(zhì)炭，施用鐵氧化物均顯著降低了土壤和有效磷的含量(P＜0.05).相較于MS 處理，混施鐵氧化物和玉米秸稈(MS-Fe 處理)顯著提高了土壤的pH 和含量，顯著降低了可溶性有機碳、NO-3-N、有效磷和有效鉀的含量(P＜0.05)；相較于BC 處理，混施鐵氧化物和裂解炭(BC-Fe 處理)并未顯著改變土壤的pH，但顯著降低了可溶性有機碳和的含量，提高了含量(P＜0.05)；相較于HC 處理，混施鐵氧化物和水熱炭(HC-Fe 處理)明顯降低了土壤和有效磷的含量(P＜0.05)，其他指標則無顯著變化.

2.2 不同處理對細菌群落多樣性的影響

本次測序各處理的覆蓋率均在97%以上，稀釋曲線趨于平穩(wěn)(圖1)，表明測序結(jié)果能夠較好地表示土壤樣品細菌群落組成的真實情況.Chao1 指數(shù)描述了樣本內(nèi)的物種數(shù)量(豐富度)，其值越大，表明群落豐富度越高；Shannon 指數(shù)用于表示微生物群落的多樣性，該指數(shù)越大，表明群落多樣性越高.

本研究不同處理下細菌的OTU 數(shù)目為977～1 594(表3).相較于CK，單獨施用鐵氧化物或裂解炭并未顯著改變土壤細菌的OTU 數(shù)目、Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)，且BC 處理的OTU 數(shù)目、Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)與BC-Fe 處理的差異不顯著.相較于CK，施用水熱炭顯著降低了OTU 數(shù)目、Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)(P＜0.05)，這表明水熱炭對土壤細菌有明顯的不利影響，導致微生物群落豐度和多樣性下降.相較于HC 處理，HC-Fe 處理顯著提高了OTU 數(shù)目和Chao1 指數(shù)(P＜0.05)，但對Shannon 指數(shù)的影響不明顯，這表明鐵氧化物能在一定程度上減輕水熱炭對細菌所帶來的不利影響.與CK 相比，單獨施用玉米秸稈顯著降低了OTU 數(shù)目、Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)(P＜0.05)，表明MS 處理對土壤細菌多樣性產(chǎn)生顯著的不利影響；相較于MS 處理， MS-Fe 處理導致OTU 數(shù)目、Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)不同程度地下降，且OTU 數(shù)目和Shannon 指數(shù)差異顯著(P＜0.05)，表明混施鐵氧化物導致這一不利影響加劇.

圖1 土壤細菌稀釋曲線Fig.1 Dilution curves of soil bacteria under different treatments

表3 不同處理下土壤細菌α 多樣性指數(shù)1）Table 3 α diversity index of soil bacteria under different treatments

2.3 不同處理下細菌OTU 數(shù)目的變化

韋恩圖能夠反映樣品組間共有與特有的OTU 數(shù)目，可直觀地反映樣品組間OTU 的重疊情況.在97%相似性水平上進行聚類分析繪制細菌OTU 數(shù)目分布韋恩圖(圖2)中，CK、HC、HC-Fe 處理間，CK、BC、BC-Fe處理間，CK、MS、MS-Fe 處理間共有的OTU 數(shù)目分別為1 140、1 671、1 404 個，表明CK、BC 處理和BC-Fe 處理三者之間土壤微生物組成的相似度相對更高.與CK 相比，HC、BC 和MS 處理特有的OTU 數(shù)目分別有41、111、54 個，HC-Fe、BC-Fe 和MS-Fe 處理特有的OTU 數(shù)目分別有59、34、43 個.可見，不同外源添加物處理下均出現(xiàn)新物種，改變了土壤細菌的群落組成.

圖2 不同處理下土壤細菌OTU 數(shù)目分布韋恩圖Fig.2 Venetian OTU under different treatments

2.4 不同處理對細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

基于OTU 數(shù)目的差異，通過主成分分析不同處理下土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的差異，樣本間的距離越近則表明樣本組成的相似度越高.由圖3 可知，主成分1 和2 對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變異的解釋量分別為52.66%、17.01%，兩者共解釋了69.67%的總變異.其中，HC 與HC-Fe 處理間，MS 與MS-Fe 處理間獨立聚集，均遠離CK；而Fe、BC、BC-Fe 處理則與CK 聚合在一起，這表明CK、Fe 處理、BC 處理和BC-Fe處理間的細菌群落結(jié)構(gòu)相似，而MS 處理與MS-Fe處理間、HC 處理與HC-Fe 處理間的細菌群落結(jié)構(gòu)較相似.以上3 組之間的細菌群落結(jié)構(gòu)存在較大差異，表明施用水熱炭和玉米秸稈對細菌群落結(jié)構(gòu)有較大影響，而施用裂解炭和鐵氧化物則對細菌群落結(jié)構(gòu)的影響相對較小.

2.5 不同處理對細菌群落組成的影響

在門分類水平上，變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門這5 類土壤細菌群落門類分別占到CK、Fe、HC、HC-Fe、BC、BC-Fe、MS、MS-Fe 處理總類群的94.37%、94.04%、95.86%、96.55%、94.09%、93.75%、93.27%、94.58%，為細菌優(yōu)勢菌門(圖4).與CK 相比，施用鐵氧化物顯著提高了放線菌門(增長率37%)的相對豐度，而降低了酸桿菌門(抑制率32.6%)的相對豐度.

圖3 不同處理下土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的主成分分析圖Fig.3 Principle component analysis of soil bacterial community structure under different treatments

圖4 不同處理下土壤細菌門水平下的群落組成Fig.4 Composition of soil bacteria at phylum level under different treatments

單獨施用水熱炭顯著提高了變形菌門(增長率109.5%)和放線菌門(增長率103.2%)的相對豐度，顯著降低了酸桿菌門(抑制率75.5%)、綠彎菌門(抑制率86.4%)和芽單胞菌門(抑制率88.3%)的相對豐度.相較于HC 處理，HC-Fe 處理使得被水熱炭抑制的酸桿菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門等的相對豐度在一定程度上有所提高，這表明鐵氧化物在一定程度上能夠緩解水熱炭對土壤微生物帶來的不利影響.與CK 相比，單獨施用裂解炭顯著提高了變形菌門(增長率28.3%)和芽單胞菌門(增長率41.0%)的相對豐度，而酸桿菌門(抑制率23.8%)和綠彎菌門(抑制率23.8%)等的相對豐度則明顯下降.與BC 處理相比，BC-Fe處理顯著提高了放線菌門的相對豐度，芽單胞菌門的相對豐度則顯著下降.與CK 相比，MS 處理顯著提高了變形菌門(增長率40.3%)和放線菌門(增加率42.7%)的相對豐度，降低了綠彎菌門(抑制率46.4%)、酸桿菌門(抑制率29.8%)和芽單胞菌門(抑制率23.5%)的相對豐度.相比于MS 處理，MS-Fe 處理除放線菌門的相對豐度顯著提高外，其他菌門都被不同程度地下降.

2.6 土壤理化性質(zhì)與細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的相關(guān)性

由表4 可知，土壤細菌OTU 數(shù)目、Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)均與土壤含量呈極顯著負相關(guān)，與土壤其他指標含量不相關(guān)，表明含量是影響土壤細菌群落物種豐度和多樣性的主要環(huán)境因子.

表4 土壤理化性質(zhì)與土壤細菌α 多樣性指數(shù)的相關(guān)系數(shù)1）Table 4 Correlation analysis between soil physical and chemical properties and soil bacterial α diversity index

為進一步了解土壤理化性質(zhì)與土壤細菌微生物群落的關(guān)系，對細菌門水平上前5 個菌群與土壤理化性質(zhì)進行冗余分析.結(jié)果(圖5)顯示:土壤pH、有效磷含量、有效鉀含量和含量之間呈顯著正相關(guān)，而與含量呈負相關(guān)；含量與可溶性有機碳含量之間呈正相關(guān).細菌變形菌門、放線菌門的相對豐度與含量、有效磷含量、有效鉀含量、pH 呈顯著正相關(guān)，與可溶性有機碳含量呈正相關(guān)，而與含量呈顯著負相關(guān)；芽單胞菌門、綠彎菌門、酸桿菌門的相對豐度與、有效磷、有效鉀、可溶性有機碳的含量呈顯著負相關(guān)，與含量呈顯著正相關(guān).綜上表明，土壤理化性質(zhì)與土壤優(yōu)勢細菌菌門群落的相對豐度、群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，土壤理化性質(zhì)的改變導致土壤優(yōu)勢細菌相對豐度、群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化.

圖5 土壤理化性質(zhì)與土壤細菌群落門水平下的冗余分析結(jié)果Fig.5 Redundancy analysis of soil physical and chemical properties and microbial community at phylum level

3 討論

3.1 玉米秸稈和兩種生物質(zhì)炭對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤細菌的α 多樣性指數(shù)可反映生境內(nèi)土壤細菌群落的豐富度和多樣性[20].普遍認為土壤細菌微生物多樣性的提高有利于提高土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和抗逆性.大量研究表明，裂解炭進入土壤后，其自身攜帶的養(yǎng)分可緩解細菌類群間的競爭，有利于細菌的繁殖和發(fā)育[12-20].但在本研究中，施用裂解炭對土壤細菌OTU 數(shù)目、Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)的影響不顯著，對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響也較小.這可能是由于本研究中的裂解炭自身結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，對土壤微生物的影響較緩慢.也有研究表明，生物炭對土壤細菌多樣性的影響具有高度的時間依賴性，新鮮生物炭進入土壤后，可在短時間內(nèi)快速提高細菌的多樣性和豐度，但隨著時間的推移，即使繼續(xù)添加裂解炭，這一影響也會持續(xù)減弱[21].此前，劉賽男[22]研究表明，在室內(nèi)培養(yǎng)實驗中，施用裂解炭對棕壤的細菌豐度和α 多樣性指數(shù)都無顯著的影響，但提高了紅壤的細菌多樣性.可見，裂解炭對細菌群落的影響還受土壤性質(zhì)的制約.

相較于裂解炭，施用水熱炭后土壤細菌群落的相關(guān)性信息還較缺乏.本研究中，單獨施用水熱炭顯著降低了土壤細菌的豐度和多樣性，接近Sun et al[23]的研究結(jié)果.Sun et al[23]研究表明:分別施用木質(zhì)和秸稈類水熱炭對土壤細菌豐富度均有明顯的負面效應，且隨著施用量的增加，負效應趨于顯著；水熱炭施用后導致土壤中具有多環(huán)芳烴降解活性的微生物數(shù)量顯著減少，而不穩(wěn)定碳分解者的微生物數(shù)量的增加，最終使得土壤有機碳中的芳香化合物含量增多，碳水化合物減少，極性下降是造成這一負向效應的重要原因.不同制備條件下產(chǎn)生的生物質(zhì)炭由于結(jié)構(gòu)與性質(zhì)不同，導致其對土壤微環(huán)境的影響存在較大差異[7].Person 相關(guān)分析顯示，土壤含量是影響細菌群落豐富度和多樣性的主要因素，這與殷全玉等[20]的研究結(jié)果一致.本研究中，施用水熱炭顯著提高了土壤含量，而裂解炭對其無顯著影響，這表明水熱炭可以通過改變土壤氮素利用率和提高含量來影響細菌群落豐富度和多樣性.相似地，侯朋福等[5]此前研究也表明，直接施用水熱炭到稻田土壤中有利于水稻對氮素的吸收利用.本研究結(jié)果顯示，施用玉米秸稈降低了土壤細菌群落豐富度和多樣性，可能是玉米秸稈的施入導致土壤中部分養(yǎng)分元素含量提高，有利于某些微生物種群形成優(yōu)勢類群，導致土壤微生物多樣性下降.

生物質(zhì)炭主要通過改善土壤理化性質(zhì)和生物質(zhì)炭自身結(jié)構(gòu)對土壤微生物產(chǎn)生影響.本研究中，門水平上的優(yōu)勢菌群為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門，這與前人在農(nóng)田土壤中得到的細菌優(yōu)勢類群[24]相似.此前，諸多研究表明，土壤碳的化學性質(zhì)是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的驅(qū)動力[20-21，25].不同性質(zhì)的碳源進入土壤后會被不同的微生物群落利用，進而導致微生物群落結(jié)構(gòu)變化存在明顯差異[21].本研究中，相對于裂解炭，單獨施用玉米秸稈和水熱炭對細菌微生物群落結(jié)構(gòu)的影響更明顯.單獨施用裂解炭、玉米秸稈和水熱炭均顯著提高了放線菌門、變形菌門的相對豐度，降低了酸桿菌門的相對豐度，但單獨施用裂解炭，以上菌門的變幅相對較小.放線菌門為富營養(yǎng)類群，能利用速效碳源快速生長[26]，也可以有效地降解復雜的芳香類化合物以獲取能量用于繁殖.本研究中，水熱炭和裂解炭都顯著增加了土壤可溶性有機碳含量，且水熱炭的增幅更大；同時，玉米秸稈和生物質(zhì)炭中均含有較多的纖維素和復雜的芳香物質(zhì)[26]；此外，Khodadad et al[27]研究表明，生物質(zhì)炭能夠為降解頑固碳源的微生物提供生長空間，這些條件均利于放線菌的快速繁殖.變形菌門作為細菌最大的門類，喜好在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中生長繁殖[12]，外源物質(zhì)的施用增加了土壤養(yǎng)分，有利于變形菌門的增殖[27].酸桿菌屬嗜酸性細菌[28]，本研究中，生物質(zhì)炭和玉米秸稈的施用均提高了土壤pH，導致酸桿菌受到抑制，而酸桿菌門的細菌多屬于寡營養(yǎng)類群，其相對豐度的下降被看作是土壤質(zhì)量提高的信號標志[29].

在單獨施用玉米秸稈、水熱炭和裂解炭的處理中，細菌優(yōu)勢菌門變化的差異主要集中在芽單胞菌門和綠彎菌門上.其中，施用裂解炭顯著提高了芽單胞菌門的相對豐度，卻降低了綠彎菌門的相對豐度；施用玉米秸稈后，以上兩個菌門相對豐度的變化正好相反；而施用水熱炭則同時降低了芽單胞菌門和綠彎菌門的相對豐度.土壤理化性質(zhì)與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[21].本研究冗余分析結(jié)果表明，芽單胞菌門、綠彎菌門與土壤、有效磷、有效鉀、可溶性有機碳、的含量均呈顯著的相關(guān)關(guān)系.從門水平優(yōu)勢細菌的相對豐度來看，變形菌門和放線菌門是單獨施用水熱炭的優(yōu)勢菌門，占到所有優(yōu)勢菌門的86%以上，而綠彎菌門和芽單胞菌門的相對豐度則顯著下降，導致土壤微生物多樣性下降.綠彎菌門相對豐度的下降不利于土壤碳氮的固定和土壤固持，同時，變形菌門包含諸多病原菌，其增加也可能給土壤環(huán)境帶來潛在危害.

3.2 鐵氧化物與生物質(zhì)炭混施對細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

本研究結(jié)果表明，無論是否與外源炭物質(zhì)混施，施用鐵氧化物均未顯著影響細菌群落結(jié)構(gòu).相較于HC處理，HC-Fe 處理下的細菌豐度和多樣性均有所提高，表明混施鐵氧化物能夠抵消一部分水熱炭對土壤環(huán)境的不利影響，提高土壤細菌的豐度和多樣性.但相較于MS 處理，MS-Fe 處理則顯著降低了土壤細菌OTU數(shù)目和Shannon 指數(shù)，Chao1 指數(shù)也有所下降，表明鐵氧化物加深了玉米秸稈對細菌群落的負面效應.

相較于單獨施用裂解炭、水熱炭和玉米秸稈，混施鐵氧化物后土壤放線菌門的相對豐度均顯著提高，表明鐵氧化物的施用刺激了放線菌門的生長.放線菌門對土壤有機質(zhì)分解、土壤磷活化和生物防治等方面均有重要影響，在提高農(nóng)業(yè)土壤質(zhì)量方面也具有重要意義[12].研究發(fā)現(xiàn)，放線菌分泌的胞外酶可以促進降解纖維素和復雜芳香物質(zhì)[26].Eusterhues et al[30]研究表明，土壤中的有機碳與鐵氧化物結(jié)合后，其礦化量和生物利用度明顯下降.據(jù)此推測鐵氧化物在進入土壤后可能通過與可溶性有機質(zhì)發(fā)生吸附或共沉淀作用形成相對較穩(wěn)定的鐵氧化合物，而后者被認定具有更穩(wěn)定的抗生物分解性，這在一定程度上可能刺激了放線菌門的繁殖.而放線菌門與可溶性有機碳含量之間的顯著相關(guān)性驗證了這一推測.此前，Huang et al[31]研究表明，施用鐵氧化物可在一定程度上降低土壤微生物對N 的同化，促進土壤的氨化作用，這與本研究結(jié)果相一致.可見，與單獨施用裂解炭相比，混施鐵氧化物后，土壤中芽單胞菌門的相對豐度顯著下降，而芽單胞菌門與含量之間呈較強的負相關(guān)性，表明混施鐵氧化物后土壤含量的明顯增加可能是導致BC-Fe 處理中芽單胞菌門相對豐度顯著下降的重要原因.

相比于MS 處理，MS-Fe 處理下，除放線菌門外的其他菌門都被不同程度地抑制，導致細菌群落的多樣性明顯下降.MS-Fe 處理下，土壤含量的增加可能是導致綠彎菌門、芽單胞菌門和酸桿菌門相對豐度下降的原因之一.MS 處理下，混施鐵氧化物對土壤理化性質(zhì)的影響相較于BC、HC 處理更明顯，土壤的pH 和含量顯著提高，而可溶性有機碳、、有效磷和有效鉀的含量顯著下降，導致作為土壤中富營養(yǎng)類群的變形菌門生長被抑制.Fe 的氧化還原特性對環(huán)境中N 和其他養(yǎng)分元素的生物地球化學循環(huán)產(chǎn)生重要影響.若土壤中存在大量活性碳物質(zhì)，微生物在利用鐵氧化物的過程中可直接利用碳源進行呼吸作用釋放更多的CO2，導致土壤中可利用碳源減少[25]，不利于富營養(yǎng)類群增殖.同時，鐵氧化物也被認為是影響硝化作用的因素之一，F(xiàn)e3+在被還原為Fe2+后可能通過電子傳遞將還原為，導致土壤含量下降.相較于裂解炭和水熱炭，玉米秸稈具有更高的生物利用性[32].因此，當玉米秸稈存在時，鐵氧化物的施用對土壤環(huán)境的影響更劇烈.

與HC 處理相比，HC-Fe 處理下，變形菌門的相對豐度顯著下降，表明水熱炭存在時，混施鐵氧化物對變形菌門有一定的抑制作用，降低了變形菌門相關(guān)病原體的相對豐度，同時提高了綠灣菌門的相對豐度，在一定程度上改良了土壤環(huán)境.與MS 處理不同，相較于HC 處理，混施鐵氧化物僅顯著降低了土壤和有效磷的含量，對其他土壤理化性質(zhì)則無顯著影響.水熱炭與鐵氧化物混施顯著提高了土壤細菌的豐富度，推測可能是鐵氧化物的施用有效吸附或降解了水熱炭中影響微生物活性的一些重金屬離子和有機化合物，其相關(guān)機理則需要進一步深入研究.

4 結(jié)論

(1)裂解炭處理下的土壤細菌豐度和多樣性均顯著高于水熱炭處理，且水熱炭處理顯著低于對照，表明水熱炭對細菌有一定的負面影響.單獨施用水熱炭和裂解炭均能在不同程度上提高土壤變形菌門和放線菌門的相對豐度，降低酸桿菌門和綠彎菌門的相對豐度，不同的是，施用裂解炭顯著提高了芽單胞菌門的相對豐度，而施用水熱炭則降低了芽單胞菌門的相對豐度.

(2)盡管施用水熱炭顯著降低了細菌的豐度和多樣性，但將水熱炭與鐵氧化物混施則顯著提高了細菌的豐度和多樣性.相較于單獨施用水熱炭，與鐵氧化物混施有利于綠彎菌門的生長，但對變形菌門有明顯的抑制作用，進而降低了變形菌門相關(guān)病原體的相對豐度.表明水熱炭存在時，混施鐵氧化物能夠抵消一部分水熱炭對土壤環(huán)境的不利影響.