生物樣品中多肽定量分析方法

韓寧娟，方歡樂(lè)，劉建利

（1.西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710125；2.西北大學(xué)生命科學(xué)院，陜西西安 710065）

肽類藥物在自然界中廣泛存在，一般都含有3～50個(gè)主要氨基酸。其中，氨基酸殘基數(shù)小于15的被稱為小分子肽。這些肽在各種生物系統(tǒng)中起著重要作用，參與細(xì)胞分化、神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)和腫瘤疾病的發(fā)生[1]。肽類藥物在體內(nèi)的代謝非常復(fù)雜，生物體中還存在著內(nèi)源性的物質(zhì)干擾，同時(shí)這類藥品的用劑量較小，體液中藥物濃度很低，這就要求檢測(cè)方法有較高的靈敏度和特異性。目前，生物樣品中肽類藥物檢測(cè)的方法主要有生物檢查法、免疫檢驗(yàn)法、同位素標(biāo)志示蹤法以及色譜等。本文從生物樣品處理、定量分析方法的特點(diǎn)兩方面綜合論述近年來(lái)的研究成果。

1 生物樣品的預(yù)處理方法

常見生物樣本有血漿、血清、尿液、唾液及組織等。小分子肽的理化性質(zhì)介于小分子化藥與大分子蛋白質(zhì)之間，生物樣品中經(jīng)常含有與小分子肽結(jié)構(gòu)相似的其他多肽類物質(zhì)（內(nèi)源性物質(zhì)），進(jìn)行色譜分析時(shí)會(huì)堵塞色譜柱，或干擾目標(biāo)物的分析。因此，分析時(shí)需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，減少對(duì)系統(tǒng)的污染，提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，同時(shí)可延長(zhǎng)色譜柱壽命，改善色譜組分行為。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)生物樣品預(yù)處理的方法主要有蛋白沉淀法、液液萃取法和固相提取等。

1.1 蛋白沉淀法

蛋白沉淀法是利用鹽析方法通過(guò)降低蛋白質(zhì)的溶解度，使蛋白質(zhì)凝聚從溶液中沉淀析出的一種方法。通過(guò)沉淀蛋白，不僅可以釋放結(jié)合到血漿蛋白中的藥物，從而達(dá)到提純待測(cè)組分的目的，也可測(cè)定藥物的總濃度，還能夠預(yù)防提取過(guò)程中蛋白質(zhì)發(fā)泡引起的乳化，保護(hù)分析儀器，延長(zhǎng)使用壽命。常用的沉淀蛋白質(zhì)的溶劑有甲醇、乙腈、三氯乙酸等。一般進(jìn)行蛋白沉淀有機(jī)溶劑的體積是樣品體積的數(shù)倍（最少2～3倍），經(jīng)過(guò)高速離心后吸取上清液直接進(jìn)樣分析或稀釋后進(jìn)樣分析。

1.2 液液萃取法

液液萃取是一種經(jīng)典的萃取方法，利用目標(biāo)物在溶劑中溶解度或分配系數(shù)上的差異達(dá)到分離提取目標(biāo)物的目的。在選用萃取溶劑時(shí)，利用相似相溶原則，對(duì)于非極性組分的樣品，可以以水為基質(zhì)，用與水互不相容的有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，防止帶入水溶性雜質(zhì)，且需滿足無(wú)毒、沸點(diǎn)低、易揮發(fā)和濃縮的條件。另外，液液萃取容易發(fā)生乳化現(xiàn)象。該方法優(yōu)點(diǎn)是回收率高、成本低，易去除無(wú)機(jī)鹽和磷脂，基質(zhì)效應(yīng)較??；缺點(diǎn)是比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力、有機(jī)溶劑消耗量大，對(duì)環(huán)境污染大，不容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化以及容易丟失被測(cè)組分等。

1.3 固相萃取法

固相萃取法是基于被測(cè)組分在流動(dòng)相與固定相之間分配系數(shù)不同而實(shí)現(xiàn)的。將被測(cè)組分吸附在固定相上，再選擇適當(dāng)?shù)娜軇_去雜質(zhì)，再用被測(cè)物質(zhì)溶解度好的溶劑進(jìn)行沖洗。操作時(shí)，可選用在負(fù)壓、正壓和常壓下完成。負(fù)壓下是有機(jī)溶劑揮發(fā)較易，有時(shí)待測(cè)物質(zhì)會(huì)丟失；正壓能縮短樣品的處理時(shí)間，但若加的壓力太大會(huì)導(dǎo)致溶劑流速變快，使分離效率降低；常壓操作費(fèi)時(shí)，使用較少。固相萃取的優(yōu)點(diǎn)是回收率高、選擇性好、效率高，但耗材費(fèi)用高，也容易堵塞萃取柱。

2 分析方法

目前，檢測(cè)生物樣本中的小分子肽有生物檢定法、酶聯(lián)免疫檢查法、放射免疫分析、電化學(xué)光譜和液質(zhì)聯(lián)用等分析方法。液質(zhì)聯(lián)用色譜法是多肽分析的常用方法之一；其余方法都是基于抗體分析/抗原特定性識(shí)別，對(duì)目標(biāo)多肽進(jìn)行定量分析，屬于結(jié)合配體分析方法，是多肽藥物分析的最常用方法。

2.1 配體結(jié)合分析法

配體結(jié)合分析法是檢測(cè)多肽的一種常用方法，是基于抗體分析/抗原特定性識(shí)別的一種定量分析目標(biāo)多肽的方法，主要包括酶聯(lián)免疫檢測(cè)法、放射免疫分析、電化學(xué)發(fā)光法等。

2.1.1 酶聯(lián)免疫檢測(cè)法

酶聯(lián)免疫檢測(cè)法是將被試藥物視為抗原，與標(biāo)記的抗體形成一種抗原-抗體復(fù)合物，最后加入酶標(biāo)底物。藥物抗原需要抗體才能識(shí)別，其方法有一定的特異性。該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、無(wú)放射性危害等優(yōu)點(diǎn)，但不能區(qū)分藥物活性和無(wú)活性形式，原型藥物及其代謝物。LINDSTR等[2]用ELISA法檢測(cè)人血漿中緩激肽，檢測(cè)范圍為0.1～1 000 nmol/L。

2.1.2 放射免疫分析法

放射免疫分析法是一種用同位素檢測(cè)的高敏度免疫抗原-抗體相結(jié)合的特殊反應(yīng)。Erb等[3]通過(guò)電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法確定血清素水平，并通過(guò)放射免疫檢測(cè)法確定血漿中西曲瑞克的濃度。周杏琴等[4]建立了放射免疫分析法檢測(cè)人血漿中特立帕肽，檢測(cè)濃度范圍10～1 280 pg/mL。

2.1.3 電化學(xué)發(fā)光

電化學(xué)發(fā)光是化學(xué)發(fā)光方法和電化學(xué)方法相結(jié)合，通過(guò)電化學(xué)方法產(chǎn)生一些特殊的物質(zhì)，電生物質(zhì)之間或電生物質(zhì)與其他物質(zhì)之間進(jìn)一步反應(yīng)而產(chǎn)生的一種發(fā)光現(xiàn)象，該方法具有靈敏度高、線性范圍寬、儀器簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

陳超等人[5]建立了一種定量測(cè)定人血清中胰島素的化學(xué)發(fā)光免疫方法，并進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià)，結(jié)果表明該方法的線性范圍在0～300 μIU/mL，最低檢測(cè)限可達(dá)0.08 μIU/mL。

2.2 色譜法

2.2.1 熒光試劑衍生化測(cè)定法

熒光分析法是利用物質(zhì)發(fā)射熒光的特性，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分析的光學(xué)分析法，比紫外檢測(cè)器的靈敏度高。若多肽類藥物在紫外檢測(cè)器下靈敏度低，無(wú)法進(jìn)行體內(nèi)分析，可與熒光試劑衍生化后，進(jìn)行熒光檢測(cè)。

徐鵬遙等[6]用4-(N-馬來(lái)酰亞胺)苯基三甲基碘化銨作為衍生化試劑，對(duì)血漿樣品進(jìn)行衍生化處理后，采用高效液相色譜法-質(zhì)譜法測(cè)大鼠血漿中谷胱甘肽的含量，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，衍生后谷胱甘肽定量下限為10 pmol/L。

2.2.2 液質(zhì)聯(lián)用分析（LC-MS）

液質(zhì)聯(lián)用由液相色譜與質(zhì)譜兩部分組成，采用色譜分離物質(zhì)，再由質(zhì)譜將化合物形成的離子和碎片離子，按荷質(zhì)比進(jìn)行分離檢測(cè)。該方法能夠探測(cè)到化合物分子量和結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息，用于定性和定量分析，但多肽類藥物易吸附于容器壁、吸管端及LC-MS系統(tǒng)中，導(dǎo)致樣品損失，使得儀器靈敏度降低。因此，在采用液質(zhì)聯(lián)用時(shí)要注意容器的材料、肽類結(jié)構(gòu)，還要注意溶液的濃度、pH、溫度和離子強(qiáng)度等。

Everaert等[7]建立了LC-MS法檢測(cè)人血漿和尿液中痕量鵝肌肽，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，在人血漿中檢測(cè)濃度范圍為5～500 μmol/L，人尿液中鵝肌肽的濃度為 0.5～100 μmol/L。

2.3 其他方法

二維凝膠電泳-質(zhì)譜法、高效毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用、同位素標(biāo)記技術(shù)等也逐步運(yùn)用在生物樣品中多肽類藥物分析中。

3 結(jié)語(yǔ)

在多肽藥物生物樣品的分析過(guò)程中，對(duì)于抗體試劑容易獲得的多肽類藥物，配體-抗體檢測(cè)法是生物樣品的首選方法；對(duì)于不易得到的抗體試劑，液質(zhì)聯(lián)用法可以滿足定量分析。鑒于多肽類藥物的特殊性，需要綜合運(yùn)用生物學(xué)、免疫學(xué)及理化分析等方法才能得到比較可靠的結(jié)果，更加準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的在線儀器聯(lián)用技術(shù)將成為今后的主要發(fā)展方向。