岳宗進(jìn)，劉汝銀，于露，王新立，馮仲鍇，王西彬，李云朋，許大勇

河南省中醫(yī)院脊柱科，鄭州 450000

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是指由高處墜落、車禍、手術(shù)等因素直接或間接引起的脊髓結(jié)構(gòu)和功能受損的臨床病癥[1]，可引起多種失調(diào)反應(yīng)，并可能導(dǎo)致永久性的神經(jīng)功能缺陷，給患者生活造成顯著影響[2]。SCI后的病理進(jìn)程受多種因素影響，包括炎癥反應(yīng)、鈣離子超載、微循環(huán)改變、細(xì)胞凋亡等，其中細(xì)胞凋亡是影響SCI進(jìn)程的重要因素[3]。赤芍是毛茛科植物芍藥的干燥根，主要活性成分為芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷等，總稱為赤芍總苷(total paeony glycoside，TPG)[4]。研究表明，赤芍可應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤、SCI等疾病的治療，具有抗腫瘤、抗炎以及調(diào)控細(xì)胞凋亡等作用[5-6]。目前關(guān)于赤芍在SCI中的治療作用報(bào)道較少，本研究通過建立SCI大鼠模型，探討TPG對(duì)SCI大鼠脊髓細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制，以期為赤芍用于SCI的臨床治療提供理論 依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組及SCI大鼠模型制備 健康SD大鼠18只，雌雄不限，體重220～300 g，由河南省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。標(biāo)準(zhǔn)飼料，分籠室溫飼養(yǎng)。隨機(jī)分為對(duì)照組、SCI組與TPG組，每組6只。采用Allen法制備SCI大鼠模型：大鼠用1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(45 mg/kg)，以背部T9為中心，縱向切開棘突并切除T9椎板，將脊髓暴露。在脊髓上放置0.3 cm×0.4 cm墊片，用10 g沖擊棒從5 cm高處自由墜落損傷脊髓，隨后縫合傷口。對(duì)照組大鼠切除椎板后，不予以脊髓打擊直接縫合。術(shù)后每日注射青霉素和生理鹽水進(jìn)行抗菌以及體液補(bǔ)充。TPG組在SCI模型建立成功后每24 h腹腔注射25 mg/kg TPG，SCI組和對(duì)照組腹腔注射同體積的生理鹽水，共28 d。動(dòng)物過程符合國家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用規(guī)定。

1.2 大鼠行為學(xué)評(píng)分 分別于傷后1、7、14、21、28 d，采用Basso-Beattie-Bresnahan (BBB)評(píng)分法對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測脊髓細(xì)胞凋亡情況 各組大鼠處理28 d后，麻醉開胸，暴露脊髓損傷點(diǎn)，以損傷點(diǎn)為中心切取脊髓2 cm。將脊髓加入預(yù)冷的蒸餾水制成組織勻漿，加入胰酶消化并收集脊髓細(xì)胞；加入1 ml 1×Annexin V結(jié)合緩沖液，800 r/min離心5 min，棄上清，用200 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；加入10 μl Annexin V-FITC(5 mg/L)和5 μl PI，混勻后置于37 ℃避光環(huán)境中孵育30 min。采用流式細(xì)胞儀檢測脊髓細(xì)胞凋亡情況(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)。

1.4 Western blotting檢測脊髓細(xì)胞凋亡蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達(dá) 取大鼠脊髓細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌3次。加入RIPA細(xì)胞蛋白裂解液后，用SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h。加入兔抗鼠cleaved caspase-3、cleaved caspase-3抗體(美國Cell Signaling Technology公司，1:1000)4 ℃孵育過夜，PBS緩沖液洗滌，加入羊抗兔二抗(美國Cell Signaling Technology公司，1:1000)室溫孵育1 h，ECL曝光顯影，用ImageJ軟件分析各條帶光密度值。

1.5 脊髓組織中丙二醛(maleic dialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)含量測定 取大鼠脊髓組織勻漿，3500 r/min離心20 min，取上清，按照MDA、SOD和LDH檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書步驟測定MDA、SOD和LDH的含量。取上清，加入20%三氯乙酸(TCA)孵育20 min，加入0.67%硫代巴比妥酸(TBA)和0.1 mol/L鹽酸(HCl)，95 ℃水浴孵育1 h，采用酶標(biāo)儀檢測532 nm波長處的吸光度(OD)值，計(jì)算MDA含量。取上清，加入酶工作液及水溶性四氮唑鹽(WST)工作液，37 ℃環(huán)境下反應(yīng)20 min，采用酶標(biāo)儀檢測540 nm波長處的OD值，計(jì)算SOD含量。取上清，按照LDH檢測試劑盒說明書步驟檢測LDH含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TPG對(duì)SCI大鼠BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分的影響 對(duì)照組大鼠無明顯功能缺失癥狀，BBB評(píng)分穩(wěn)定。SCI組和TPG組大鼠BBB評(píng)分隨時(shí)間延長呈增高趨勢，且TPG組大鼠BBB評(píng)分高于SCI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.2 TPG對(duì)SCI大鼠脊髓細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，SCI組脊髓細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組[(26.1%±3.2%) vs. (18.8%±1.6%)，P<0.05]，TPG組脊髓細(xì)胞凋亡率(21.3%±2.3%)明顯低于SCI組(P<0.05，圖1)。

2.3 TPG對(duì)SCI大鼠脊髓細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SCI組大鼠脊髓細(xì)胞凋亡蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)。與SCI組比較，TPG組大鼠脊髓細(xì)胞凋亡蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05，圖2)。

表1 脊髓傷后不同時(shí)間各組大鼠BBB評(píng)分比較(±s，n=6)Tab.1 Comparison of BBB scores in each group of rats after spinal cord injury (±s, n=6)

表1 脊髓傷后不同時(shí)間各組大鼠BBB評(píng)分比較(±s，n=6)Tab.1 Comparison of BBB scores in each group of rats after spinal cord injury (±s, n=6)

與對(duì)照組比較，(1)P<0.05；與SCI組比較，(2)P<0.05。

組別 1 d 7 d 14 d 21 d 28 d對(duì)照組 21.40±0.50 20.80±0.64 21.00±0.89 20.50±0.62 22.60±0.78 SCI組 1.92±0.36(1) 2.46±0.59(1) 3.26±0.51(1) 6.40±0.31(1) 8.10±0.42(1)TPG組 2.23±0.48(2) 4.58±0.38(2) 5.32±0.47(2) 8.60±0.62(2) 16.50±0.81(2)

圖1 各組大鼠脊髓細(xì)胞凋亡率比較Fig.1 Comparison of apoptosis rate of spinal cord cells in each group of rats with spinal cord injury

圖2 各組大鼠脊髓細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)水平比較Fig.2 Comparison of the expression level of apoptotic proteins of spinal cord cells in each group of rats with spinal cord injury

2.4 TPG對(duì)SCI大鼠脊髓組織中MDA、SOD和LDH含量的影響 與對(duì)照組比較，SCI組大鼠脊髓組織中MDA、LDH含量明顯升高，SOD含量明顯降低(P<0.05)。與SCI組比較，用TPG處理的SCI大鼠脊髓組織中MDA、LDH含量明顯降低，SOD含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

3 討 論

SCI臨床較為常見，且近年來發(fā)病率逐漸升高，致殘率居高不下[7]。目前脊椎損傷的治療方法多樣，包括手術(shù)、針灸、細(xì)胞移植及中藥等，但是治療效果并不理想，且可能引起不同程度的并發(fā)癥[8]。 因此，采用新型藥物或方法治療SCI已成為脊柱外科的研究熱點(diǎn)之一。

表2 各組大鼠脊髓組織中MDA、SOD、LDH含量比較(±s，n=6)Tab.2 Comparison of MDA, SOD and LDH content in each group of rats with spinal cord injury (±s, n=6)

表2 各組大鼠脊髓組織中MDA、SOD、LDH含量比較(±s，n=6)Tab.2 Comparison of MDA, SOD and LDH content in each group of rats with spinal cord injury (±s, n=6)

與對(duì)照組比較，(1)P<0.05；與SCI組比較，(2)P<0.05。

組別 MDA(nmol/ml) SOD(U/ml) LDH(U/L)對(duì)照組(n=6) 6.89±2.34 123.26±9.32 231.98±36.54 SCI組(n=6) 23.44±4.57(1) 87.65±6.59(1) 368.46±63.24(1)TPG組(n=6) 16.23±1.98(2) 101.45±6.37(2) 278.82±43.67(2)

赤芍是一種傳統(tǒng)中藥，臨床使用方便，不良反應(yīng)少，具有多種藥理作用，如抗凝、抗血栓、抗內(nèi)毒素、抗氧化等[9]。對(duì)于赤芍藥理作用機(jī)制的研究主要集中于TPG。已有研究表明，赤芍可用于SCI的中藥治療[5]。本研究采用Allen法構(gòu)建SCI大鼠模型，腹腔注射TPG觀察其對(duì)損傷大鼠的治療效果及影響機(jī)制，結(jié)果顯示，SCI組BBB評(píng)分明顯降低，與卜志勇等[10]研究中SCI大鼠的表現(xiàn)相同，表明SCI動(dòng)物模型構(gòu)建成功。本研究發(fā)現(xiàn)，與SCI模型大鼠相比，TPG組大鼠BBB評(píng)分在1個(gè)月的治療過程中均明顯增高，表明TPG對(duì)SCI確有明顯的治療作用。

SCI的發(fā)展過程包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。前者是被動(dòng)地發(fā)生在短時(shí)間內(nèi)的不可逆損傷，后者是在脊髓受損一段時(shí)間之后繼續(xù)發(fā)展的損傷，具有可逆性和可控性[11]。脊髓細(xì)胞凋亡在原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷的發(fā)生中均發(fā)揮作用。在脊髓損傷中心區(qū)域，大多數(shù)細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，其凋亡過程與caspase-3途徑的激活有關(guān)[12]。Cleaved caspase-3是caspase-3的活化形式，能夠更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的凋亡程度[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，TPG對(duì)SCI大鼠脊髓細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用，同時(shí)明顯抑制了SCI大鼠凋亡蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達(dá)，表明TPG對(duì)SCI所致脊髓細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

過度的氧化應(yīng)激能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在SCI的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用[14]。本研究選擇MDA、SOD及LDH作為氧化應(yīng)激的代表性指標(biāo)，其中SOD是細(xì)胞內(nèi)主要的自由基清除劑和抗氧化酶，其含量高低能夠反映細(xì)胞對(duì)氧自由基損傷抵抗能力的強(qiáng)弱[15]；MDA和LDH含量的高低是細(xì)胞氧化損傷的重要標(biāo)志[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，SCI大鼠脊髓組織中MDA和LDH含量升高，SOD含量降低，而在TPG腹腔注射后SCI大鼠以上指標(biāo)均有改善，表明TPG可以減輕SCI大鼠中過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，TPG腹腔注射對(duì)SCI大鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是減輕損傷大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制脊髓細(xì)胞凋亡，提示TPG可成為治療SCI的有效藥物，但臨床上單方或者作為輔助藥劑對(duì)赤芍的使用仍需進(jìn)一步研究，以更加安全有效地對(duì)SCI進(jìn)行治療。