李嘉程，楊曦，梁學(xué)振，閻博昭，許波，李剛

1山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250014；2新疆軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，烏魯木齊 830000；3山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，濟(jì)南 250014

激素性股骨頭壞死(steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH)是骨科常見的難治性疾病之一。長期服用激素會(huì)對(duì)股骨頭產(chǎn)生一定的影響，最終加重股骨頭的缺血，引起成骨-破骨代謝異常，進(jìn)而導(dǎo)致塌陷。塌陷是股骨頭軟骨下骨力學(xué)屬性失敗的重要特征，是決定SONFH治療方案最重要的因素[1]，目前SONFH發(fā)病趨于年輕化且治療困難，已成為導(dǎo)致青壯年髖關(guān)節(jié)殘疾的最常見原因之一[2]。因此，深入了解SONFH發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的分子標(biāo)志物以提高其早期診斷率、深入探究其發(fā)病的分子機(jī)制以提高藥物的治療效果，對(duì)于改善SONFH患者的預(yù)后具有重要意義。迄今為止，大量非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)已被發(fā)現(xiàn)參與控制基因表達(dá)和激活途徑，從而影響SONFH的進(jìn)展。鑒于長鏈非編碼RNA(long noncoding，lncRNAs)自身表達(dá)的豐富性和組織表達(dá)的特異性，組織中表達(dá)失調(diào)的lncRNAs可作為SONFH早期診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。此外，研究表明，作為miRNAs的競爭性內(nèi)源RNA(competitive endogenous RNAs，ceRNA)，lncRNAs在疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是人類多種疾病的重要調(diào)節(jié)因子。然而，大多數(shù)lncRNAs在SONFH發(fā)生中的生物學(xué)作用和臨床意義尚不完全清楚。為此，本研究通過生物信息學(xué)方法分析SONFH的相關(guān)差異表達(dá)基因，構(gòu)建lncRNA、miRNA及mRNA之間的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探討差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 在高通量測序SRA數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)檢索SONFH相關(guān)去核糖體的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)集SRP091890，由Huashan Hospital，F(xiàn)udan University上傳(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX2255530)，分析數(shù)據(jù)可得到lncRNA和mRNA的表達(dá)譜。在GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索SONFH相關(guān)的miRNA芯片，獲得編號(hào)為GSE89587的芯片原始數(shù)據(jù)和編號(hào)為GPL21439的芯片基因注釋文件，該芯片數(shù)據(jù)的原始文件包含20個(gè)血清樣本，由Zhang等[3]上傳，分析數(shù)據(jù)可得到差異表達(dá)的miRNAs數(shù)據(jù)。

1.2 差異表達(dá)基因篩選 應(yīng)用R 語言程序包(http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html)對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正和矩陣數(shù)據(jù)歸一化處理，利用Limma包分析不同芯片原始數(shù)據(jù)的差異基因，數(shù)據(jù)結(jié)果運(yùn)用log2進(jìn)行轉(zhuǎn)化，顯著差異基因的篩選條件為P<0.05且差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)≥1.5；運(yùn)用plot包和heatmap2包分別繪制芯片原始的火山圖和聚類圖。

1.3 SONFH相關(guān)miRNA-DEG調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用miRDB(http://mirdb.org/)[4]、miRTarbase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)[5]和TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)[6]等數(shù)據(jù)庫檢索miRNA靶向的mRNAs。為了提高搜索結(jié)果的有效性，納入兩個(gè)及以上數(shù)據(jù)庫中包含miRNA靶向的mRNAs，以構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape 3.6.1軟件對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行可視化映射。

1.4 SONFH相關(guān)lncRNAs與lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控關(guān)系的預(yù)測 利用starBase(http://starbase.sysu.edu.cn /index.php)[7]數(shù)據(jù)庫預(yù)測SONFH相關(guān)miRNA調(diào)控的lncR NA s，與通過基因芯片分析得出的lncRNA-DEG取交集，以構(gòu)架SONFH可能的lncRNA相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)(圖1)，利用clusterProfiler包[8]對(duì)上述差異mRNAs進(jìn)行功能富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 SONFH相關(guān)的差異表達(dá)mRNAs、miRNAs及l(fā)ncRNAs 利用R語言程序包中的limma包分析差異表達(dá)的mRNAs、miRNAs及l(fā)ncRNAs，共篩選得到422個(gè)顯著差異mRNAs，其中192個(gè)表達(dá)上調(diào)、230個(gè)表達(dá)下調(diào)；22個(gè)顯著差異miRNAs，其中10個(gè)表達(dá)上調(diào)、12個(gè)表達(dá)下調(diào)；416個(gè)顯著差異lncRNAs，其中148個(gè)表達(dá)上調(diào)、268個(gè)表達(dá)下調(diào)。所有差異表達(dá)mRNAs、miRNAs及l(fā)ncRNAs的火山圖和聚類圖如圖2－4所示。

圖1 SONFH相關(guān)的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)流程Fig.1 Flow chart of lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA regulation network related to SONFH SONFH. 激素性股骨頭壞死

2.2 預(yù)測與差異表達(dá)miRNAs相關(guān)聯(lián)的mRNAs 利用TargetScan、miRTarBase、miRDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測與上述差異表達(dá)miRNAs相關(guān)聯(lián)的mRNAs，至少2個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到的mRNAs納入研究，最后得到8324個(gè)預(yù)測miRNA-mRNA(圖5)，去重后得到1993個(gè)mRNAs，與通過基因芯片分析得出的差異mRNAs取交集得到46個(gè)mRNAs。映射差異表達(dá)的mRNAs和miRNAs預(yù)測的mRNAs，構(gòu)建mRNA-miRNA 網(wǎng)絡(luò)。

2.3 預(yù)測與差異表達(dá)miRNAs關(guān)聯(lián)的lncRNAs及l(fā)ncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控關(guān)系的構(gòu)建 利用starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測與SONFH相關(guān)miRNAs調(diào)控的lncRNAs 196個(gè)，與通過基因芯片分析得出的差異lncRNAs取交集得到3個(gè)lncRNAs。映射差異表達(dá)的lncRNAs和miRNAs預(yù)測的lncRNAs，根據(jù)lncRNAmiRNA上下調(diào)關(guān)系構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，僅VASH1-AS1符合條件，將其與mRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建lncRNA-miRNAmRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如圖6所示。

2.4 差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG通路分析 利用clusterProfiler包對(duì)上述差異mRNAs進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示，6條生物學(xué)進(jìn)程被顯著富集，包括氮化合物代謝過程、分解代謝過程、生物合成過程及代謝過程的正負(fù)調(diào)控等(圖7)。但KEGG信號(hào)通路未被顯著富集。

3 討 論

股骨頭壞死(osteonecrosis of femoral head，ONFH)是骨科常見的難治性疾病之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示，日本每年有2500～3000例新發(fā)病例，美國為1.5萬～2萬，韓國為1萬～1.5萬，我國為10萬～ 20萬。我國2012年一項(xiàng)多中心調(diào)查研究顯示，約26.35%的男性和55.75%的女性非創(chuàng)傷性O(shè)NFH患者是由激素引起的。長期服用激素會(huì)對(duì)股骨頭產(chǎn)生一定的影響[9]：①促進(jìn)血小板生成，增高血液凝固性和黏滯度，在末梢小動(dòng)脈炎的基礎(chǔ)上發(fā)生動(dòng)脈栓塞；②加重髓內(nèi)靜脈淤滯，增高骨內(nèi)壓，引起骨內(nèi)循環(huán)障礙；③降低病變股骨頭軟骨下骨微血管密度，導(dǎo)致血管通透性異常和血管新生能力變差等。上述病理變化最終加重股骨頭缺血[10]，引起骨形成動(dòng)態(tài)平衡體系的破壞，進(jìn)而導(dǎo)致塌陷，而塌陷是股骨頭軟骨下骨力學(xué)屬性失敗的重要特征，最終導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)殘疾。但SONFH發(fā)生的具體機(jī)制目前尚不清楚，闡明SONFH相關(guān)基因及其參與ONFH進(jìn)展的分子機(jī)制至關(guān)重要。

近年來，lncRNAs的相關(guān)研究引起了各個(gè)領(lǐng)域的關(guān)注。大量證據(jù)表明，lncRNAs在疾病發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的調(diào)控作用，但lncRNAs與SONFH關(guān)系的研究較少。本研究在SONFH患者和正常對(duì)照之間共篩選出422個(gè)顯著差異mRNAs、 22個(gè)顯著差異miRNAs和416個(gè)顯著差異lncRNAs，經(jīng)過與預(yù)測的mRNAs和lncRNAs去交集后，構(gòu)建了一個(gè)VASH1-AS1/miRNA/mRNA相關(guān)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

圖2 SONFH相關(guān)的差異表達(dá)mRNAs的聚類圖(A)和火山圖(B)Fig.2 Volcano diagram and clustering diagram of mRNAs differently expressed in SONFH SONFH. 激素性股骨頭壞死；藍(lán)色示SONFH；橙色示對(duì)照組；紅色示上調(diào)基因；綠色示下調(diào)基因

VASH1-AS1為VASH-1(vasohibin-1)的反義RNA，是最近發(fā)現(xiàn)的能夠通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)血管生成的調(diào)控因子[11-12]，在血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)，且其表達(dá)隨血管生成刺激因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的表達(dá)而增加[13]。VASH-1的特殊性在于其以負(fù)反饋調(diào)節(jié)的方式抑制血管生成，特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，是目前唯一有科學(xué)研究依據(jù)的、專一抑制血管新生的抑制因子[14]。而VASH1-AS1是VASH-1的反義RNA，與VASH-1特異性互補(bǔ)結(jié)合，抑制其翻譯、表達(dá)，阻斷該基因的功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血管新生在哺乳動(dòng)物器官發(fā)育、組織修復(fù)和再生等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，而且與多種高發(fā)疾病如心肌梗死、骨壞死、腫瘤及視網(wǎng)膜病變等的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[15]。VASH1-AS1可通過抑制VASH-1而發(fā)揮促進(jìn)血管生成的作用。

圖3 SONFH相關(guān)的差異表達(dá)miRNAs的聚類圖(A)和火山圖(B)Fig.3 Volcano diagram and clustering diagram of miRNAs differently expressed in SONFH SONFH. 激素性股骨頭壞死；藍(lán)色示SONFH；橙色示對(duì)照組；紅色示上調(diào)基因；綠色示下調(diào)基因

let-7最早在線蟲中發(fā)現(xiàn)，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，隨后有研究表明，let-7家族miRNAs在哺乳動(dòng)物中的序列和功能都高度保守。let-7家族miRNAs作用廣泛，能夠參與調(diào)控干細(xì)胞發(fā)育、凋亡、分化、免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移等多種生理病理過程[16]。徐小隔等[17]發(fā)現(xiàn)，let-7d在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化中起著重要作用。上調(diào)SHR/WKY-VSMCs、HCASMCs等血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)let-7d的表達(dá)可有效抑制KRAS蛋白的表達(dá)，并能抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖[18]。

圖4 SONFH相關(guān)的差異表達(dá)lncRNAs的聚類圖(A)和火山圖(B)Fig.4 Volcano diagram and clustering diagram of lncRNAs differently expressed in SONFH SONFH. 激素性股骨頭壞死；藍(lán)色示SONFH；橙色示對(duì)照組；紅色示上調(diào)基因；綠色示下調(diào)基因

SLC5A6是一種鈉依賴的多種維生素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SMVT)，介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)生物素、泛酸和硫辛酸的攝取[19]。Uchida等[20]證實(shí)，人腦微血管中SLC5A6 mRNA和蛋白均呈高表達(dá)，且SLC5A6對(duì)人腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞攝取生物素和泛酸起主要作用，提示SLC5A6是腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞攝取生物素和泛酸轉(zhuǎn)運(yùn)的主要因子。

NQO2基因位于6號(hào)染色體的6pte-q12片段，可降低細(xì)胞內(nèi)氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的水平，抑制細(xì)胞因子ERK1/2的磷酸化，從而抑制細(xì)胞增殖。部分研究表明，NQO2高表達(dá)可能會(huì)激活大腦中的某些化學(xué)物質(zhì)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，引起神經(jīng)元損傷[21]。也有研究表明，NQO2可防止醌誘導(dǎo)的皮膚癌變[22]。Yu等[23]發(fā)現(xiàn)，NQO2表達(dá)增加可降低乳腺癌發(fā)生的可能性，尤其是具有野生型p53的乳腺組織。目前，通過檢索文獻(xiàn)尚未發(fā)現(xiàn)hsamir-3194-3p和THAP6的單獨(dú)研究。

圖5 差異表達(dá)miRNAs預(yù)測的mRNAs Veen圖 Fig.5 Veen plot of mRNAs predicted by differentially expressed miRNAs

骨壞死的發(fā)生發(fā)展是多因素、多環(huán)節(jié)、多階段、多基因參與的動(dòng)態(tài)過程[24]。既往研究一般聚集于骨細(xì)胞，從基因、分子、表觀表型等方面闡述骨壞死的發(fā)生發(fā)展過程，而忽略了骨骼血管微環(huán)境的影響。骨骼血管微環(huán)境是由調(diào)節(jié)骨生長、骨骼動(dòng)態(tài)平衡的多種基質(zhì)細(xì)胞及其所分泌的血管生成因子構(gòu)成的。骨修復(fù)過程中的血管化是骨再生的重要調(diào)控因素，“血管新生-骨形成耦聯(lián)”機(jī)制是調(diào)控骨重建修復(fù)的關(guān)鍵機(jī)制[25]，而VASH1-AS1、has-let-7d-5p和NQO2可能作為調(diào)控因子，通過調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與調(diào)節(jié)“血管新生-骨形成耦聯(lián)”機(jī)制，在SONFH發(fā)病過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

本研究存在一定的局限性：①納入樣本量有限，可能導(dǎo)致篩選的lncRNAs、miRNAs和mRNAs的數(shù)量有所偏差，未來需擴(kuò)大研究樣本量進(jìn)行證實(shí)；②本研究結(jié)果僅涉及SONFH血液標(biāo)本，需要進(jìn)一步研究其他類型的ONFH(如創(chuàng)傷性O(shè)NFH)和其他來源(如骨組織)的樣本以更加準(zhǔn)確地闡釋ONFH的生理病理過程。

綜上所述，本研究通過整合分析SONFH血液中l(wèi)ncRNAs、miRNAs和mRNAs的表達(dá)差異，成功構(gòu)建了lncRNAs相關(guān)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)VASH1-AS1可能通過has-let-7d-5p或hsa-mir-3194-3p間接調(diào)控SLC5A6、NQO2和THAP6，從而參與SONFH的發(fā)病過程，其中VASH1-AS1、has-let-7d-5p和NQO2可能作為調(diào)控因子，通過調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與調(diào)節(jié)“血管新生-骨形成耦聯(lián)”機(jī)制，在SONFH發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這一發(fā)現(xiàn)為SONFH的作用機(jī)制研究提供了新思路，為其治療提供了潛在靶點(diǎn)，但仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證這一調(diào)控效應(yīng)。

圖6 SONFH相關(guān)的lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.6 SONFH-related lncRNA-miRNA-mRNA regulatory network

圖7 SONFH相關(guān)的差異表達(dá)mRNAs的GO功能富集分析Fig.7 GO functional enrichment analysis of SONFH-related differentially expressed mRNAs