梁錦寧 李家富 歐陽軼強(qiáng) 張名媛 孫俊銘 郭曉萍

(廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，南寧 530021)

隨著實(shí)驗(yàn)動物行業(yè)的迅猛發(fā)展，行業(yè)內(nèi)對高質(zhì)量動物的期望與需求與日俱增。實(shí)驗(yàn)動物生存環(huán)境是影響實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量以及與實(shí)驗(yàn)動物有關(guān)的食品藥品檢定和安全評價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的重要因素[1]。我國于2010年發(fā)布了現(xiàn)行的實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境及設(shè)施國家標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2010，為實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境和設(shè)施制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。因此，為動物實(shí)驗(yàn)提供優(yōu)質(zhì)、安全、穩(wěn)定、無污染的設(shè)備和飼養(yǎng)環(huán)境是非常必要的，而對飼養(yǎng)環(huán)境的監(jiān)測是保障實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境的重要手段之一[2]。

動物設(shè)施在實(shí)際運(yùn)行中每時每刻都面臨著來自人員、動物、物品進(jìn)出的污染風(fēng)險(xiǎn)，消毒是切斷傳播途徑、預(yù)防傳染病發(fā)生和控制疾病傳播的一項(xiàng)重要的防疫措施，因此，實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境和設(shè)施的常規(guī)消毒顯得尤為重要。為確保屏障工作正常運(yùn)行，需要對屏障環(huán)境進(jìn)行長期、定期的消毒監(jiān)測，確保SPF級實(shí)驗(yàn)動物屏障內(nèi)無特定病原微生物感染。本實(shí)驗(yàn)收集分離得到的沙門氏菌和大腸桿菌，對其進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，為消毒劑的科學(xué)使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種:沙門氏菌、大腸桿菌，菌種均為實(shí)驗(yàn)動物中心檢測分離獲得的菌株。

1.1.2試劑和溶液:0.2%過氧乙酸，0.1%二氯異氰脲酸鈉粉(有效氯40%)，0.25%戊二醛溶液，0.25%新潔爾滅，0.05%百毒殺(癸甲溴銨溶液)，0.05%古迪安(戊二醛癸甲溴銨溶液)。

1.1.3儀器及其它器材:無菌培養(yǎng)皿，無菌濾紙片，無菌鑷子，恒溫培養(yǎng)箱，酒精燈，高壓蒸汽滅菌鍋，燒杯，量筒，移液管，三角涂棒。

1.1.4培養(yǎng)基:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1培養(yǎng)基的配制:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：稱取33 g營養(yǎng)瓊脂，加入1 000 mL蒸餾水?dāng)嚢杓訜嶂寥芙?；LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨2.5 g，酵母粉1.25 g，氯化鈉2.5 g完全溶解于200 mL超純水中，定容至250 mL加NaOH調(diào)至pH 7.4，高壓滅菌備用。

1.2.2高壓蒸汽滅菌:上述培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿，濾紙片，移液管，蒸餾水等以0.1 MPa、121 ℃、30 min高壓蒸汽滅菌。

1.2.3制作培養(yǎng)平板:將已滅菌并冷卻至45～50 ℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入培養(yǎng)皿中約12～15 mL，水平放置至凝固。

1.2.4配菌懸液:將沙門氏菌和大腸桿菌轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基上，37 ℃，200 r/min 搖床上振蕩24 h。

1.2.5制作含菌培養(yǎng)基:用無菌移液管吸取200uL菌懸液分別加入到營養(yǎng)瓊脂平板中，用無菌三角涂棒涂布均勻。

1.2.6消毒劑及紙片處理:按消毒劑的配比濃度配制消毒劑，用無菌鑷子將已滅菌的小圓形濾紙片(D8mm)分別浸入裝有各種消毒劑溶液的燒杯中完全浸濕(紙片全部沉底)取出濾紙片時保證濾紙片所含的消毒劑溶液量基本一致，并瀝去多余的藥液。無菌操作將濾紙片貼在平板中心位置，輕輕按壓，使藥片與培養(yǎng)基密切接觸。用浸有無菌水的濾紙片作為對照，每種消毒劑做3個重復(fù)。

1.2.7培養(yǎng):將平板倒置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.8結(jié)果觀察:觀察抑菌圈，并記錄抑菌圈的直徑(含濾紙片的直徑)。根據(jù)抑菌圈的大小，判斷抑菌、殺菌作用。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)消毒劑對沙門氏菌抑菌效果分析

6種消毒劑對沙門氏菌抑菌效果見表1,0.05%古迪安對沙門氏菌作用效果最顯著，其次是0.05%百毒殺和0.25%戊二醛溶液，0.2%過氧乙酸、0.1%二氯異氰脲酸鈉粉和0.25%新潔爾滅抑菌效果較差。6種消毒劑對沙門氏菌的抑菌效果顯著性的比較見表2，0.05%古迪安和0.05%百毒殺對沙門氏菌的抑菌作用效果相對于0.2%過氧乙酸、0.1%二氯異氰脲酸鈉粉、0.25%戊二醛溶液、0.25%新潔爾滅差異顯著(P<0.05)；0.1%二氯異氰脲酸鈉粉對沙門氏菌的抑菌作用效果相對于0.2%過氧乙酸、0.25%戊二醛溶液、0.25%新潔爾滅差異不顯著(P>0.05)。0.25%戊二醛溶液對沙門氏菌的抑菌作用效果相對于0.25%新潔爾滅差異顯著(P<0.05)。0.2%過氧乙酸對沙門氏菌的抑菌作用效果相對于0.25%戊二醛溶液、0.05%百毒殺和0.05%古迪安差異顯著(P<0.05)。

表1 6種消毒劑對沙門氏菌抑菌效果

表2 6種消毒劑對沙門氏菌的抑菌效果顯著性的比較

2.2 化學(xué)消毒劑對大腸桿菌抑菌效果分析

6種消毒劑對大腸桿菌抑菌效果見表3，0.05%古迪安對大腸桿菌的抑菌作用效果最顯著，其次是0.25%戊二醛溶液和0.05%百毒殺，0.1%二氯異氰脲酸鈉粉，0.2%過氧乙酸和0.25%新潔爾滅抑菌效果較差。6種消毒劑對大腸桿菌的抑菌效果顯著性的比較結(jié)果見表4，0.1%二氯異氰脲酸鈉粉與0.25%戊二醛溶液、0.05%百毒殺對大腸桿菌的抑菌效果的比較差異不顯著(P>0.05)；0.1%二氯異氰脲酸鈉粉與0.2%過氧乙酸、0.25%新潔爾滅、0.05%古迪安對大腸桿菌的抑菌效果的比較差異顯著(P<0.05)。0.05%百毒殺與0.2%過氧乙酸、0.1%二氯異氰脲酸鈉粉、0.25%戊二醛溶液、0.25%新潔爾滅、0.05%古迪安對大腸桿菌的抑菌效果的比較差異不顯著(P>0.05)；0.05%古迪安與0.2%過氧乙酸、0.1%二氯異氰脲酸鈉粉、0.25%新潔爾滅相比較差異顯著(P<0.05)；0.05%古迪安與0.25%戊二醛溶液、0.05%百毒殺比較差異不顯著(P>0.05)；

表3 6種消毒劑對大腸桿菌抑菌效果

表4 6種消毒劑對大腸桿菌的抑菌效果顯著性的比較

3 討論

實(shí)驗(yàn)動物生存環(huán)境和設(shè)施是影響實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一，提高實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境和設(shè)施的安全，為動物實(shí)驗(yàn)提供合格的實(shí)驗(yàn)動物是實(shí)驗(yàn)動物中心的使命。實(shí)驗(yàn)動物中心很多環(huán)節(jié)需要消毒處理，各個環(huán)節(jié)使用的消毒液濃度不一樣，各科研院所動物中心使用的消毒劑各不相同，對于環(huán)境消毒使用較多的有過氧乙酸、過氧化氫[3]、次氯酸、新潔爾滅和百毒殺等等[4]。屏障環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)室在使用過程中的消毒效果直接影響環(huán)境微生物的有效控制。然而，人們?nèi)粘Ｊ褂孟緞r一般參照廠商說明書使用，而廠商一般僅根據(jù)環(huán)境及消毒環(huán)境推薦不同的消毒濃度，不會根據(jù)致病菌的不同而推薦不同的消毒濃度，消毒效果在不同情況下存在明顯差異。而且，在同一個環(huán)境或者同一個地方長期使用同一種消毒劑，細(xì)菌會產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致消毒效果下降[5]。因此，有必要對常見致病菌的消毒劑的耐受性進(jìn)行相關(guān)研究，為消毒劑的科學(xué)使用、合理使用提供重要參考價(jià)值。

百毒殺消毒劑的有效成分是癸甲溴銨，具有廣譜、高效、低毒，刺激性小，對金屬腐蝕性小，對病毒和真菌等都有殺滅作用，適用于帶動物消毒及用具、環(huán)境的消毒[6]。古迪安消毒劑的有效成分是戊二醛癸甲溴銨溶液，有刺激性氣味。戊二醛為醛類消毒藥，可殺滅細(xì)菌的繁殖體和芽孢、真菌、病毒[7]。新潔爾滅是一種陽離子表面活性劑，有廣譜抑菌殺菌作用，作用快，毒性和刺激性小，對病毒和芽孢作用弱，常用于皮膚和器械的浸泡消毒[8]。二氯異氰脲酸鈉粉是一種含氯消毒劑，是一種高效、廣譜、新型內(nèi)吸性殺菌劑，有極強(qiáng)的殺菌作用。二氯異氰脲酸鈉化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，便于貯存運(yùn)輸；使用安全、簡便、用量少、藥效持續(xù)時間長，是一種性能穩(wěn)定的強(qiáng)氧化劑和氯化劑。在實(shí)際應(yīng)用過程中，我們必須綜合考慮各種消毒劑應(yīng)用范圍，如動物飼養(yǎng)量、是否帶動物消毒、對動物的刺激性、對設(shè)施設(shè)備的腐蝕性、是日常消毒還是爆發(fā)疫病時消毒、是飼養(yǎng)環(huán)境消毒還是實(shí)驗(yàn)用具的消毒等。

一般情況下，消毒劑濃度越高，其抑菌效果越好，但并非越高越好，且頻繁使用高濃度消毒劑消毒，可能會導(dǎo)致致病菌抗性的增強(qiáng)，從而使消毒劑失效[9]。因此，我們在實(shí)際應(yīng)用過程中，要多方面考慮選擇合適的消毒劑濃度。本研究選擇二氯異氰脲酸鈉粉、戊二醛消毒液、新潔爾滅、百毒殺和古迪安6種不同消毒劑對沙門氏菌和大腸桿菌進(jìn)行耐受測試，以期篩選出對沙門氏菌和大腸桿菌殺毒效果最理想的消毒劑。本研究結(jié)果顯示0.05%古迪安對沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌作用最強(qiáng)，0.05%的百毒殺對沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌作用次之，0.25%戊二醛溶液對沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果較好，0.2%過氧乙酸、0.1%二氯異氰脲酸鈉粉和0.25%新潔爾滅對沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果較差。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示按照二氯異氰脲酸鈉粉和新潔爾滅說明書推薦的使用濃度并不能達(dá)到理想的消毒效果，說明沙門氏菌和大腸桿菌對二氯異氰脲酸鈉粉和新潔爾滅的耐受性較高，消毒效果較差。由于古迪安和百毒殺使用頻率較低，對沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果較為理想。

通過不同消毒劑對沙門氏菌和大腸桿菌抑菌效果的比較，二氯異氰脲酸鈉粉和新潔爾滅的滅菌效果不理想，可能與長期使用產(chǎn)生耐藥性有關(guān)，我們篩選出古迪安和百毒殺這兩種有效的殺毒劑可供今后屏障環(huán)境消毒提供參考。