宗亞倩 ，吳曉祥，李 榮，馬慶兵，段新慧，姜 華

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省草山飼料工作站，云南 昆明 650225；3.云南尋甸黑頸鶴省級(jí)自然保護(hù)區(qū)管護(hù)局，云南 尋甸 655200)

光葉紫花苕(Vicia villosaRoth var.glabrescens)為豆科野豌豆屬(Vicia) 一年生或多年生自花傳粉的二倍體植物，是中國(guó)重要的豆科牧草之一[1]。它是富含蛋白質(zhì)、氨基酸和無(wú)機(jī)鹽的飼用綠肥及倒茬作物，既可固氮增加土壤肥力，又能提高其他茬口作物的產(chǎn)量，在農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展中扮演著十分重要的角色[2]。光葉紫花苕在云南具有較大的種植面積，因其根系深長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，既可作為綠肥作物又能喂養(yǎng)家畜，特別是與其他禾本科植物混合調(diào)制的干草不僅可以充分保留青干草中粗蛋白含量，而且還能解決冬春季節(jié)牧草不足的問題[3]。

染色體是細(xì)胞內(nèi)具有遺傳性質(zhì)的物質(zhì)，是遺傳信息的載體。染色體的數(shù)量、大小和特征等差異是研究物種進(jìn)化的重要依據(jù)，因此進(jìn)行染色體核型分析，是牧草種質(zhì)資源研究的重要工作，在鑒定親緣關(guān)系及判定變異程度上具有重要意義[4-5]。野豌豆屬中大部分植物為優(yōu)質(zhì)牧草和綠肥植物，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，全世界約150 種[6]，染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)變化較多，數(shù)目有2n=10、12、14、24 和28 等，其染色體基數(shù)分別為n=5、6、7、9 和11等[7]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已在窄葉野豌豆(Vicia angustifolia)、箭筈豌豆(Vicia sativa)、廣布野豌豆(Vicia cracca)、山野豌豆(Vicia amoena)、多莖野豌豆(Vicia multicaulis)、歪頭菜(Vicia unijuga)、四籽野豌豆(Vicia tetrasperma)及毛苕子(Vicia villosa)等[8-15]多種野豌豆屬植物中開展過染色體核型研究，但對(duì)光葉紫花苕核型分析的研究卻較少，僅見冉雪琴等[16]的報(bào)道，認(rèn)為光葉紫花苕染色體核型多數(shù)由近中部著絲點(diǎn)(sm) 構(gòu)成。為了能夠進(jìn)一步探究光葉紫花苕核型的變化，本研究分析了光葉紫花苕的體細(xì)胞染色體數(shù)目、染色體相對(duì)長(zhǎng)度、相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)和臂比，從細(xì)胞學(xué)水平對(duì)光葉紫花苕的遺傳背景進(jìn)行研究，以期為揭示野豌豆屬的染色體進(jìn)化規(guī)律提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以云光早光葉紫花苕為研究材料，選取外觀完好、活力高、無(wú)病蟲害且大小均勻的種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 染色體制片方法

將清選好的種子放入蒸餾水中，室溫下浸泡24 h 后，置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，室溫下培養(yǎng)，待幼根長(zhǎng)至2～3 mm (豆科牧草種子發(fā)芽時(shí)有下胚軸伸長(zhǎng)的習(xí)性，以上長(zhǎng)度不包括下胚軸長(zhǎng)度) 時(shí)，在9：00—11：00 選取材料；將選取的根尖放入二氯苯和8-羥基喹啉的混合液中，在15 ℃處理3～4 h，蒸餾水多次沖洗后，轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液中固定24 h；再用蒸餾水將材料沖洗干凈，在1 mol/L 鹽酸溶液中于60 ℃水浴解離14 min。用卡寶品紅溶液和45%醋酸染色30 min，壓片制成臨時(shí)片，并觀察染色體，對(duì)分裂中期的細(xì)胞染色體進(jìn)行觀察。選取清晰的50 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和觀察，明確染色體條數(shù)；制成的永久片在顯微鏡下進(jìn)行觀測(cè)并記錄染色體的長(zhǎng)度。

1.2.2 染色體核型分析

核型分析標(biāo)準(zhǔn)：按李懋學(xué)等[17]、LEVAN 等[18]和STEBBINS[19]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行染色體分類，按KUO等[20]提出的公式進(jìn)行染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)的計(jì)算，最后根據(jù)染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)的大小，將其分為4 種類型：染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)≥1.26 的為長(zhǎng)染色體(L)；1.25～1.01 的為中長(zhǎng)染色體(M2)；1.00～0.75 的為中短染色體(M1)，染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)≤0.75 的為短染色體(S)。染色體臂比1.0～1.7 的為中部著絲點(diǎn)，以m 表示；1.7～3.0 的為近中部著絲點(diǎn)，以sm 表示；3.0～7.0 的為近端部著絲點(diǎn)，以st 表示；7.0 以上的為端部著絲點(diǎn)，以t 表示。

染色體相對(duì)長(zhǎng)度=每條染色體長(zhǎng)度/染色體組總長(zhǎng)度×100%；

染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)=染色體長(zhǎng)度/最短染色體長(zhǎng)度；

染色體臂比=長(zhǎng)臂長(zhǎng)度/短臂長(zhǎng)度；

核型不對(duì)稱系數(shù)=染色體長(zhǎng)臂總長(zhǎng)/全組染色體總長(zhǎng)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPASS 18.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差(one-way ANOVA)分析方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核型分析

對(duì)光葉紫花苕進(jìn)行了染色體計(jì)數(shù)及核型分析。染色體計(jì)數(shù)結(jié)果表明：光葉紫花苕的染色體數(shù)目均為14 條，染色體配對(duì)數(shù)為7，未見隨體，且各組同源染色體按照長(zhǎng)度從大到小的順序配對(duì)方式見圖1。

圖1 光葉紫花苕同源染色體組配對(duì)圖Fig.1 V.villosa var.glabrescens homologous chromosomal group pairing diagram

2.2 染色體參數(shù)分析

對(duì)50 個(gè)根尖細(xì)胞進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，染色體數(shù)目為2n=14 的細(xì)胞有43 個(gè)，占整體的86.0%。對(duì)5 個(gè)細(xì)胞(來(lái)源于不同個(gè)體)的測(cè)量和統(tǒng)計(jì)(表1)，光葉紫花苕染色體相對(duì)長(zhǎng)度變異范圍在6.8～19.3，最長(zhǎng)染色體是最短染色體長(zhǎng)度的3.2 倍；相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)范圍在0.48～1.35，光葉紫花苕的相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)同源組間標(biāo)準(zhǔn)差為0.349。

表1 光葉紫花苕染色體參數(shù)分析Tab.1 Analysis of chromosome parameters of V.villosa var.glabrescens

在光葉紫花苕的同源染色體組中，第1、2 號(hào)染色體為長(zhǎng)染色體，第3、4 號(hào)染色體為中長(zhǎng)染色體，第5 號(hào)染色體為中短染色體，第6、7 號(hào)為短染色體，相對(duì)長(zhǎng)度組成為2n=14=4L+4M2+2M1+4S。

2.3 同源染色體長(zhǎng)度比及類型分析

通過對(duì)細(xì)胞染色體分散較好、較清晰的片子進(jìn)行測(cè)量以及染色體組型分析。由表2 可知：光葉紫花苕同源染色體組染色體臂比均在1.0～1.7之間，臂比值變化范圍為1.07～1.50，光葉紫花苕7 對(duì)染色體全為中部著絲點(diǎn) (m)。

表2 同源染色體臂比及類型分析Tab.2 Analysis of homologous chromosome length ratio and type

綜合表1、2 中染色體長(zhǎng)度和臂比均值，根據(jù)STEBBINS[19]的核型分析方法計(jì)算得出染色體長(zhǎng)度比為3.2，屬于“B”型染色體，臂比值范圍為1.07～1.50，沒有臂比值大于2∶1 的染色體，核型不對(duì)稱系數(shù)為55.9%，所以染色體類型為“1B”型。

3 討論

核型分析是指為闡明生物染色體組成，確定其染色體組型，從而根據(jù)材料的染色體數(shù)目、大小、著絲粒位置、臂比和隨體等形態(tài)特征對(duì)生物染色體進(jìn)行配對(duì)和分組等分析[21]。核型分析技術(shù)區(qū)別于傳統(tǒng)的形態(tài)鑒別，主要是在細(xì)胞水平上研究染色體特征，并以此為依據(jù)對(duì)植物進(jìn)行分類，這樣會(huì)使結(jié)果更加真實(shí)準(zhǔn)確，對(duì)于植物分類、演化過程以及種屬間親緣關(guān)系的分析等具有重要作用[22]。通過分析染色體形態(tài)、數(shù)目及結(jié)構(gòu)差異，為物種之間的遺傳距離、進(jìn)化和親緣關(guān)系在細(xì)胞學(xué)水平上提供了理論依據(jù)[2]。

研究表明：野豌豆屬植物的染色體一般由3種染色體構(gòu)成，分別是中部著絲點(diǎn)染色體m、近中部著絲點(diǎn)染色體sm 和近端部著絲點(diǎn)染色體st，其中近中部著絲點(diǎn)染色體sm 和近端部著絲點(diǎn)染色體st 是由中部著絲點(diǎn)染色體m 進(jìn)化而來(lái)的，且數(shù)目上由2n=14→2n=12 的方向進(jìn)行演化[6-8]。本試驗(yàn)中云光早光葉紫花苕的染色體數(shù)目為2n=14，染色體基數(shù)為x=7，7 對(duì)染色體的著絲點(diǎn)均為中部著絲粒m，染色體組的染色體長(zhǎng)度比為3.20，臂比值＞2 的染色體的占比為0.0%，核型不對(duì)稱系數(shù)為55.9%，核型不對(duì)稱性標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)為1B。因此云光早光葉紫花苕的核型公式為2n=14=14m (1B)，說明該供試材料屬于進(jìn)化程度較低、較原始的類群。雖然云光早光葉紫花苕的染色體數(shù)目與冉雪琴等[16]研究的貴州光葉紫花苕、楊根鳳等[15]研究的內(nèi)蒙古毛苕子的染色體數(shù)目相同都為14 條，但核型卻存在顯著差異。貴州光葉紫花苕核型公式是2n=14=4m (2SAT)+10sm，第7 對(duì)染色體有隨體；內(nèi)蒙古毛苕子的核型公式是2n=14=8m (2SAT)+6sm，第3 對(duì)染色體有隨體；而本研究中云光早光葉紫花苕核型公式是2n=14=14m，無(wú)隨體。本研究中光葉紫花苕的核型結(jié)構(gòu)與前人研究有所差異的原因可能是由以下3 個(gè)方面造成的。一是由于細(xì)胞內(nèi)染色體結(jié)構(gòu)變異，造成染色體的配對(duì)和排列不同；二是由于自然環(huán)境不同，為了適應(yīng)不同的生長(zhǎng)環(huán)境核型發(fā)生了變化；三是由于在試驗(yàn)過程中三者設(shè)定的預(yù)處理時(shí)間、解離時(shí)間及試劑不同造成的。且本試驗(yàn)中云光早光葉紫花苕染色體無(wú)隨體，可能由于隨體太小未發(fā)現(xiàn)，也有可能是在制片過程中造成丟失，具體原因仍需進(jìn)一步綜合分析。

4 結(jié)論

云光早光葉紫花苕是染色體數(shù)目為2n=2x=14 的二倍體植物，其核型公式為2n=14=14m，染色體類型為“1B”型，臂比指數(shù)主要集中在中部著絲粒m。從核型不對(duì)稱程度和染色體大小可得出云光早光葉紫花苕屬于進(jìn)化上較為原始的種類。