王宇琪 ，吳保為，陶宏征，賈志強(qiáng)，高 雪，王景文，劉雅婷

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus，HCRV) 是泛布尼亞病毒科(Peribunyaviridae)番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)病毒，2013 年在中國云南被首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[1]，本課題組首次報(bào)道了朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒的全基因組序列[2-3]。朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒能系統(tǒng)侵染一點(diǎn)紅、番茄、萵苣、旱金蓮和豇豆等經(jīng)濟(jì)作物，主要癥狀為同心環(huán)紋、葉片畸形、局部褪綠和壞死[4]，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的威脅。HCRV 為三分子基因組，分別是L RNA、M RNA 和S RNA。L RNA 僅有1 個(gè)開放閱讀框，正向編碼RNA 依賴的RNA 聚合酶 (RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)；M RNA 正向編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural protein of M RNA，NSm)，互補(bǔ)鏈編碼糖蛋白前體(glycoproteins，Gn/Gc)；S RNA正向編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSs (non-structural protein of S RNA，NSs)，互補(bǔ)鏈編碼核殼體蛋白 (nucleocapsid protein，N)[5]，N 蛋白序列保守程度較高[6]，因此通常被用于進(jìn)行Tospovirus屬病毒的分類檢測和鑒定[7]，N 蛋白也可能與病毒粒子裝配有關(guān)[8]。本研究通過RT-PCR 鑒定出蔥蓮、文殊蘭、喜林芋和酢漿草感染HCRV 的4 份樣品。為研究核殼體蛋白序列特征，通過RT-PCR、克隆和測序得到樣品完整的HCRV S RNA 序列，利用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)獲得其N 蛋白序列并進(jìn)行分析，為HCRV 的后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料采集

2016 年在云南省昆明市主要園林景區(qū)進(jìn)行了調(diào)查，采集到八角金盤(Fatsia japonica)、蔥蓮(Zephyranthes candida)、酢漿草(Oxalis corniculata)、旱金蓮(Tropaeolum majus)、蝴蝶蘭(Phalaenopsis aphrodite)、文殊蘭(Crinumasiaticum)、喜林芋(Philodendronschott) 和鳶尾(Iris tectorum)等疑似感染番茄斑萎病毒屬病毒樣品(圖1)，主要表現(xiàn)為褪綠、壞死斑和皺縮等癥狀，將采集回來的樣品用RT-PCR 進(jìn)行鑒定。

1.2 總RNA 提取

采用去除多糖多酚的TransZol Plant (全式金生物技術(shù)有限公司，北京)試劑盒提取RNA，以RNA 為模板，采用PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit (寶生物技術(shù)有限公司，大連) 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 RT-PCR 擴(kuò)增、克隆及測序

利用Primer Premier 6.0 軟件，以GenBank中公布的HCRV S RNA 序列(序列號：JX-833564.1)設(shè)計(jì)引物，S RNA 擴(kuò)增引物為：F：5′-AGAGCAATCGAGGTATAAACAAATAATCATACAC-3′；R：5′-AGAGCAATCGAGGTATAAAACATAAATTCTGAAC-3′。50 μL PCR 反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，F(xiàn)astPfu 1 μL，Buffer 10 μL，dNTP 4 μL，ddH2O 32 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，50 ℃20 s，72 ℃ 1.5 min，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物用于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將獲得的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化以及加A反應(yīng)。將已純化的PCR 產(chǎn)物連接在pEASY-T1載體上，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入T1 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過菌液PCR 鑒定出陽性重組子并送到公司進(jìn)行測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

通過ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)獲得4 個(gè)HCRV 分離物的N 蛋白序列，利用DNAMAN 8.0 與分離自云南省蜘蛛蘭上的HLS1-2 N 蛋白(登錄號：AFX74694)進(jìn)行序列比對分析；利用MEGA 6.06 軟件對NCBI 數(shù)據(jù)庫中已公布的分離自云南、廣東、廣西和福建地區(qū)蜘蛛蘭上的HCRV 的N 蛋白以及本研究獲得的4 個(gè)寄主的N 蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

圖1 疑似感染番茄斑萎病毒屬病毒樣品Fig.1 Samples suspected infection with Tospovirus virus

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR 結(jié)果

通過RT-PCR 技術(shù)鑒定出蔥蓮、文殊蘭、喜林芋和酢漿草4 份感染HCRV 的樣品并擴(kuò)增出HCRV S RNA 序列，電泳檢測條帶大小約為2 700 bp (圖2)。

圖2 HCRV S RNA 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification of HCRV S RNA

2.2 不同株系HCRV N 蛋白序列比對分析

本研究獲得的蔥蓮YN-ZCH、文殊蘭YNCA、喜林芋YN-PS 和酢漿草YN-OC 的N 蛋白，通過DNAMAN 8.0 與首個(gè)公布的HLS1-2 N蛋白進(jìn)行序列比對，一致性達(dá)到99.34%。YNZCH 存在6 個(gè)突變位點(diǎn)，YN-CA 存在5 個(gè)突變位點(diǎn)，YN-PS 存在4 個(gè)突變位點(diǎn)，YN-OC 存在6 個(gè)突變位點(diǎn)(表1)。

2.3 不同株系HCRV N 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 6.06 軟件對NCBI 數(shù)據(jù)庫中已公布的HCRV 的N 蛋白以及本研究獲得的4 個(gè)寄主的N 蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹方法選擇鄰接法(neighbor-joining，NJ)。結(jié)果顯示：本研究獲得的4 個(gè)HCRV 分離物的N 蛋白與分離自云南省的HCRV N 蛋白聚為1 支，來自廣東、廣西和福建地區(qū)的聚為1 支(圖3)。

表1 氨基酸突變位點(diǎn)Tab.1 Amino acid mutation sites

3 討論

云南省豐富的植物資源和復(fù)雜的氣候以及豐富的傳播介體種類為Tospovirus病毒的發(fā)生和流行提供了條件，該屬病毒在云南的發(fā)生呈逐年上升趨勢[9]。自2013 年首次在云南省發(fā)現(xiàn)HCRV至今，國內(nèi)外對其研究較少，目前已知寄主包括蜘蛛蘭、煙草、番茄、君子蘭[10]和蔥蓮[11]等，仍有許多寄主尚未被發(fā)現(xiàn)。本研究鑒定出蔥蓮、文殊蘭、喜林芋和酢漿草4 個(gè)感染HCRV 樣品，其中文殊蘭、喜林芋和酢漿草是首次報(bào)道的HCRV寄主。研究結(jié)果表明：4 個(gè)HCRV 分離物的N 蛋白與NCBI 首次公布的HLS1-2 N 蛋白有較高的同源性，從系統(tǒng)發(fā)育分析可知不同株系的分離物聚類現(xiàn)象與寄主無明顯關(guān)聯(lián)，推測可能環(huán)境因子對病毒進(jìn)化的影響強(qiáng)于寄主的影響。

圖3 HCRV N 蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of HCRV N protein amino acid sequence

4 結(jié)論

本研究通過采集疑似感染番茄斑萎病毒屬病毒的樣本，應(yīng)用癥狀學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定出了蔥蓮、文殊蘭、喜林芋和酢漿草 4 個(gè)感染HCRV 樣品，對 4 個(gè)寄主植物 S RNA 序列中 N蛋白進(jìn)行序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明4 個(gè)HCRV 分離物 N 蛋白與 NCBI 公布的 HLS1-2 N 蛋白有較高的同源性，HCRV 病毒的地理分布相關(guān)性強(qiáng)于寄主相關(guān)性。研究結(jié)果為 HCRV 的進(jìn)化研究提供基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步探究番茄斑萎病毒屬病毒的擴(kuò)散和進(jìn)化策略提供參考。