王 媛，董 坤，龔志文，李 源，譚 墾

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.中國科學(xué)院 西雙版納熱帶植物園，熱帶森林生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 勐臘 666303)

蜜蜂是自然界最重要的授粉昆蟲之一，對作物授粉和維持自然生態(tài)系統(tǒng)平衡發(fā)揮著重要作用[1-2]。蜜蜂作為社會性昆蟲，其化學(xué)通信系統(tǒng)十分復(fù)雜，當(dāng)蜜蜂受到驚擾時(shí)，會從蜇針腺釋放信息素作為報(bào)警信號[3]，進(jìn)而作出相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)行為。蜜蜂報(bào)警信息素是多組分信息素混合物，在整合蜂群防御反應(yīng)中起重要作用[4]。報(bào)警信息素的主要成分(質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞10%) 有乙酸異戊酯(isopentyl acetate，IPA)、乙酸辛酯(octayl acetate，OA)、乙酸芐酯(benzyl acetate，BA)和其他化合物[5-7]。IPA 是報(bào)警信息素混合物的主要活性成分，但是易揮發(fā)，所以IPA 無法有效地標(biāo)記到入侵者，召集其他蜜蜂進(jìn)行進(jìn)一步的攻擊；OA的揮發(fā)性較小，具有持久性，可以幫助蜜蜂定位移動(dòng)的目標(biāo)；BA 能有效增加蜂房中扇風(fēng)蜜蜂的數(shù)量，這可能是防御性反應(yīng)的一部分[8-9]。

中國是世界上產(chǎn)茶最多的國家，茶葉的種植主要集中在中國南方，是某些地區(qū)的主要蜜源植物。茶花花蜜中含有一定量的茶多酚(tea polyphenols，TP)。茶多酚又稱為兒茶素，屬多酚類物質(zhì)，是一種多羥基酚類衍生物的混合物，主要由表兒茶素(epicatechin，EC)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)和表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate，ECG) 組成；其中，EGCG 具有抗氧化、抗炎和鐵螯合特性，是TP 最主要的功能成分[10-11]。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，EGCG調(diào)節(jié)黑質(zhì)中的膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，降低氧化應(yīng)激，可以降低帕金森病的發(fā)生[12]。TP 具有二價(jià)金屬螯合、抗氧化和抗炎活性，能夠穿透大腦屏障，并治療神經(jīng)疾病細(xì)胞和保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞[13]。

觸角是蜜蜂聽覺和嗅覺感受器，主要感知周圍環(huán)境和接收化學(xué)信號[14-15]。觸角電位(electroantennogram，EAG)技術(shù)可以直接檢測昆蟲對化學(xué)信號的反應(yīng)[16]。EAG 原理是當(dāng)昆蟲觸角的嗅覺受體神經(jīng)元受到氣味刺激時(shí)，整個(gè)觸角會形成串聯(lián)電路，觸角端部與基部之間會產(chǎn)生生物電位，記錄觸角端部和基部間電位的變化[17]。EAG被廣泛用于昆蟲電生理學(xué)和化學(xué)生態(tài)學(xué)研究[17-18]。蜜蜂進(jìn)行個(gè)體之間的交流很大程度上依賴于信息素[4]。同時(shí)，蜜蜂也是公認(rèn)的研究神經(jīng)生物學(xué)的模式生物，可用于脊椎動(dòng)物神經(jīng)生物學(xué)的比較研究[19]。蜜蜂在進(jìn)行采集活動(dòng)時(shí)，會遇到不同的外界蜜源，一些蜜源植物含有茶多酚。茶多酚能否改善采集蜂對報(bào)警信息素的EAG 反應(yīng)？這是一個(gè)值得探究的問題。蜜蜂對化學(xué)信號有優(yōu)秀的認(rèn)知能力，從而更利于蜂群的生存和發(fā)展[20]。本研究通過飼喂西方蜜蜂不同質(zhì)量濃度的TP 溶液，分別在2 h 和5 d 后檢測其對3 種蜜蜂報(bào)警信息素成分IPA、BA 和OA 的EAG 反應(yīng)，研究結(jié)果有助于揭示短期和長期食用TP 蜜蜂的嗅覺神經(jīng)對報(bào)警信息素的敏感性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

以30% (w/v)的蔗糖水為溶劑，配制不同質(zhì)量濃度的TP 溶液，分別為0、10 和100 μg/mL。以正己烷為溶劑，將3 種蜜蜂報(bào)警信息素(表1)標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成質(zhì)量濃度為100 ng/mL 的溶液。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

觸角電位儀主要由以下幾部分組成：(1)由學(xué)習(xí)記憶檢測裝置構(gòu)成刺激控制系統(tǒng)；(2) 電極固定器；(3)放大器(荷蘭Syntech 公司)；(4) HP34 405A 數(shù)字萬用表(美國Agilent 公司)作為數(shù)據(jù)采集控制器；(5) 裝有BenchVue 軟件(美國Keysight 公司)的臺式電腦。

1.3 蜂群準(zhǔn)備

試驗(yàn)用蜂群由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院東方蜜蜂研究所提供。在實(shí)驗(yàn)蜂場選擇3 群群勢相當(dāng)且均有4 脾以上的蜂群。適宜的天氣條件下，10：00—11：00 之間用玻璃試管在試驗(yàn)蜂群巢門口抓捕外出的采集蜂，用不同質(zhì)量濃度TP 溶液飼喂2 h 和5 d 后分別進(jìn)行EAG 反應(yīng)檢測。

表1 蜜蜂報(bào)警信息素組分信息Tab.1 Honeybee alarm pheromone components information

1.4 試驗(yàn)方法

首先將毛細(xì)管拉制成EAG 反應(yīng)所需的玻璃電極備用，準(zhǔn)備好洗凈并烘干的巴斯德管和用正己烷浸泡過的濾紙條(0.4 cm×2.0 cm)。EAG 系統(tǒng)中連接蜜蜂觸角基部的電極吸入昆蟲生理鹽水，連接頂端的電極以Ringer 溶液為緩沖液，所采用的金屬絲為鉑絲。用0.5～10 μL 移液槍取5 μL IPA、BA 和OA 樣品滴到濾紙片上，然后用干凈的鑷子把濾紙片放進(jìn)巴斯德管，管口連接刺激控制系統(tǒng)。先用對照氣味正己烷刺激蜜蜂觸角，再換其他氣味。氣味刺激由低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度的順序進(jìn)行。蜜蜂EAG 反應(yīng)過程中，氣流的速度為15 mL/s，氣味刺激持續(xù)時(shí)間為3 s，每次刺激時(shí)間間隔30 s，相對濕度90%，放大器的放大倍數(shù)是21 倍[21]。

取出準(zhǔn)備好的蜜蜂，從觸角基部剪下左觸角，再剪下該觸角頂端2 節(jié)鞭節(jié)，迅速置入電極，待基線平穩(wěn)后開始試驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集和記錄。

同樣的方法測試該蜜蜂的右側(cè)觸角發(fā)現(xiàn)左右觸角反應(yīng)沒有明顯差異，因此之后的試驗(yàn)均采用蜜蜂左側(cè)觸角進(jìn)行EAG 反應(yīng)試驗(yàn)。蜜蜂觸角被刺激時(shí)，電腦上的BenchVue 波形圖波峰與波谷之間會出現(xiàn)電壓差，記錄下該數(shù)據(jù)作為反應(yīng)值。每一蜂群各處理收集6 只采集蜂的數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0 軟件對收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。單變量分析出各處理組平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，單因素分析各組之間的差異顯著性，對多組數(shù)據(jù)的多重比較采用Duncan 檢驗(yàn)分析方法進(jìn)行分析。對試驗(yàn)分析結(jié)果采用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜜蜂食用不同質(zhì)量濃度TP 溶液2 h 和5 d后的EAG 反應(yīng)

由圖1 所示：飼喂采集蜂TP 溶液2 h 和5 d后，對IPA 的EAG 反應(yīng)均有增強(qiáng)的趨勢，且2 h試驗(yàn)組蜜蜂的EAG 反應(yīng)更明顯，但是差異不顯著。飼喂2 h 后的蜜蜂對OA 的EAG 反應(yīng)隨質(zhì)量濃度升高而有明顯下降的趨勢，而飼喂5 d 的蜜蜂對OA 的EAG 反應(yīng)和對照組相比明顯升高且差異顯著，因此飼喂蜜蜂TP 后因飼喂持續(xù)時(shí)間的長短而呈現(xiàn)出完全相反的結(jié)果。飼喂不同質(zhì)量濃度TP 的蜜蜂對BA 的EAG 反應(yīng)與對照組比較沒有顯著差異，2 h 和5 d 試驗(yàn)組的蜜蜂之間的EAG 反應(yīng)也沒有差異。

2.2 采集蜂食用不同質(zhì)量濃度TP 溶液后對不同氣味的EAG 反應(yīng)

由圖2 所示：從總體情況看，飼喂蜜蜂2 h和5 d 其EAG 反應(yīng)趨勢基本一致，均顯示蜜蜂對BA 的反應(yīng)更為明顯。飼喂TP 溶液2 h 后，采集蜂對BA 的EAG 反應(yīng)最強(qiáng)，明顯高于IPA 和OA；食用TP 溶液2 h 后的蜜蜂對OA 的EAG 反應(yīng)比IPA 小。飼喂TP 溶液5 d 的蜜蜂同樣對BA 的EAG 反應(yīng)最強(qiáng)，且與IPA 和OA 差異顯著(100 μg/mL 試驗(yàn)組除外)；但5 d 的蜜蜂對OA 的EAG 反應(yīng)比IPA 強(qiáng)，盡管10 μg/mL 試驗(yàn)組中二者之間的差異不顯著。也就是說，蜜蜂對IPA 和OA 的EAG 反應(yīng)呈現(xiàn)出了時(shí)間效應(yīng)。

3 討論

總的來說，蜜蜂對3 種信息素均有不同程度的EAG 反應(yīng)，這也反映出蜜蜂在社會活動(dòng)中對不同報(bào)警信息素所產(chǎn)生的行為差異。

圖1 飼喂采集蜂TP 溶液2 h 和5 d 后的EAG 反應(yīng)比較Fig.1 Comparison of EAG responses after feeding foragers TP solution for 2 h and 5 d

圖2 采集蜂對IPA、BA 和OA 的EAG 反應(yīng)比較Fig.2 Comparison of EAG responses of foragers to IPA,BA and OA

IPA 和OA 的釋放量隨著工蜂的年齡增長而增加，在第30～40 天增加至最高水平。同一蜂群中，守衛(wèi)蜂和采集蜂釋放IPA 和OA 的量最大[22]。本研究發(fā)現(xiàn)：蜜蜂對IPA 的EAG 反應(yīng)根據(jù)時(shí)間作用長短和質(zhì)量濃度的變化所做出的反應(yīng)變化不是很明顯，但是短時(shí)效應(yīng)相對長時(shí)效應(yīng)反應(yīng)更為明顯。就OA 而言，蜜蜂在食用茶多酚2 h 和5 d 的EAG 反應(yīng)，呈現(xiàn)出截然相反的結(jié)果，具體表現(xiàn)為茶多酚短時(shí)作用讓蜜蜂對OA 的反應(yīng)隨質(zhì)量濃度的升高而出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，而茶多酚長時(shí)作用下讓蜜蜂對OA 的反應(yīng)隨質(zhì)量濃度的升高而出現(xiàn)上升的現(xiàn)象，說明蜜蜂在茶多酚干預(yù)下，根據(jù)干預(yù)時(shí)間的長短而表現(xiàn)出不同的應(yīng)對反應(yīng)，提示蜜蜂會根據(jù)外界環(huán)境的變化而做出不同的應(yīng)對策略。

BA 不同于IPA 和OA，采集蜂的BA 釋放量最高，而守衛(wèi)蜂和內(nèi)勤蜂等其他崗位的工蜂釋放BA 的量比采集蜂低很多，也就是說BA 釋放量與蜜蜂年齡無關(guān)，而與蜜蜂的工作相關(guān)[22]。如果BA 是采集蜂用于標(biāo)記采集時(shí)或返回巢穴入口時(shí)遇到危險(xiǎn)的報(bào)警信息素化合物，那么采集蜂的BA 水平升高是合理的。BA 在蜜蜂防御中起到標(biāo)記危險(xiǎn)的作用，而不同于IPA 和OA 可以引起蜜蜂攻擊。采集蜂在野外進(jìn)行采集活動(dòng)時(shí)，對BA敏銳的識別能力可以幫助其提前感知危險(xiǎn)信息并規(guī)避。如果采集蜂對IPA 和OA 的敏感性和BA一樣，那么蜂群在防御活動(dòng)中的損失將會很大。其他研究結(jié)果同樣也發(fā)現(xiàn)采集蜂對BA 有較強(qiáng)的EAG 反應(yīng)[23]。不管從短效還是長效作用來說，蜜蜂對BA 的EAG 反應(yīng)最為強(qiáng)烈，表明蜜蜂食用茶多酚之后，對BA 依然保持高度的敏感性，這與前人研究的結(jié)果相吻合[23]。前人研究表明：蜜蜂在食用能使之興奮的物質(zhì)如咖啡因的情況下對外界的信息更加敏感[24]。茶多酚與咖啡因有類似的能讓動(dòng)物個(gè)體產(chǎn)生興奮的功能，如果蜜蜂在自然狀況下采集到含有TP 的蜜源，短期內(nèi)蜜蜂對同伴釋放的報(bào)警信息素更敏感，但鎖定攻擊目標(biāo)的能力變?nèi)?。長期食用含TP 花蜜的蜜蜂對報(bào)警信息素更敏感，這使蜂群的防御能力增強(qiáng)，人類或其他動(dòng)物更容易受到這種蜜蜂的攻擊。本試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了蜜蜂在TP 干預(yù)下對不同報(bào)警信息素的敏感性發(fā)生明顯變化，側(cè)面表明了蜜蜂對外界環(huán)境變化的適應(yīng)能力。

另外值得一提的是，蜜蜂對OA 的EAG 反應(yīng)在控制氣味正己烷的刺激作用下表現(xiàn)出明顯差異。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推測其原因，可能是由于在限制蜜蜂采集活動(dòng)的情況下進(jìn)行試驗(yàn)，對蜜蜂的生理產(chǎn)生了一定程度的改變，故降低了對氣味的敏感性。但是TP 能讓蜜蜂提高其對報(bào)警氣味的敏感性(圖1)。從這一角度分析也得出TP 提高蜜蜂對報(bào)警信號的敏感性具有明顯作用。

4 結(jié)論

報(bào)警信息素作為蜜蜂防御行為和應(yīng)激行為的信息交流媒介，對蜜蜂的生命活動(dòng)至關(guān)重要。本研究表明：茶多酚長效作用于蜜蜂能提高其對報(bào)警信息素的敏感性，對今后報(bào)警信息素的研究可以提供一定的理論參考依據(jù)。