白勝超，陳圣菊，李俊平，尚畫雨，高揚，王瑞元

人體長時間進行大負荷運動或是承受不適應的運動負荷后，肌肉會出現(xiàn)收縮能力下降、酸痛、超微結(jié)構(gòu)改變等，甚至造成運動性骨骼肌損傷[1]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大負荷運動后可導致骨骼肌肌漿網(wǎng)腫脹，誘導微管解聚，通過微管相關(guān)蛋白4（mitogen-acti‐vated protein kinase4，MAP4）與電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC）的結(jié)合影響線粒體的形態(tài)，表現(xiàn)為線粒體大小不一、腫脹、嵴稀少，或空泡化，出現(xiàn)嚴重的結(jié)構(gòu)異常現(xiàn)象[2]。之后又對線粒體分布進行了研究，發(fā)現(xiàn)大負荷運動可引起骨骼肌線粒體再分布，主要為肌膜下大量聚積，疑似和線粒體分裂具有重要關(guān)系。

線粒體分裂是線粒體動力學的重要方面，與線粒體的形態(tài)、移動、數(shù)量均具有重要關(guān)系，影響后續(xù)自噬與凋亡的發(fā)生以及骨骼肌的功能，是整個運動性骨骼肌損傷中非常重要的一環(huán)。線粒體受到損傷后會發(fā)生分裂，受損部分斷裂，通過后續(xù)的線粒體融合完成自我修復或是線粒體自噬進行清除，運動后線粒體分裂是完成損傷修復的必要過程，影響骨骼肌的恢復以及運動訓練的實際效果。調(diào)控線粒體分裂的主要蛋白為DRP1（dynamin-relatedprotein1，DRP1）、線粒體分裂蛋白1（mitochondrial fission protein1，F(xiàn)is1），線粒體分裂因子（mitochondrial fission factor，MFF）等[3]。研究指出，DRP1 起到關(guān)鍵作用，大量聚集形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，對線粒體收縮切割使其分裂[4]。最新研究發(fā)現(xiàn)，低氧或是用FCCP（具有降低線粒體膜電勢的作用）處理細胞可以引起細胞線粒體分裂增加，主要通過FUNDC1（FUN14 domain containing 1，F(xiàn)UNDC1）與視神經(jīng)萎縮癥蛋白1（optic atrophy1，OPA1）、鈣聯(lián)結(jié)蛋白（Calnexin，CNX）、DRP1等蛋白的相互結(jié)合所致[5]。這提示，大負荷運動后骨骼肌線粒體的分裂過程可能會通過FUNDC1的介導實現(xiàn)。

運動后骨骼肌的修復過程逐漸加強，在此期間線粒體可能一直處于高度動態(tài)變化之中，因此，探究大負荷運動后多時相下的骨骼肌線粒體分裂現(xiàn)象具有重要意義，能夠提高對骨骼肌損傷機理的深層認識，豐富骨骼肌修復的理論基礎。目前，關(guān)于運動后骨骼肌線粒體分裂的研究大多集中在某一時間點，并未進行前后多時相研究，對線粒體分裂的動態(tài)變化及其過程尚不明確。一次性大負荷離心運動后大鼠比目魚肌會造成運動性骨骼肌損傷，線粒體出現(xiàn)明顯腫脹和肌膜下積聚等超微結(jié)構(gòu)異常變化[6]。因此，本研究借鑒該模型進行干預，使用透射電鏡觀察骨骼肌線粒體是否出現(xiàn)片段化；免疫熒光檢測線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶20（Translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOMM20）與DRP1 的共定位確定線粒體是否出現(xiàn)分裂現(xiàn)象；Western Blot 方法檢測線粒體中DRP1 蛋白量，確定線粒體分裂程度，從而明確大負荷運動后不同時相下骨骼肌線粒體分裂的動態(tài)情況；Western Blot 方法檢測骨骼肌中FUNDC1 表達量，確定線粒體分裂是否和FUNDC1 表達具有關(guān)系，免疫共沉淀檢測FUNDC1 與OPA1、CNX、DRP1 等蛋白的相互作用，從分子水平上進一步明確大負荷運動后骨骼肌線粒體的分裂過程。以期能夠從線粒體分裂角度對運動性骨骼肌損傷與修復的機理進行一定理論補充。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF 級別8 周齡雄性Spraque-Dawley 大 鼠64 只，體重（220.21±8.39）g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（SCXK 京2012-0001：使用許可證號）。北京體育大學標準動物房內(nèi)進行分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度（23±3)℃，相對濕度40%~70%，室內(nèi)12 h 明暗切換模擬白晝，自由進食、飲水，該實驗已獲得倫理委員會批準。

所有大鼠均進行適應性3 天飼養(yǎng)，之后隨機分組為安靜對照組（C 組，n=8）和單純運動組（E 組，n=56）。單純運動組根據(jù)干預后時間點不同，又分為0、2、6、12、24、48和72 h等時相組（見表1）。

表1 實驗動物分組Table1 Groups of Experimental Animals

1.2 運動模型

大鼠運動模型的預適應期參照趙曉琴[7]方案進行，為期3 天，方式為：單純運動組大鼠在小動物電動跑臺上進行規(guī)定速度的運動，第1天跑臺坡度為0°，速度為16 m/min，訓練5 min；第2 天跑臺坡度為0°，速度為16 m/min，訓練10 min；第3 天休息。正式實驗運動方案參照R.B.ARMSTRONG[6-8]經(jīng)典離心運動模型，造成比目魚肌運動性骨骼肌損傷，跑臺坡度為-16°，速度16 m/min，運動時間為1.5 h。

1.3 樣本采集

分別對應實驗的時相點進行取材，按照3.5 mL/kg劑量進行水合氯醛麻藥腹腔注射，采血管主動脈取血，之后取出比目魚肌，用于后續(xù)樣品制備。

取部分比目魚肌，體積為1×1×1 mm3，置于4 ℃預冷的2.5%戊二醛固定液中，用于后續(xù)電鏡檢測。取部分比目魚肌，體積為4×4×4 mm3，OCT 包埋后存于冰箱，用于后續(xù)免疫熒光實驗。取100 mg 新鮮比目魚肌，嚴格按照碧云天線粒體分離試劑盒（C3606）進行操作，差速離心提取線粒體，加入存儲液轉(zhuǎn)存冰箱，用于Western Blot 檢測。取部分比目魚肌錫紙包裹投入液氮中暫存，最終轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中儲存，用于免疫共沉淀測試。

1.4 主要儀器與試劑

1.4.1 透射電子顯微鏡觀察骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化 （1）磷酸鹽緩沖液沖洗樣品。（2）鋨酸固定后梯度酒精脫水。（3）環(huán)氧樹脂包埋后切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色液染色。（4）干燥后進行觀察結(jié)構(gòu)，電鏡（×2 000~8 000）隨機進行拍攝。具體步驟參照相關(guān)文獻操作[6]。

1.4.2 免疫熒光檢測骨骼肌線粒體TOMM20/DRP1的共定位 （1）冰凍切片。（2）丙酮液固定。（3）PBS 清洗后滴加5%的羊血清封閉，37 ℃，30 min。（4）滴加羊血清稀釋過的一抗TOMM20（英國，Abcam 公司）與DRP1（英國，Abcam 公司），稀釋比例1:400，4 ℃過夜孵育。（5）PBS清洗后滴加羊血清配制的二抗（中國，伊萊瑞特生物科技股份有限公司），比例1:250，室溫孵育2 h。（6）PBS 清洗后滴加DAPI封片。（7）激光共聚焦設置波長為488 和555 2 種，隨機采集視野，圖片用IPP6.0軟件分析共定位百分數(shù)。具體步驟參照相關(guān)文獻操作[6]。

1.4.3 Western Blot測定線粒體DRP1 蛋白量、骨骼肌FUNDC1表達量（1）比目魚肌剪碎勻漿并離心（12 000 g，4 ℃，10 min），上清液和線粒體樣品分別用BCA 試劑盒進行蛋白定量，加入樣緩，煮沸保存。（2）加入樣品。（3）電泳80 V 恒壓。（4）300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜。（5）5%BSA室溫搖床封閉2.5 h。（6）滴加封閉液稀釋的一抗，稀釋比例為DRP1（1:800）（英國，Abcam公司），線粒體內(nèi)參COXⅣ（1:2 000），F(xiàn)UNDC1（1:400）（美國，Millipore 公司），GAPDH（1:2 000）（中國，中衫金橋），4 ℃過夜。（7）TBST 清洗后滴加對應的二抗（中國，中衫金橋），濃度均為1:6 000，孵育2 h。（8）TBST 清洗后滴加發(fā)光液放入成像系統(tǒng)采集圖片。所有蛋白結(jié)果用Gel-pro分析灰度值，所得結(jié)果用目的蛋白/內(nèi)參計算比之后，每組數(shù)據(jù)再除以對照組，便于進行倍數(shù)比較。FUNDC1 抗體存在多條條帶，根據(jù)說明書的要求，選取17kDa的條帶進行分析。具體步驟參照相關(guān)文獻操作[6]。

1.4.4 免疫共沉淀測定骨骼肌FUNDC1 與OPA1、CNX、DRP1 等蛋白的相互結(jié)合作用 （1）比目魚肌加入IP 裂解液，進行剪碎勻漿并離心（12 000 g，4 ℃，10 min）。（2）PBS 稀釋蛋白到1 ug/uL 的濃度，取1 mL量，加入1 uL 兔IgG，加入20 uL 的珠子混勻，2 h，4 ℃環(huán)境。（3）離心（14 000 g，4 ℃，10 min），取上清，棄沉淀。（4）加入抗體一FUNDC1（美國，Millipore公司），設置陰性對照組，4 ℃過夜。（5）加入30 uL 的珠子，4 ℃，2 h孵育，之后離心（14 000 g，4 ℃，10 min），保留沉淀，清洗后加入樣緩，煮沸保存。（6）蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，同Western Blot 實驗方法。具體步驟參照相關(guān)文獻操作[7]。

1.5 統(tǒng)計處理

采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差（x±s）的形式表示。實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊性時用LSD 方法進行組內(nèi)多重比較，方差不齊時采用Tamhanes’方法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 大負荷運動后不同時相下骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化

首先使用透射電鏡，對運動及針刺后不同時相下骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)進行觀察發(fā)現(xiàn)，單純進行運動，E2、E6 組線粒體明顯腫脹變圓，結(jié)構(gòu)不清晰，并出現(xiàn)少量疑似線粒體的片段；E12 組線粒體分布不均，出現(xiàn)大小不一的線粒體片段，2 μm 標尺下數(shù)量更為明顯，線粒體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)更明顯腫脹，部分膜結(jié)構(gòu)不清晰，形狀扭曲；E24 組肌原纖維間片段化的細小線粒體數(shù)量依然較多，線粒體的長條形態(tài)并不清晰，結(jié)構(gòu)依然腫脹；E48 組線粒體細小片段數(shù)量已經(jīng)明顯觀察到小于E12 組的表現(xiàn)，偶見多余數(shù)量的線粒體；E72 組未觀察到明顯的線粒體片段，但略有缺失（見圖1）。

2.2 大負荷運動后不同時相下TOMM20 和DRP1 共定位的變化

激光共聚焦顯微鏡采集圖像顯示（見圖2），藍色熒光為細胞核，TOMM20 為線粒體膜標志蛋白，陽性表達呈綠色熒光，DRP1 為線粒體分裂標志蛋白，陽性表達呈紅色熒光，TOMM20 和DRP1 發(fā)生共定位呈黃色，說明DRP1 蛋白轉(zhuǎn)位到線粒體，陰性對照組紅色和綠色熒光較少，黃色熒光未發(fā)現(xiàn)。采用IPP 圖像分析軟件對圖像進行分析，以共定位百分比值表示TOMM20 和DRP1 共定位的量，組間同一時間點的相互比較詳見表2。

圖1 大負荷運動后不同時相下骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化Figure 1 Ultrastructural Changes of Skeletal Muscle Mitochondria under Different Phases after a Heavy-Load Exercise

圖2 運動后不同時相下骨骼肌TOMM20/DRP1共定位Figure2 The Colocalization of Skeletal Muscle TOMM20/DRP1 at Different Time Phase after Exercise

表2 運動后不同時相線粒體TOMM20/DRP1共定位比值變化（n=8）Table2 Changes in Co-Localization Ratio of Mitochondria TOMM20/DRP1 at Different Time Phases after Exercise（n=8）

2.3 大負荷運動后不同時相下線粒體DRP1蛋白變化

線粒體DRP1 蛋白的表達量是檢測線粒體分裂程度的重要指標，Gel-pro分析軟件對蛋白圖像的分析顯示，運動后不同時相呈現(xiàn)不同程度變化，運動后0 h 開始升高，在運動后12 h達到最高值并持續(xù)到24 h，之后出現(xiàn)降低現(xiàn)象，整體呈現(xiàn)為先升高再降低趨勢。運動后0、2、6、12、24、48 和72 h 組與安靜組相比差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）（見圖3）。

圖3 運動后不同時相下骨骼肌線粒體DRP1蛋白表達Figure3 Expression of DRP1 in Skeletal Muscle Mitochondria at Different Phases after Exercise

2.4 大負荷運動后不同時相下骨骼肌FUNDC1蛋白表達量變化

Gel-pro分析軟件對蛋白圖像的分析顯示，在運動后不同時相略有變化，但變化趨勢不明顯。單因素方差分析顯示，運動未對FUNDC1指標產(chǎn)生顯著影響（P>0.05），除運動后72 h 與安靜對照組具有顯著性差異外（P<0.05），其余時相差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（見圖4）。

圖4 運動后不同時相下骨骼肌FUNDC1蛋白表達Figure4 Expression of FUNDC1 in Skeletal Muscle in Different Phases after Exercise

2.5 大負荷運動后不同時相骨骼肌FUNDC1 與OPA1的相互作用

Gel-pro分析軟件對蛋白圖像的分析顯示，在運動后不同時相下，F(xiàn)UNDC1與OPA1的結(jié)合呈不同程度變化，安靜對照組最高，運動后即刻開始逐漸降低，在運動后12 h達到最低值，并持續(xù)到24 h，之后開始升高，整體呈現(xiàn)先降低再升高趨勢。提示，骨骼肌FUNDC1 與OPA1 結(jié)合為安靜時的正常狀態(tài)。單因素方差分析結(jié)果顯示，運動對FUNDC1/OPA1指標產(chǎn)生顯著影響（P<0.01）。運動后所有時相組與安靜對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05 或P<0.01）（見圖5）。

圖5 運動后不同時相骨骼肌FUNDC1/OPA1蛋白結(jié)合量Figure5 The Binding Amount of FUNDC1/OPA1 in Skeletal Muscle of Different Phases after Exercise

2.6 大負荷運動后不同時相骨骼肌FUNDC1與CNX的相互作用

Gel-pro分析軟件對蛋白圖像的分析顯示，在運動后不同時相下，F(xiàn)UNDC1與CNX的結(jié)合呈不同程度變化，運動后0 h 開始逐漸升高，在運動后2 h 達到最高值，6 h 雖有降低但依然顯著高于安靜對照組（P<0.01），之后開始降低，整體呈現(xiàn)為先升高再降低趨勢，其峰值數(shù)值在FUNDC1/OPA1 結(jié)合之后。提示，運動后骨骼肌FUNDC1 后于CNX 結(jié)合。單因素方差分析結(jié)果顯示，運動對FUNDC1/CNX 指標產(chǎn)生顯著影響（P<0.01）。運動后0、2 和6 h 組與安靜對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）（見圖6）。

圖6 運動后不同時相骨骼肌FUNDC1/CNX蛋白結(jié)合量Figure6 The Binding amount of FUNDC1/CNX in Skeletal Muscle of Different Phases after Exercise

2.7 大負荷運動后不同時相骨骼肌FUNDC1 與DRP1的相互作用

Gel-pro分析軟件對蛋白圖像的分析顯示，在運動后不同時相下，F(xiàn)UNDC1 與DRP1 的結(jié)合呈不同程度變化，運動后0 h 開始逐漸升高，在運動后12 h 達到最高值并維持到24 h，兩時相均值顯著高于其他時相（P<0.01），之后開始降低，整體呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，與線粒體DRP1 的趨勢相似。單因素方差分析結(jié)果顯示，運動對FUNDC1/DRP1 指標產(chǎn)生顯著影響（P<0.01）。運動后6、12、24、48 和72 h 組與安靜對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）（見圖7）。

圖7 運動后不同時相骨骼肌FUNDC1/DRP1蛋白的結(jié)合量Figure7 The Binding amount of FUNDC1/DRP1 in Skeletal Muscle of Different Phases after Exercise

3 分析與討論

線粒體是維持生物體眾多生理活動的基礎，在ATP 生成過程中起到重要作用[9]，線粒體分裂可以將受損線粒體從完整結(jié)構(gòu)上分離下來，通過后續(xù)融合途徑修復損傷或自噬途徑清除受損部分，是維持線粒體質(zhì)量的重要方式[10]，決定線粒體的形態(tài)、數(shù)量及分布。

透射電鏡可以觀察骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)。S.B.ONG[11]研究發(fā)現(xiàn)，在心臟缺血再灌注后線粒體心肌細胞出現(xiàn)線粒體片段化現(xiàn)象，有大量細小的線粒體存在，是線粒體分裂的直觀證據(jù)，目前在骨骼肌中直接觀察線粒體片段化現(xiàn)象的研究較少。實驗室前期發(fā)現(xiàn)，大負荷運動后骨骼肌線粒體出現(xiàn)腫脹、嵴結(jié)構(gòu)不清晰現(xiàn)象，在運動后一段時間逐漸加重[12]，疑似和線粒體的分裂有關(guān)。為了驗證一次大負荷運動后線粒體是否存在片段化現(xiàn)象，本實驗首先使用透射電鏡對運動后不同時相下骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)進行觀察。發(fā)現(xiàn)，一次大負荷運動后即刻骨骼肌線粒體未有明顯的線粒體片段；運動后6 h 有線粒體腫脹、變圓，部分膜結(jié)構(gòu)不清晰；運動后12 h 線粒體分布更不均勻，肌原纖維間積聚大量線粒體片段，出現(xiàn)不同體積的細小線粒體，此時線粒體片段化程度最為嚴重；運動后24 h肌原纖維間細小線粒體數(shù)量開始減少，雖然仍較大較圓但膜結(jié)構(gòu)較清晰，嵴變多而密，片段化程度有所降低；運動后48 h 線粒體片段化程度遠遠小于運動后12 h的表現(xiàn)，可能此階段線粒體融合能力遠大于線粒體分裂能力，使得線粒體片段明顯減少；運動后72 h 線粒體形態(tài)已經(jīng)基本恢復到正常水平，肌原纖維間未觀察到明顯細小線粒體，但略有缺失。

透射電鏡觀察到線粒體明顯的片段，說明可能存在線粒體分裂現(xiàn)象。為了進一步驗證大負荷運動后骨骼肌線粒體是否出現(xiàn)分裂，本研究用TOMM20標記線粒體，并與線粒體分裂的重要指標蛋白DRP1 進行免疫熒光雙標實驗，共定位百分比增多則表明線粒體分裂現(xiàn)象加強。劉慧君[13]研究表明，對小鼠進行一次性中等負荷運動，DRP1 指標在運動1 和1.5 h 其mRNA 水平以及蛋白表達水平都出現(xiàn)升高現(xiàn)象，而線粒體融合蛋白出現(xiàn)降低，說明在運動過程中骨骼肌線粒體趨向于分裂。漆正堂[14]發(fā)現(xiàn)，8 周間歇訓練可以明顯降低線粒體膜DRP1 蛋白表達，提高線粒體融合蛋白Mfn2 表達，認為低強度的運動訓練對各類蛋白均無影響。C.JAMART[15]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在禁食狀態(tài)下進行低強度運動，發(fā)現(xiàn)DRP1在運動后明顯增加，并且和飲食狀態(tài)無關(guān)。A.GARNIER[16]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過長期有氧運動訓練后，骨骼肌線粒體氧化磷酸化能力明顯增加，DRP1 基因表達也出現(xiàn)增高，進行長期的有氧訓練可以提高骨骼肌線粒體Mfn2 和DRP1 表達。從以上研究可以發(fā)現(xiàn)，長期運動訓練和一次性運動所得到的結(jié)果差異較大，并且不同的運動形式所檢測的結(jié)果也存在一定偏差，說明運動對線粒體分裂的影響存在較多因素。以上研究中也同樣存在一定不足，大多集中在骨骼肌細胞DRP1 的檢測中，除漆正堂外均未進行線粒體膜上DRP1 的檢測，可能真正轉(zhuǎn)移到線粒體上的DRP1 才是發(fā)揮作用的重要部分。因此，本研究通過對線粒體外膜標記蛋白TOMM20 和DRP1 免疫熒光共定位，檢測DRP1是否轉(zhuǎn)位到線粒體上，并進行線粒體上DRP1 的Western Blot 半定量，明確線粒體分裂程度。實驗結(jié)果表明，運動后共定位百分比增多，在12 h達到最高值，并持續(xù)到24 h，之后逐漸降低。

透射電鏡和免疫熒光雙標的實驗結(jié)果均表明，在運動后骨骼肌線粒體出現(xiàn)分裂現(xiàn)象，但對于分裂的程度還不能準確的呈現(xiàn)。為了確定分裂程度，本研究使用Western Blot對線粒體分裂指標DRP1進行半定量檢測。DRP1蛋白量檢測發(fā)現(xiàn)，大負荷運動后0 h相比于安靜對照組雖然未有明顯差異，但均值已經(jīng)開始增加，同樣在12~24 h達到峰值，之后逐漸降低，72 h已接近安靜對照組水平。實驗結(jié)果均與電鏡觀察基本一致，說明一次大負荷運動可引起骨骼肌線粒體分裂。需要指出的是，在運動后72 h免疫熒光共定位和蛋白半定量分析的結(jié)果都高于安靜對照組，但前者已經(jīng)不具有顯著性差異，后者卻存在顯著性差異，說明此時骨骼肌線粒體雖然出現(xiàn)恢復，但依然未完全達到安靜時水平。出現(xiàn)不一致的原因可能是，免疫熒光共定位是多個切片統(tǒng)計的結(jié)果，在進行定量分析時存在一定誤差，而Western Blot是骨骼肌線粒體整體濃度的計算，在細微差別上半定量的蛋白分析相比更為準確一些。通過以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，一次大負荷運動后骨骼肌線粒體的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化，并呈時相性變化，在12~24 h 分裂現(xiàn)象明顯，同時線粒體的分裂蛋白也達到峰值，說明DRP1 是大負荷運動后骨骼肌線粒體分裂過程的重要參與蛋白。

線粒體分裂是復雜的生物過程，受一系列蛋白的精確調(diào)控。FUNDC1是一種哺乳動物中定位在線粒體上高度保守的跨膜蛋白，由155 個氨基酸構(gòu)成[17]，可與LC3 相互作用介導線粒體自噬，在調(diào)控線粒體分裂和自噬中發(fā)揮了重要作用[18]。在細胞實驗中，用低氧或FCCP 處理后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UNDC1 引起線粒體分裂[19-20]。V.D.BLIEK[21]研究指出，F(xiàn)UNDC1的長期調(diào)節(jié)是通過mi‐croRNA的表達實現(xiàn)的，而短時間的FUNDC1可以通過PGAM5 或是ULK1 來調(diào)節(jié)自身的磷酸化水平發(fā)揮作用。為了明確一次大負荷運動后骨骼肌線粒體分裂的過程是否和FUNDC1 蛋白的表達量有關(guān)，本研究中對FUNDC1 蛋白表達量進行了檢測，發(fā)現(xiàn)在一次大負荷運動后，骨骼肌FUNDC1 蛋白在不同時相下變化趨勢并不明顯，運動并未對該蛋白產(chǎn)生顯著影響。這和Bliek的研究結(jié)果類似，說明一次性的大負荷運動導致線粒體分裂增多可能并不是通過提高FUNDC1的表達量實現(xiàn)的，還需進一步研究。在運動后72 h，F(xiàn)UNDC1蛋白與安靜對照組相比，出現(xiàn)顯著升高，可能是由于運動所引起的因素更為廣泛，與細胞實驗單一干預處理所呈現(xiàn)的結(jié)果并不完全相同。但考慮到運動后DRP1的變化主要是在72 h 之前，并且在此前的時相中FUNDC1表達并未有明顯變化，所以本研究認為，運動后FUNDC1 發(fā)揮作用并不是由于表達量的改變，而是通過其他方式導致運動后骨骼肌線粒體的分裂。

W.WU等[22]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UNDC1是低氧刺激下線粒體片段化的必需蛋白，沉默F(xiàn)UNDC1或DRP1、CNX等蛋白均能發(fā)現(xiàn)線粒體延長。林春霞[23]研究發(fā)現(xiàn)，在低氧處理后的細胞線粒體分裂過程中，F(xiàn)UNDC1 和CNX、DRP1 出現(xiàn)相互作用，結(jié)合峰值的先后時序認為FUNDC1 招募DRP1 導致線粒體分裂。M.CHEN 等[24]通過FCCP或是亞硒酸鹽處理細胞后誘導線粒體分裂，發(fā)現(xiàn)敲低FUNDC1后能夠使FUNDC1與OPA1的結(jié)合下降，線粒體分裂現(xiàn)象減少，線粒體融合能力明顯改善，同時也指出FUNDC1和OPA1在正常狀態(tài)下通過帶電荷的賴氨酸殘基錨定在一起。由此發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UNDC1與OPA1、CNX、DRP1等蛋白相互作用引起了線粒體的分裂。根據(jù)以上文獻研究結(jié)果推測，在大負荷運動后，F(xiàn)UNDC1與OPA1、CNX、DRP1等蛋白的結(jié)合可能是發(fā)揮作用的重要過程，因此本研究對這些蛋白進行了免疫共沉淀檢測。發(fā)現(xiàn)，運動后蛋白結(jié)合的趨勢變化非常明顯，在不同時相下所結(jié)合蛋白量也具有明顯差異，說明一次性大負荷運動后FUNDC1介導的線粒體分裂主要是與這些蛋白的結(jié)合作用實現(xiàn)，這和用FCCP處理的細胞實驗中的結(jié)果類似。實驗結(jié)果進行峰值時相比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UNDC1 與OPA1、CNX、DRP1 等蛋白峰值時相的數(shù)值也顯著高于其他時相點，在峰值出現(xiàn)先后順序上，安靜狀態(tài)和運動后0 h 時相點FUNDC1 與OPA1結(jié)合能力最強，在2 h和6 h時相點FUNDC1與CNX的結(jié)合最強，此時FUNDC1/OPA1 的結(jié)合能力已經(jīng)開始下降，在12 h 和24 h 時相點FUNDC1 與DRP1 的結(jié)合能力達到最高，而此時相下FUNDC1/CNX、FUNDC1/OPA1等結(jié)合能力均已較低，說明FUNDC1/OPA1是正常狀態(tài)下的結(jié)合形式。運動后，F(xiàn)UNDC1 開始與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白CNX 暫時性結(jié)合，猜測此過程可能主要是把FUNDC1 聚集到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體結(jié)合部位，為下一步DRP1的聚集提供位點。之后FUNDC1與CNX逐漸分離，開始與DRP1 結(jié)合，并聚集DRP1 到線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)連接部位，開始收縮切割完成線粒體分裂。

本研究通過透射電鏡、免疫熒光、Western Blot、免疫共沉淀等發(fā)現(xiàn)，大負荷運動會導致線粒體出現(xiàn)分裂現(xiàn)象，且呈時相性變化，并初步明確其分裂過程主要是通過FUNDC1 與OPA1、CNX、DRP1 等蛋白的先后結(jié)合實現(xiàn)。建議在進行后續(xù)的相關(guān)研究時可著重對12~24 h 進行深入探究，也可嘗試改變FUNDC1 與其他蛋白的結(jié)合程度，將進一步提高對線粒體自身修復和骨骼肌功能恢復的認識。

4 結(jié) 論

一次大負荷離心運動后，大鼠運動性骨骼肌損傷部位線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，出現(xiàn)分裂現(xiàn)象，分裂程度以及分裂蛋白DRP1 的表達均呈時相性的動態(tài)變化，在運動后即刻逐漸加劇，12、24 h最為明顯，48、72 h逐漸恢復，其分裂的過程為運動后蛋白FUNDC1 與OPA1 分離，轉(zhuǎn)而與CNX 結(jié)合，之后聚集DRP1 到線粒體上導致分裂發(fā)生。