宋 宇 劉 鵬 李 武 袁錦云 叢海燕 鞠 毅 姚繼承 王明義▲

1.威海市立醫(yī)院中心實驗室，山東威海 264200；2.深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司，廣東深圳 518052；3.威海威高生物科技有限公司，山東威海 264200

隨著醫(yī)療技術(shù)水平不斷提高，對微量物質(zhì)的定量檢測有了更高的要求，許多免疫檢測方法也得到了不斷的改進(jìn)和完善。長久以來，放射免疫分析法（RIA）、酶免疫分析法（EIA）、熒光免疫分析法（FIA）是臨床用于免疫定量分析的常用方法[1]。由于上述方法存在污染人體和環(huán)境、影響因素多、靈敏度不高、反應(yīng)時間太長、操作過程中難以規(guī)范化等缺點[2-5]，化學(xué)發(fā)光免疫分析法（LCIA）的應(yīng)用成為一種新型的定量分析技術(shù)。其多采用酶促化學(xué)發(fā)光或吖啶酯標(biāo)記的直接化學(xué)發(fā)光法及三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光等方法，但這些方法也存在試劑穩(wěn)定性差、發(fā)光過程過短等問題。因此，針對上述現(xiàn)有檢測方法中技術(shù)面的局限性和不足之處，本研究致力于建立一種新型的磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法。

甲狀腺是人體非常重要的器官，其分泌的激素可以調(diào)節(jié)人體新陳代謝，也為人體生長提供蛋白質(zhì)。甲狀腺一旦功能紊亂，分泌的激素失衡，會對人體產(chǎn)生非常大的影響，如免疫力下降，病菌入侵人體，導(dǎo)致各種疾病發(fā)生[6]。因此，本研究以血清促甲狀腺激素（TSH）為例，介紹新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法對激素等其他微量活性物質(zhì)定量檢測的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法建立材料的來源

異魯米諾衍生物購自Sigma 公司，羊抗FITC 多克隆抗體購自Thermo Scientific 公司，免疫納米磁性微珠購自深圳市尊業(yè)納米材料有限公司，NaOH 和H2O2購自蘇州亞科科技股份有限公司。TSH 檢測試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和定標(biāo)液均購自圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司。

1.1.2 臨床標(biāo)本驗證

1.1.2.1 標(biāo)本來源 選取2019年8月～2020年8月威海市立醫(yī)院初診的104例甲狀腺功能亢進(jìn)癥患者血清作為甲亢組，121例甲狀腺功能減退患者血清作為甲減組，以同期來體檢的134例健康成年人血清作為正常對照組。甲亢組中，男59例，女45例；年齡18～65歲，平均（41.34±9.76）歲。甲減組中，男68例，女53例；年齡18～69歲，平均（45.05±11.72）歲。對照組中，男73例，女61例；年齡18～66歲，平均（40.37±9.69）歲。分別收集各組患者無抗凝劑采血管（紅管）中臨床血清標(biāo)本，于-20℃冰箱保存，復(fù)溶后2～8℃冰箱保存，24 h內(nèi)完成實驗。

1.1.2.2 儀器 ADVIA Centaur XP 全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（西門子），全自動化學(xué)發(fā)光測定儀Snibe 4000 Plus（深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 異魯米諾衍生物標(biāo)記的單克隆抗體的制備

取3.2 mmol N-（6-氨基已集）-N-乙基異魯米諾（AHEI）和3.5 mmol 二氯硫化碳（CSCl2）分別溶解于0.2 mL 二次水和0.3 mL 二甲基甲酰胺（DMF）中，再將二者混勻，室溫條件下反應(yīng)2 h。采用pH 9.5 碳酸鹽緩沖液將10 mg 抗TSH-α 單克隆抗體調(diào)體積到1 mL，再加入上述活化的AHEI 溶液，混合均勻后，室溫條件下反應(yīng)20 h，將溶液過G-25 凝膠柱純化。

1.2.2 FITC 標(biāo)記TSH 單克隆抗體的制備

采用pH 9.5 的碳酸緩沖液將10 mg 抗TSH-β單克隆抗體調(diào)體積到1 mL，再向溶液中加入100 μg FITC，混合均勻，置于室溫反應(yīng)20 h，將溶液過G-25凝膠柱純化。

1.2.3 羊抗FITC 多克隆抗體包被的免疫納米磁性微珠的制備

納米磁性微珠的表面含有0.3 eq/g 的羧基基團(tuán)（-COOH）；取10 mL 濃度為30 mg/mL 的磁珠，用磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH 7.4 0.01 M）清洗2 遍，最后再用10 mL 的PBS（pH 7.4 0.01 M）溶液重懸，向懸液中加10～100 μL 的50%戊二醛溶液，使戊二醛終濃度為0.01%～0.5%，再加入100～1000 μg 純化的羊抗FITC IgG 抗體，37℃條件下反應(yīng)2 h，在磁鐵上去上清，用含0.01%～1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS（pH 7.4 0.01 M）清洗3 遍，最后懸浮在該P(yáng)BS 溶液中，并加入0.01%～0.5%的NaN3。

1.2.4 新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光試劑制備及應(yīng)用結(jié)果分析

取TSH 標(biāo)準(zhǔn)品和血清標(biāo)本各20 μL，并向其中加入發(fā)光標(biāo)志物單克隆抗體的AHEI 和FITC 單克隆抗體各40 μL，混勻，于37℃條件下水浴15 min；待抗原抗體反應(yīng)后加入40 μL 羊抗FITC 多克隆抗體包被的免疫納米磁珠分離試劑，混勻，水浴5 min，通過外加磁場作用，于分離器上分離4 min，棄上清；再加400 μL洗液，混勻，分離4 min，棄上清；重復(fù)上述步驟再次清洗分離后，將試管直接放入分析儀的測量室，自動泵將激發(fā)底物NaOH 和H2O2泵入后發(fā)生直接發(fā)光反應(yīng)，同時采用光電倍增管計量光子數(shù)量，分析儀自動分析并給出結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

檢測靈敏度：采用新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法測定20個TSH 質(zhì)量濃度為0%的標(biāo)準(zhǔn)品，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，代入擬合方程再計算相應(yīng)質(zhì)量濃度。

精密度：以變異系數(shù)（CV）表示，分別檢測并計算高、中、低TSH 標(biāo)準(zhǔn)液批間CV（n=20）和批內(nèi)CV（n=20），批內(nèi)CV 與批間CV 應(yīng)分別控制在5%、10%以內(nèi)。

稀釋回收率：將三份不同濃度的TSH 標(biāo)準(zhǔn)液用零標(biāo)準(zhǔn)液分別進(jìn)行2、4、8倍稀釋，測其稀釋回收率。

1.4 臨床符合性評價

將標(biāo)本從-20℃冰箱取出，恢復(fù)至室溫，檢測之前置振蕩器混勻。分別用新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法和ADVIA Centaur 的直接化學(xué)發(fā)光法對收集的共359份血清進(jìn)行檢測，根據(jù)新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法和ADVIA Centaur 的直接化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果建立相關(guān)方程Y=aX+b，并計算相關(guān)系數(shù)（R）。R值愈接近于1，表明線性關(guān)系愈好。

臨床符合率：以TSH 參考范圍為標(biāo)準(zhǔn)，采用新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光檢測甲亢組、甲減組及對照組的血清標(biāo)本，分析結(jié)果符合性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Excel 和SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析。精密度分析采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）、CV 表示，稀釋回收率以測定結(jié)果與期望值的比值來表示，與ADVIA Centaur XP 檢測結(jié)果的相關(guān)性分析，采用R 表示。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法的建立

優(yōu)化建立了發(fā)光標(biāo)志物不易水解的新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法，該方法中抗體的載體及抗原-抗體免疫復(fù)合物的分離試劑均應(yīng)用了新型納米免疫磁珠，極大地縮短了免疫反應(yīng)時間。本研究應(yīng)用該法以臨床檢測指標(biāo)TSH 為例進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示出較高的精密度與臨床相符性，具體檢測過程見下文。

2.2 新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法檢測指標(biāo)的確定

2.2.1 檢測靈敏度

用零濃度校準(zhǔn)品重復(fù)測定20次，計算出檢測靈敏度為0.01 μIU/mL。

2.2.2 精密度

2.2.2.1 批內(nèi)精密度 分別采用低、中、高3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)液評估新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法的批內(nèi)精密度，一次運(yùn)行重復(fù)檢測20次，批內(nèi)CV≤5%。

表1 批內(nèi)CV

2.2.2.2 批間精密度 取3個批號的TSH 直接化學(xué)發(fā)光檢測試劑分別檢測低、中、高3個不同濃度的TSH標(biāo)準(zhǔn)液，各重復(fù)20次，測定并計算60次測量結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差及CV，批間CV≤5%。2.2.3 稀釋回收率

表2 批間CV

將3份不同TSH 濃度（168.42、235.67、452.46μIU/mL）的血清樣本用零標(biāo)準(zhǔn)液分別進(jìn)行2、4、8倍稀釋，平均稀釋回收率＞80%。

表3 稀釋回收率

2.3 臨床標(biāo)本的檢測

2.3.1 與ADVIA Centaur XP 檢測結(jié)果的相關(guān)性分析

用本研究建立的新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法對359份臨床血清樣本進(jìn)行TSH 的定量測定，測定結(jié)果與ADVIA Centaur 的直接化學(xué)發(fā)光法測定結(jié)果進(jìn)行對比分析，相關(guān)方程Y=0.9466X+0.7914（R=0.9874，P＜0.001），結(jié)果如圖1。

圖1 新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法與ADVIA Centaur 直接化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果的相關(guān)性分析

2.3.2 與臨床標(biāo)本的符合率分析

以TSH 參考范圍0.40～4.50 μIU/mL 為標(biāo)準(zhǔn)，新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光法檢測甲減組患者121例，TSH值結(jié)果均較參考范圍高；檢測104例甲亢患者，TSH值結(jié)果均較參考范圍低，符合臨床診斷；而正常對照組TSH處于正常參考值范圍內(nèi)（表4）。提示用建立的新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法檢測TSH 所得出的結(jié)果有很好的臨床相符性。

表4 359例研究對象TSH 檢測結(jié)果分析（±s）

表4 359例研究對象TSH 檢測結(jié)果分析（±s）

組別例數(shù) TSH（μIU/mL）甲減組甲亢組正常對照組121 104 134 29.26±18.59 0.06±0.16 2.03±1.25

3 討論

近年來，化學(xué)發(fā)光方法不斷改進(jìn)，使用范圍逐漸廣泛[7-8]。磁分離直接化學(xué)發(fā)光免疫試驗是在酶免疫分析試驗、放射免疫實驗以及熒光免疫試驗等一系列免疫試驗之后經(jīng)過改進(jìn)發(fā)展起來的一種新型標(biāo)記免疫技術(shù)[9]。其彌補(bǔ)了傳統(tǒng)免疫檢測方法中的技術(shù)不足，具有無污染、無放射性、高特異性、高準(zhǔn)確度、高靈敏度的優(yōu)點，是在定量檢測腫瘤標(biāo)志物方面極好的選擇[10-11]。此外，磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法在篩查傳染病病原體、治療性藥物濃度監(jiān)測、胎兒產(chǎn)前診斷等方面也有著廣泛的作用[12-14]。

本研究成功建立了一種新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法，克服了許多傳統(tǒng)的免疫檢驗技術(shù)的缺陷，其靈敏度、精密度及臨床符合性均可達(dá)臨床應(yīng)用要求。該技術(shù)最大的特點是采用了異魯米諾衍生物作標(biāo)志物、納米免疫磁性微珠作為分離材料。磁性微珠由于顆粒較小，可以較為均一地分散在溶液中，在這樣一個近似液相的環(huán)境洪，結(jié)合位點較多，其表面反應(yīng)位點可以充分暴露，從而顯著減小抗原與抗體反應(yīng)的空間位阻，有利于特異性結(jié)合，使反應(yīng)更加徹底，從而極大提高分析方法的選擇性[15-16]。異魯米諾衍生物做為一種發(fā)光標(biāo)志物，被標(biāo)記到抗原或抗體上時，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，未結(jié)合的標(biāo)志物降解產(chǎn)物易于清除，結(jié)合后不影響標(biāo)志物與蛋白質(zhì)原有的免疫性，結(jié)合物性質(zhì)穩(wěn)定、易于保存，因此其發(fā)光效率顯著增加。磁顆粒分離方式是固相分離方式的一種。納米免疫磁性微珠可以增大包被面積，縮短免疫反應(yīng)檢測時間，提高檢測效率[17-18]。

甲狀腺功能異常的發(fā)病率逐年上漲，對甲狀腺疾病的關(guān)注程度日漸增高，甲狀腺相關(guān)激素在人體的生長、發(fā)育、繁殖等生理活動中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[19]。甲狀腺功能與成年人的認(rèn)知功能也有密切相關(guān)性，乳腺癌診斷與絕經(jīng)后甲狀腺疾病存在重要關(guān)系，因此對甲狀腺激素檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和可比性提出了更高的要求。本研究以TSH 的檢測為例進(jìn)行了該技術(shù)應(yīng)用的性能評價。結(jié)果顯示，本研究建立的新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法具有很高的檢測靈敏度及精密度，對于低濃度樣本仍然具有良好的分辨率且結(jié)果可靠，這對于人體超微量TSH 的檢測非常關(guān)鍵，劉進(jìn)等[20]的研究與該結(jié)果具有一致性。ADVIA Centaur XP是臨床常規(guī)應(yīng)用的儀器，其檢測結(jié)果基本符合臨床，而本實驗中應(yīng)用新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法與ADVIA Centaur XP 同時檢測臨床血清標(biāo)本，兩者結(jié)果具有高度相關(guān)性，表明本研究建立的新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法可以用來精準(zhǔn)地定量檢測TSH 水平，且檢測效果完全達(dá)到臨床診斷甲狀腺疾病的標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，本研究建立的一種新型磁分離直接化學(xué)發(fā)光方法其靈敏度、精密度及臨床符合率均符合臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)，該方法的建立對TSH 等其他激素的檢測具有一定應(yīng)用價值。相信隨著對甲狀腺激素標(biāo)準(zhǔn)化需求呼聲的提高，更高準(zhǔn)確度和靈敏度的方法會越來越多地被用于臨床疾病診斷中。