梁明星,馬夢琪,程盈盈,王媛,陳華波

湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院, 湖北 襄陽 441053

基因定點(diǎn)突變是常用的分子生物學(xué)研究方法。通過突變基因特定位點(diǎn)的堿基序列，改變其編碼蛋白質(zhì)對應(yīng)的氨基酸序列，從而影響目標(biāo)蛋白質(zhì)的酶活性[1]、受修飾位點(diǎn)或與其他蛋白質(zhì)的結(jié)合能力[2]，藉此研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、上下游調(diào)控關(guān)系、亞細(xì)胞定位等特征。

基因定點(diǎn)突變的方法主要有重疊延伸PCR(overlap extension PCR, OE-PCR)[3-4]、滾環(huán)擴(kuò)增法[5-6]、大引物PCR法[7-8]等，每種方法各有優(yōu)劣。其中，OE-PCR法雖步驟繁瑣，但適當(dāng)改進(jìn)后可解決基因定點(diǎn)突變中的諸多難題。如采用平行模板可有效減少原始質(zhì)粒對突變產(chǎn)物的干擾[9]；采用多片段重疊延伸可一次性制作基因多位點(diǎn)突變[10]。因此，OE-PCR定點(diǎn)突變法仍然受到大量科研工作者的青睞。而OE-PCR法也有一定缺陷。其一，OE-PCR第二輪擴(kuò)增成功與否受上、下游片段長度和使用比例、重疊區(qū)域長度及序列特征等諸多因素影響。一般隨著上、下游片段長度增加，擴(kuò)增成功率逐漸降低[11]。經(jīng)常遇到第二輪PCR無法擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，卻難以找到關(guān)鍵制約因素，只能反復(fù)調(diào)整反應(yīng)條件的情況。其二，與其他基因定點(diǎn)突變方法一樣，基于體外擴(kuò)增DNA的定點(diǎn)突變都存在隨機(jī)突變風(fēng)險(xiǎn)，且隨目標(biāo)基因長度增加而增加。因此，縮短OE-PCR過程中待擴(kuò)增DNA長度，可有效提高基因定點(diǎn)突變效率。

周期蛋白E(cyclin E)是周期蛋白家族的重要成員，通過激活周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinase 2, CDK2)在G1/S轉(zhuǎn)換中發(fā)揮作用[12]。cyclinE有2個(gè)重要截短基因(truncated gene 1 and 2, T1 and T2)，稱為低分子量cyclin E(low molecular weight cyclin E, LMW cyclin E)[13-14]。研究顯示，LWM cyclin E在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，激活CDK2能力更強(qiáng)，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)血管生成等方面發(fā)揮著一定的作用[14-16]。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中已克隆了cyclinE基因及其2個(gè)截短基因T1、T2，并通過EcoR Ⅰ/SalⅠ雙酶切插入pEGFP_C2載體(未發(fā)表數(shù)據(jù))。為了降低克隆cyclinE及其截短基因的激酶活性缺失(kinase-deficient, KD)突變體[17]過程中重復(fù)擴(kuò)增帶來的隨機(jī)突變風(fēng)險(xiǎn)，本研究利用OE-PCR擴(kuò)增C2-cyclinE、C2-cyclinE_T1和C2-cyclinE_T2這3個(gè)原始質(zhì)粒中含突變位點(diǎn)的一小段共有序列，再采用雙片段連接法置換原始質(zhì)粒中的對應(yīng)序列以構(gòu)建完整突變基因，以期對常規(guī)OE-PCR作適當(dāng)改進(jìn)，提供一種克隆系列基因定點(diǎn)突變的優(yōu)化方案。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

DH5α感受態(tài)大腸桿菌(18263012)購自美國Thermo Fisher公司；pEGFP_C2質(zhì)粒(6083-1)購自美國Clontech公司；C2-cyclinE、C2-cyclinE_T1和C2-cyclinE_T2質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2 試劑

2×EasyTaqPCR SuperMix (AS111-11)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Pyrobest DNA Polymerase (R005A)、DNA Ligation Kit Ver.2.1 (6002)購自日本TaKaRa公司；內(nèi)切酶EcoRⅠ(R0101V)、AgeⅠ(R0552V)、SalⅠ(R0138V)購自美國NEB公司；DNA回收試劑盒(BSC02M1/BSC03M1)、質(zhì)粒小量抽提試劑盒(BSC01M1)購自杭州博日科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

通用引物pEGFP-C5′/3′參考Invitrogen中國測序通用引物序列，其他引物采用Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)，由北京天潤奧科生物科技有限公司合成，經(jīng)PAGE純化。引物序列見表1。

1.4 cyclin E及其截短基因的激酶活性缺失突變體的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中已經(jīng)克隆了cyclinE基因及其2個(gè)截短基因T1、T2，并通過EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切插入pEGFP_C2載體。若構(gòu)建此系列基因的激酶活性缺失突變體，需將cyclinE基因編碼區(qū)562～576位(或T1、T2對應(yīng)序列)“TTACAGCTTATTGGG”突變?yōu)椤癎CAGCGGC-AGCAGCA”[18]。限制性酶切分析發(fā)現(xiàn)cyclinE基因序列中含有1個(gè)AgeⅠ位點(diǎn)將其分為F1、F2兩段，目標(biāo)突變位點(diǎn)KD位于F2段。對于cyclinE及其截短基因，F(xiàn)2段是完全一致的(圖1)。故可以僅對F2段作定點(diǎn)突變，再將其置換原始質(zhì)粒的相應(yīng)序列，即可得到3個(gè)系列突變體。

表1 本研究所用引物Table 1 Primer used in this study

注：右向箭頭表示正向引物，左向箭頭表示反向引物，各箭頭所在位置指示引物在質(zhì)粒上的匹配位點(diǎn)。圖1 pEGFP_C2-cyclin E/T1/T2質(zhì)粒圖譜及引物匹配位點(diǎn)Fig.1 Plasmid maps of pEGFP_C2-cyclin E/T1/T2 and primer matching sites

1.4.1利用OE-PCR擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的F2片段

首先，第一輪PCR以pEGFP_C2-cyclinE原始質(zhì)粒為模板，相應(yīng)的以E_S、T1_S、T2_S為上游引物搭配KD_A為下游引物擴(kuò)增系列基因上游片段，以KD_S/pEGFP_C3′為上、下游引物擴(kuò)增基因下游片段。PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 3 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各0.3 μL，Pyrobest DNA Polymerase 0.3 μL，質(zhì)粒DNA 0.1 μL，補(bǔ)水至30 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。第一輪PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后回收至20 μL ddH2O中。

然后，第二輪PCR分別以E/T1/T2組的上、下游片段回收物為模板，相應(yīng)的以E_S、T1_S、T2_S為上游引物搭配pEGFP-C3′為下游引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 5 μL，dNTP 7 μL，上、下游引物各0.5 μL，Pyrobest DNA Polymerase 0.5 μL，上、下游片段回收物各2.5 μL，補(bǔ)水至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后回收至20 μL ddH2O中。

1.4.2利用雙片段同時(shí)連接法構(gòu)建突變體重組質(zhì)粒 除F2片段上有AgeⅠ位點(diǎn)外，pEGFP_C2-cyclinE/T1/T2質(zhì)粒上游還有另1個(gè)AgeⅠ位點(diǎn)。為避免雙AgeⅠ位點(diǎn)對常規(guī)酶切-連接的限制，采用雙片段同時(shí)連接法，即以EcoRⅠ/AgeⅠ雙酶切原始質(zhì)粒獲得F1片段，以AgeⅠ/SalⅠ雙酶切OE-PCR產(chǎn)物T2獲得F2片段，兩片段一起連接EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切的質(zhì)粒載體，從而得到完整突變體質(zhì)粒。具體操作為：取OE-PCR終產(chǎn)物17 μL，pEGFP_C2-cyclinE/T1/T2質(zhì)粒2 μg或pEGFP_C2質(zhì)粒1 μg稀釋到17 μL ddH2O中，分別加2 μL 10×buffer、相應(yīng)的2種酶各0.5 μL，37 ℃孵育4 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后回收目標(biāo)片段至20 μL ddH2O中。

采用DNA Ligation Kit Ver.2.1連接片段與載體，具體操作為：取載體0.5 μL，兩片段各3.5 μL，solutionⅠ7.5 μL；16 ℃孵育30 min。連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，涂布于卡那霉素-LB固體培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。CyclinE截短基因系列突變體克隆過程見圖2。

1.5 目標(biāo)克隆的篩選與序列測定

從過夜平板上隨機(jī)挑取數(shù)個(gè)菌落，置于5 mL卡那霉素-LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)8 h。采用2×EasyTaqPCR SuperMix，直接以菌液為模板、以匹配pEGFP_C2載體多克隆位點(diǎn)上游的pEGFP-C5′引物與KD_A引物組合進(jìn)行PCR檢測。反應(yīng)體系為：2×SuperMix 5 μL，上、下游引物各0.1 μL，菌液0.8 μL，補(bǔ)水至10 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共25個(gè)循環(huán)。為驗(yàn)證PCR檢測結(jié)果，對部分克隆取2.5 mL菌液小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測。具體操作為：2 μL 10×buffer，0.5 μLAgeⅠ，7.5 μL質(zhì)粒DNA，補(bǔ)水至20 μL，37 ℃孵育4 h。再利用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物。為確認(rèn)突變體序列，取部分陽性質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，質(zhì)粒測序由北京天潤奧科生物科技有限公司完成，利用DNAMAN 4.0軟件進(jìn)行序列比對分析。

圖2 Cyclin E截短基因系列突變體克隆過程示意圖Fig.2 Schematic diagram of cloning cyclin E truncated gene mutants

2 結(jié)果與分析

2.1 含突變位點(diǎn)基因片段的擴(kuò)增

通過OE-PCR擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的F2片段，先以pEGFP_C2-cyclinE原始質(zhì)粒為模板，以ddH2O為負(fù)對照，分別以E_S、T1_S、T2_S搭配KD_A為引物擴(kuò)增系列基因上游片段，以KD_S/pEGFP_C3′為引物擴(kuò)增基因下游片段，得到4個(gè)預(yù)期的目標(biāo)產(chǎn)物(圖3A)。在第二輪PCR時(shí)，E/T1/T2組上游引物分別為E_S、T1_S與T2_S，下游引物皆為pEGFP-C3′；模板分別為第一輪PCR產(chǎn)物1&4、2&4與3&4，以pEGFP_C2-cyclinE質(zhì)粒作正對照。發(fā)現(xiàn)上游片段1或2與下游片段4組合未能擴(kuò)增出完整基因，只有上游片段3與下游片段4組合擴(kuò)增出完整cyclinE_T2(圖3B)。以上結(jié)果與OE-PCR擴(kuò)增長基因成功率較低的經(jīng)驗(yàn)相符。

A：第一輪PCR電泳結(jié)果；“-”—以ddH2O為負(fù)對照，1～3—上游引物分別為E_S、T1_S與T2_S，下游引物為KD_A的PCR產(chǎn)物；4—引物為KD_S/pEGFP-C3′的PCR產(chǎn)物；M—DNA marker。B：第二輪PCR結(jié)果；“+”—以pEGFP_C2-cyclin E質(zhì)粒為正對照；E/T1/T2—上游引物分別為E_S、T1_S與T2_S，下游引物皆為pEGFP-C3′，模板分別為第一輪PCR產(chǎn)物1&4、2&4與3&4的PCR產(chǎn)物；M—DNA Marker。圖3 擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的基因片段Fig.3 Amplification of gene fragments with mutation site

2.2 載體及基因片段的酶切

理論上，將上述OE-PCR產(chǎn)物T2以AgeⅠ/SalⅠ雙酶切即可得到F2片段，再通過酶切-連接置換原質(zhì)粒的對應(yīng)序列即可得到相應(yīng)突變體。然而，質(zhì)粒上游還有另1個(gè)AgeⅠ位點(diǎn)(圖2)，因此F2片段無法簡單置換質(zhì)粒中的對應(yīng)序列。雙片段連接法可突破雙AgeⅠ位點(diǎn)對常規(guī)酶切-連接的限制。即以EcoRⅠ/AgeⅠ雙酶切原始質(zhì)粒獲得F1片段，以AgeⅠ/SalⅠ雙酶切OE-PCR產(chǎn)物T2獲得F2片段，兩片段一起連接EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切的質(zhì)粒載體，從而得到完整突變體質(zhì)粒。

將pEGFP_C2-cyclin E/T1/T2質(zhì)粒以EcoR Ⅰ/AgeⅠ雙酶切得到3個(gè)片段：4 672、763 bp以及1個(gè)分別為526/409/334 bp，其中最小的片段即所需的F1，它與763 bp片段有一定距離，容易分離回收。OE-PCR產(chǎn)物T2以AgeⅠ/SalⅠ雙酶切得到3個(gè)片段：710、339及60 bp，其中60 bp片段較小不易顯現(xiàn)，710 bp片段即為F2。pEGFP_C2質(zhì)粒雙酶切簡單易行(圖4)。

2.3 目標(biāo)克隆的篩選與檢測

雙片段連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌后經(jīng)卡那霉素選擇平板篩選，發(fā)現(xiàn)3個(gè)平板上皆形成一定數(shù)量菌落(圖5A～C)，但少于本實(shí)驗(yàn)室單片段連接經(jīng)驗(yàn)值[19]，提示雙片段連接效率略低。分別從3個(gè)平板上挑取數(shù)個(gè)菌落，先進(jìn)行PCR檢測。選用匹配pEGFP_C2載體多克隆位點(diǎn)上游的pEGFP-C5′引物與KD_A引物組合，陽性結(jié)果表示該克隆含pEGFP_C2質(zhì)粒載體，且含有目標(biāo)基因序列；由于系列基因在5′端的差異，3種目標(biāo)克隆的預(yù)期產(chǎn)物大小略有不同，可相互佐證。檢測結(jié)果顯示#12、#13、#17、#23、#31及#32為陽性克隆(圖5D～F)。目標(biāo)質(zhì)粒上含有2個(gè)AgeⅠ位點(diǎn)，可用酶切驗(yàn)證PCR結(jié)果。從每組克隆中各選3個(gè)進(jìn)行單酶切檢測，其結(jié)果與PCR檢測結(jié)果一致(圖5G)。

注：M—DNA Marker；1～3—pEGFP_C2-cyclin E/T1/T2質(zhì)粒雙酶切結(jié)果；4—OE-PCR產(chǎn)物T2雙酶切結(jié)果；5—pEGFP_C2質(zhì)粒雙酶切結(jié)果；箭頭指示需回收的DNA片段。圖4 載體與cyclin E系列截短基因片段的酶切Fig.4 Restriction enzyme digestion of DNA fragments and vectors

A-C：目標(biāo)突變體(cyclin E/T1/T2)KD對應(yīng)過夜平板；D-F：A-C平板菌落的PCR檢測結(jié)果；G：部分克隆小量提取質(zhì)粒酶切檢測結(jié)果；H：3個(gè)陽性質(zhì)粒的序列比對結(jié)果；11～38—菌落編號；M—DNA Marker。圖5 目標(biāo)克隆的篩選與檢測Fig.5 Screening and detection of target clones

為進(jìn)一步確認(rèn)目標(biāo)克隆，對經(jīng)酶切檢測驗(yàn)證的5個(gè)陽性質(zhì)粒作序列測定。序列比對結(jié)果顯示其中#12、#23、#31質(zhì)粒序列完全準(zhǔn)確(圖5H)。說明成功克隆了cyclinE基因及其2個(gè)截短基因T1/T2的激酶活性缺失突變體。

3 討論

許多基因存在截短型表達(dá)模式[20-22]，針對系列截短基因的定點(diǎn)突變，逐一克隆則避免不了反復(fù)擴(kuò)增而增加隨機(jī)突變風(fēng)險(xiǎn)。采用共有序列替換思路，僅對包含目標(biāo)位點(diǎn)在內(nèi)的一段共有DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)突變，再置換各自對應(yīng)序列構(gòu)建完整質(zhì)粒，一則可以提高OE-PCR成功率，二則可以降低隨機(jī)突變的風(fēng)險(xiǎn)。

除了OE-PCR法，目前市場上突變試劑盒更多以滾環(huán)擴(kuò)增法為基本原理[23-25]。滾環(huán)擴(kuò)增法需對質(zhì)粒全長進(jìn)行擴(kuò)增，因此只能對系列基因逐一突變。此外，滾環(huán)擴(kuò)增法強(qiáng)烈依賴DpnⅠ酶對原始模板質(zhì)粒的徹底消化。隨著試劑盒使用和存儲時(shí)間增加，不可避免的酶活性降低會導(dǎo)致大量的“假陽性”克隆。這些“假陽性”克隆無法通過PCR或酶切檢測區(qū)分，只能依賴于全基因測序加以鑒定。

含目標(biāo)突變序列的共有片段既可來自于OE-PCR，也可取自系列基因中某一已經(jīng)鑒定的突變體。如果得到了cyclinEKD突變體，再克隆LMW-cyclinEKD突變體時(shí)則無需重新OE-PCR擴(kuò)增，只需將共有序列F2以AgeⅠ/SalⅠ酶切分離出來即可(圖1)。此時(shí)F2片段來自于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA復(fù)制，序列忠實(shí)度較高，目標(biāo)突變體一般無需序列測定。雙片段連接法還可拓寬常規(guī)酶切-連接構(gòu)建重組質(zhì)粒的使用范圍，對于序列長度大、干擾酶切位點(diǎn)較多的基因克隆有所幫助，如某些長基因、融合基因的克隆等[11]。盡管如此，相對常規(guī)單片段連接法，雙片段連接時(shí)得到的轉(zhuǎn)化克隆數(shù)較少，且陽性率略低；調(diào)整連接體系中兩片段及載體的比例可適當(dāng)增加轉(zhuǎn)化克隆數(shù)。檢測時(shí)可適當(dāng)增加挑選的待檢克隆數(shù)，以盡量保證篩選到陽性克隆。

序列替換法克隆系列基因突變體依賴于合適的酶切位點(diǎn)。最理想的情況是目標(biāo)位點(diǎn)兩側(cè)附近各有一個(gè)單一常見酶切位點(diǎn)，此時(shí)按常規(guī)雙酶切-連接即可重構(gòu)完整質(zhì)粒。然而也可能遇到另外一種情況，即目標(biāo)位點(diǎn)兩側(cè)雖有常見酶切位點(diǎn)，但它們在質(zhì)粒上并不單一。如本例中目標(biāo)位點(diǎn)上游附近雖有1個(gè)AgeⅠ位點(diǎn)，但載體序列本身還有另一AgeⅠ位點(diǎn)。此時(shí)雙片段連接法可避開雙AgeⅠ位點(diǎn)對質(zhì)粒重構(gòu)的限制。如果目標(biāo)位點(diǎn)兩側(cè)找不到合適酶切位點(diǎn)，則只能按常規(guī)逐一克隆。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，我們認(rèn)為可供選擇的Ⅱ型限制性內(nèi)切酶眾多，針對具體基因可結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件靈活選擇實(shí)驗(yàn)方案。

綜上所述，本研究提出了一種克隆系列截短基因突變體的優(yōu)化方案，即通過部分?jǐn)U增減少隨機(jī)突變，輔以雙片段連接法進(jìn)行靈活的基因重組，極大地提高了基因定點(diǎn)突變效率，可作為其他系列相關(guān)基因定點(diǎn)突變的優(yōu)化方案。