劉超倫， 劉柱

海南大學生命科學學院，?？?71158

細菌中通常不存在真核生物類似的mRNA保護機制[1]，形成不具有終止密碼子的mRNA（non-stop mRNA），無法保證mRNA 轉錄的精確與完整。不終止mRNA 產生的方式多種多樣，包括過早的轉錄終止、核酸酶的切割以及物理損傷等。此外，終止密碼子的通讀[2]、藥物誘導的移碼和密碼子錯配[3]，以及mRNA 轉換過程中RNase 的雜散活性[4]，也會導致不終止mRNA 的產生。當核糖體遭遇連續(xù)的稀有密碼子[5]、弱的終止密碼子[6]，或者產生問題多肽時[7]，翻譯會在中途發(fā)生停滯，此時RNaseⅡ或多核苷酸磷酸化酶會沿著3'→5'的方向降解mRNA，并在核糖體A位點進行切割[8]，核糖體到達不終止mRNA 的3'端時，mRNA 終止于核糖體的P 位點而A 位點處于空載，翻譯不能繼續(xù)延伸或進入終止階段，導致核糖體滯留在mRNA 上，形成不終止核糖體復合物（non-stop ribosome complexes）。在大腸桿菌中，不終止核糖體復合物的產生頻率占新合成肽鏈的2%～4%[9]。該復合物空耗細胞中的核糖體和tRNA，同時產生截短的、具有細胞毒性的異常多肽，嚴重損害核糖體的循環(huán)、蛋白質合成以及細胞的進一步生長和活力[10-11]。

為了回收滯留的核糖體，降解不終止mRNA及其編碼的異常蛋白質產物，細菌進化出多種核糖體拯救機制，包括tmRNA 與SmpB 介導反式翻譯，ArfA 與ArfB 介導的拯救機制（alternative ribosome rescue factors，Arfs），以及核糖體質量控制（bacterial ribosome quality control，RQC）與肽基tRNA 脫落（peptidyl-tRNA drop-off）等[12-13]。其中，反式翻譯是拯救不終止核糖體復合物最普遍、最有效的途徑。與其他核糖體拯救機制相比，反式翻譯的優(yōu)勢在于能夠降解異常的多肽與mRNA[14]。在一些生物中，反式翻譯系統(tǒng)是必不可少的[15-17]。反式翻譯由tmRNA（又稱ssrA）及其蛋白伴侶SmpB 組成，在細菌中普遍存在，甚至在一些細胞器中也有發(fā)現[14,18]。tmRNA 自1979 年在大腸桿菌中被發(fā)現，其結構與功能已逐漸被闡釋清楚。tmRNA 既有tRNA 樣結構域（tRNA-like domain，TLD），又有mRNA 樣結構域（mRNA-like domain,MLD），氨?；痶mRNA 與SmpB 結合后，在延伸因子EF-Tu 的輔助下與滯留核糖體中空的A 位點結合，恢復翻譯并給新生肽添加降解標簽，最終回收滯留的核糖體，并降解不終止mRNA 及其編碼的異常蛋白[19-20]。

1 tmRNA-SmpB 介導反式翻譯系統(tǒng)的結構基礎

1.1 tmRNA的結構

在大腸桿菌中，成熟的363 nt tmRNA 是由457 nt ssrA RNA 前體加工而來。tmRNA 主體為4個假節(jié)（pseudoknot）與MLD 組成的巨大環(huán)狀結構，TLD 通過螺旋H2 結構域與假節(jié)相連。成熟tmRNA 的3'末端與5'末端會形成一個受體臂，具有tRNA 中高度保守的CCA 序列，但只能被丙氨酸氨?；痆19]。受體臂附近還存在類似tRNA 的T臂（T stem-loop）與缺乏莖的D 環(huán)(D-loop)，tmRNA與SmpB 的結合和功能發(fā)揮需要這兩個環(huán)之間的特定相互作用[21]。此外，T 臂轉錄后修飾會使得上述相互作用得到增強[22]。

MLD 中包含了一個短的開放閱讀框，其終止密碼子位于保守的H5 螺旋中。該閱讀框可以編碼一個被ClpXP 識別的降解標簽，通常為10 個殘基[23]。與mRNA 相比，MLD 的閱讀框沒有起始密碼子[24]。在大腸桿菌中標簽肽的序列為“AANDENYALAA”，而在維氏氣單胞菌中則為“ANDENYALAA”，標簽肽末端的 Ala-Ala-coo-是ClpXP 降解的最重要位點[25]。

經典 tmRNA 分子包含 4 個假節(jié)，PK1 位于MLD 上游，PK2～PK4 位于下游。在大腸桿菌中，tmRNA 對反式翻譯底物添加標簽主要受PK1 的影響，其他假節(jié)的替換對于tmNRA 的功能影響不大[26]。而當PK1 被小而穩(wěn)定的RNA 發(fā)夾替代時，tmRNA 仍然能夠給底物添加標簽，這說明PK1 并不直接參與tmRNA 與核糖體的互作，而是穩(wěn)定了TLD 和 MLD 之間 的構象 ，防止 tmRNA 錯 誤折疊[27]。在一些細菌中，存在由兩條RNA 鏈組成的tmRNA（two-piece tmRNAs），其假節(jié)數量較少但翻譯效率并沒有降低，這說明PK2、PK3 和PK4 的主要作用是tmRNA 的折疊和成熟，而不是參與反式翻譯[28-29]。

1.2 SmpB的結構

SmpB 是反式翻譯必不可少的RNA 伴侶蛋白，在所有細菌中高度保守。SmpB蛋白具有一個寡核苷酸結合折疊結構（oligonucleotide-binding fold），核心由一個封閉的桶狀結構組成[30]。該桶中有 8 條反向平行的 β 鏈，周圍環(huán)繞著 3 個 α 螺旋，而第64～82 個氨基酸殘基形成了一個中心環(huán)并與鏈β4 和β5 相連。SmpB 結構與已知的與翻譯相關的RNA 結合蛋白IF1、核糖體蛋白S17 以及天冬氨酰tRNA 合成酶的N 末端結構域具有相似性[31]。 SmpB 蛋白 Arg-35、Phe-107 和 Val-31 的側鏈扮演著tRNA 中D 臂的角色，與tmRNA 的TLD 特異性結合；中心環(huán)則參與了與丙氨酸t(yī)RNA合成酶的相互作用，促進tmRNA 與丙氨酸發(fā)生氨酰化反應[32]。除了核心結構外，SmpB 蛋白還存在一個獨立的C 末端尾巴，尾巴中富集了側鏈帶正電荷的賴氨酸與精氨酸殘基。SmpB 的C 末端尾巴在溶液中無序卷曲，在核糖體中卻能形成一個α 螺旋結構；該螺旋可以通過正電荷進入核糖體30S 亞基 mRNA 通道中的 A 位點，幫助 tm-RNA-SmpB 復合物進入滯留的核糖體并支持肽基轉移[33]。

2 tmRNA-SmpB 介導的反式翻譯的分子機制

核糖體長時間的翻譯停滯會使得mRNA在核糖體的A 位點附近發(fā)生核酸內切酶內切[6]，隨后tmRNA 在丙氨酰-tRNA 合成酶的作用下裝載丙氨酸，并與EF-Tu 和SmpB 蛋白結合，進入核糖體的A 位點[34]。tmRNA·SmpB·EF-Tu·GTP 四元復合物中TLD 和SmpB 的構象類似于解碼期間的氨?；?tRNA·EF-Tu·GTP 的 A/T 狀態(tài)[35]。SmpB 通過 C末端尾巴的帶電殘基與mRNA 通道互作并將SmpB 固定在A 位點，取代了密碼子-反密碼子相互作用并結合在核糖體的解碼中心和mRNA通道上。此時tmRNA 的受體臂與正常翻譯過程中酰化的tRNA 受體臂類似，PK2 的環(huán)被夾在uS3 的螺旋-轉-螺旋基序的口袋中，與核糖體蛋白uS3 互作并將tmRNA 錨定到小亞基；H5 則堵塞mRNA通道的入口并緊靠SmpB 的尾巴，其磷酸酯主鏈與 uS3 的 Arg132 和 Arg143 發(fā)生靜電相互作用[35]。值得注意的是，當滯留核糖體復合物中P 位點下游的核苷酸數量大于9 時，過長的mRNA 會與核糖體mRNA通道入口的H5發(fā)生碰撞，反式翻譯的效果會顯著降低，這說明PK2和H5與核糖體的結合可能在滯留核糖體的識別中發(fā)揮作用[35-36]。

進入核糖體之后，tmRNA 很容易從EF-Tu 中釋放出來[20]。肽基轉移之前，tmRNA-SmpB 復合物需要發(fā)生兩個構象變化[35]：SmpB 的C 末端尾巴通過高度保守的Gly132 發(fā)生彎曲，允許SmpB 主體進入 A 位點；tmRNA 的 D 環(huán)與 16S rRNA H38 互作，TLD 的3'-CCA 末端進入肽基轉移中心（peptidyl transfer center，PTC）。轉肽后，新生肽被一個丙氨酸延長, 閱讀框從mRNA 轉換到tmRNA 的MLD 上[37]。因而轉肽過程中，MLD 必須穿過由16S rRNA H34 與 G530 組成的物理“門閂”，以加載到 mRNA 通道中[35]。此時，SmpB 的 C 末端尾巴保持α 螺旋，而高度保守的Gly132 則再次充當SmpB 蛋白主體與尾巴之間的柔性關節(jié)，促進C 末端尾巴翻轉進而與E 位點的mRNA 通道結合，騰空A位點，并將tmRNA-SmpB 錨定在P位點[35]。由于位于mNRA 通道入口的SmpB 和隸屬于tmRNA的H5 發(fā)生了移動，不再堵塞mNRA 通道的入口，MLD 得以通過 A 位點的“門閂”。MLD 加載到mRNA 通道后，還需要保證MLD 內的閱讀框能夠正確定位，確保核糖體終止于閱讀框內的終止密碼子。點突變與Cryo-EM 研究表明，MLD 編碼區(qū)第一個密碼子（恢復密碼子）的前五個核苷酸，對于MLD 與閱讀框在核糖體中的準確定位十分關鍵[35,38-39]?；謴兔艽a子上游區(qū)域能夠與SmpB 蛋白底部的疏水口袋及其C 末端尾巴互作，這些互作將恢復密碼子直接定位在核糖體30S 解碼中心[40-41]。

Ala-tRNAAla與MLD 上的恢復密碼子結合后，EF-G 將肽 基-tRNAAla轉 移到 P 位點 ，迫 使 tm-RNA-SmpB 趨向 E 位點；此時 tmRNA-SmpB 復合物不會模擬結合在E 位點的tRNA，而是通過E 位點移至核糖體的溶劑側。這是因為TLD-SmpB 復合體會與E 位點的核糖體發(fā)生碰撞，而MLD 依舊能夠通過 E 位點由 uS7、uS11 以及 16S rRNA G693組成的“門閂”，并被完全加載到mRNA 通道中[35]。隨后，翻譯將在MLD 的閱讀框上進行，并將標簽肽添加到新生的多肽鏈上，在終止密碼子進入A位點后翻譯終止并進行核糖體回收。

反式翻譯添加到新生多肽上的標簽能夠被多個蛋白酶識別，例如ClpXP、ClpAP 和Lon，它們促進了異常多肽的降解[42-43]。ClpX 采用一種獨特的機制識別tmRNA 的降解標簽，其AAA+環(huán)的軸向通道被A 亞基的pore-2 loop 所封閉，特異性地與tmRNA 標簽肽的C 末端互作[44]。與新生肽降解一致，引起核糖體滯留的不終止mRNA 也會被tm-RNA MLD 的 3'端招募的 3'→5'核酸外切酶RNase R所降解[45]。

3 tmRNA與SmpB以多種方式發(fā)揮功能

反式翻譯在所有已測序的細菌基因組中都是保守的，對于細菌的存活十分重要[17,46]。在一些病原菌中,例如金黃色葡萄球菌、李斯特菌或結核分枝桿菌，反式翻譯是細胞存活的必須條件[47-49]。而在含有多種核糖體拯救機制的細菌中，反式翻譯的失活帶來的影響千差萬別：有些菌株會產生毒力缺陷[50-53]，有些菌株的耐藥性和抗逆能力會受到影響[54-56]，還有些細菌的細胞周期會發(fā)生改變[57-59]。

反式翻譯的主要功能為翻譯質量控制。前文詳細描述了反式翻譯拯救滯留的核糖體的分子機制，反式翻譯最直接的功能是將不終止核糖體復合物中的核糖體、異常mRNA 及其編碼的異常蛋白在處理后回收，并應用于新的翻譯循環(huán)。除此之外，tmRNA 與SmpB 還能夠根據蛋白質折疊與分泌水平介導翻譯質量控制。例如，當dnaK敲除時，錯誤折疊的新生多肽會成為反式翻譯的靶標并被迅速降解[51]。而當SecYEG 介導的共翻譯轉運被氯霉素或四環(huán)素抑制導致SecYEG 被堵塞時，反式翻譯通過釋放核糖體恢復SecYEG 的分泌功能，避免SecY降解[60]。

除了翻譯質量控制外，tmRNA 與SmpB 還以反式翻譯的形式參與細菌的調控網絡。反式翻譯可以直接調控某些基因的表達，例如阻遏蛋白LacI。當LacI 的濃度過高時，LacI 會結合在自身基因的3'端從而阻斷自身的轉錄，通過產生不終止mRNA 誘導核糖體滯留，從而阻止新的LacI 合成，防止過量的蛋白積累[61]。目前，通過將tmRNA的標簽肽突變?yōu)榭贵w標簽，許多受到反式翻譯調控的特異性底物已經得到了鑒定[62-64]。另一方面，反式翻譯系統(tǒng)還會通過間接的方式參與細菌的應激反應。例如在饑餓狀態(tài)下，毒素-抗毒素系統(tǒng)的RelE 將會被激活，切割胞內的mRNA 從而大量誘導不終止翻譯復合物的產生，減少細胞能量的消耗以應對饑餓；而當營養(yǎng)恢復時，細菌利用反式翻譯系統(tǒng)拯救滯留的核糖體并恢復生長[65]。MazF 的機制也類似，通過誘導滯留核糖體的產生使得細菌在逆境中更耐受[66]。

值得注意的是，盡管tmRNA 與SmpB 對于反式翻譯來說是缺一不可的，但二者也可能以不依賴于反式翻譯的方式發(fā)揮功能。例如，在金黃色葡萄球菌中tmRNA 可以發(fā)揮sRNA 的功能，與crt-MNmRNA 的RBS 區(qū)發(fā)生堿基配對，調控金黃色葡萄球菌的色素合成[67]。而在維氏氣單胞菌中，敲除SmpB 與敲除tmRNA 在轉錄和代謝水平上的差異也間接證明二者可能具有獨立作用[68]。遺憾的是，作為RNA 伴侶蛋白的SmpB 目前還尚未被報道具有不依賴反式翻譯的功能。

4 展望

經過數十年的研究，反式翻譯模型已經基本建立，關于反式翻譯識別和回收不終止核糖體復合物的分子機制已有足夠的闡述，為反式翻譯的應用提供了扎實的理論基礎。基于對反式翻譯機制的深刻理解，開發(fā)以反式翻譯為基礎，調控細菌蛋白水平的分子生物學工具是反式翻譯應用的重要方向。在研究基因功能與細菌代謝通路的過程中，無論是通過誘導型啟動子或sRNA 等方式來控制基因的轉錄水平，還是通過核糖體開關或mRNA 降解對基因進行翻譯水平上的調控，均只能阻止基因表達合成新的蛋白，而對已經合成的蛋白無能為力。對于穩(wěn)定的蛋白質，可能需要多輪復制才能將其在胞內的數量和活性降低到足夠低的水平，而在此期間可能會大大影響基因表達調控的有效性。因此，將能夠降解特定帶標簽蛋白的反式翻譯系統(tǒng)開發(fā)成新的分子生物學工具，具有難以替代的重要意義。近年來，人們已經在細菌中應用了一些基于反式翻譯系統(tǒng)的遺傳工具。Mc Ginness 等[69]將 tmRNA 標簽的最后 3 個殘基LAA突變?yōu)镈AS并插入了4個額外的氨基酸殘基，使得ClpXP 只有在SspB 存在的情況下才能對標記底物進行徹底降解。該系統(tǒng)已經被成功應用于大腸桿菌、芽孢桿菌與分歧桿菌之中，并且進行了進一步改進以確保降解的精確與徹底[70-73]。然而，上述系統(tǒng)依賴于SspB與大腸桿菌的tmRNA標簽序列，限制了其在不同細菌中的應用。如何提高反式翻譯系統(tǒng)作為遺傳工具的使用范圍并探究其中的具體機制，將是后續(xù)研究需要解決的主要問題。

由于反式翻譯在細菌中普遍存在并且起關鍵作用，反式翻譯抑制劑有極大可能是有效的廣譜抗生素；此外，由于在動物中沒有發(fā)現反式翻譯途徑，反式翻譯抑制劑將不會對宿主帶來副作用。因而，反式翻譯日漸成為了抗生素開發(fā)的重要靶標。反式翻譯抑制劑KKL-35 的發(fā)現證明了上述觀點：在反式翻譯中阻礙tmRNA 給新生肽添加降解標簽的KKL-35，在抑菌實驗中展現了廣譜抗菌活性，能夠殺死結核分枝桿菌并有效抑制弗氏志賀菌和炭疽芽孢桿菌的生長[74]。后續(xù)KKL-2098、KKL-40、KKL-55、吡嗪酰胺（PZA）等反式翻譯抑制劑的研究證實反式翻譯在醫(yī)療領域具有極高的應用潛力[75-78]。在全球范圍細菌耐藥性不斷增加、超級細菌不斷產生的大環(huán)境下，反式翻譯應被視為未來進一步開發(fā)抗生素的主要靶標。