老年慢性創(chuàng)面動(dòng)物模型的建立及研究進(jìn)展*

徐 烽 樊煒靜 張寅峰 嚴(yán)仕夢(mèng) 柳國(guó)斌

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 200023)(2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200023)

進(jìn)入21世紀(jì)以來，社會(huì)人口老齡化問題逐漸成為全世界關(guān)注的社會(huì)問題，慢性疾病老年患者數(shù)量不斷增多，慢性創(chuàng)面也成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)逐漸關(guān)注的一個(gè)醫(yī)學(xué)問題[1]。數(shù)據(jù)顯示，到2050年我國(guó)老年人口(60周歲以上)總?cè)藬?shù)將達(dá)到6億以上[2-3]。我國(guó)的慢性創(chuàng)面患者占外科住院患者的1.5%～3%，其中創(chuàng)傷感染占67.5%、壓迫性潰瘍占9.2%、靜脈性潰瘍占6.5%、糖尿病足潰瘍占4.9%，其他慢性潰瘍占11.9%[4-5]。由于外傷感染所致的慢性創(chuàng)面集中于中青年人群，老年人的慢性創(chuàng)面集中于壓力性潰瘍、靜脈性潰瘍以及糖尿病足。由于老年群體身體素質(zhì)及免疫力偏低，對(duì)疾病的耐受度低，因此更加難以愈合，慢性創(chuàng)面疾病，即導(dǎo)致老年患者較年輕人更加痛苦，又給患者家庭增加了重?fù)?dān)，同時(shí)加重社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)。因此，為了優(yōu)化診療方式，諸多學(xué)者對(duì)慢性創(chuàng)面進(jìn)行研究。但是，由于倫理方面的限制，很多研究不能在人體直接進(jìn)行，這就需要相關(guān)疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型替代，因此使用相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)探索及優(yōu)化的診治方案具有重要意義。目前，已知多種慢性創(chuàng)面動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，現(xiàn)對(duì)老年患者慢性潰瘍動(dòng)物模型和創(chuàng)傷性慢性潰瘍動(dòng)物模型的構(gòu)建方法進(jìn)行綜述，為建立更優(yōu)的動(dòng)物模型提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 動(dòng)物模型

可用于制作皮膚潰瘍的動(dòng)物模型種類較多，主要有鼠、兔、豬、牛、狗等，不同動(dòng)物的組織結(jié)構(gòu)不同、價(jià)格不同及存在可操作性的差別，因此不同的潰瘍模型所選用的動(dòng)物模型也不相同。最常用的動(dòng)物模型包括鼠、豬及兔。王雪玲[6]報(bào)道，以上三種動(dòng)物之間也存在著差異，如鼠和兔的皮膚較為松弛，更接近老年人的皮膚，常用于構(gòu)建老年慢性創(chuàng)面模型。豬的皮膚緊致，接近中青年人的皮膚[7]。在研究外傷感染所致的皮膚潰瘍時(shí)，豬是比較適合的選擇。另外，選用狗、馬、牛等構(gòu)建皮膚潰瘍動(dòng)物模型的人較少，一方面相對(duì)于兔和鼠來說，狗、馬、牛等體型較大、操作困難、喂養(yǎng)條件和花費(fèi)都偏高，而且它們組織結(jié)構(gòu)與人體差異較大，選用為潰瘍模型可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響，不夠貼近臨床。

2 壓迫性潰瘍模型

壓迫性潰瘍即俗稱的壓瘡或褥瘡，是因壓力或壓力聯(lián)合剪切力[8]而導(dǎo)致的局部長(zhǎng)期受壓迫，造成局部缺氧、缺血和營(yíng)養(yǎng)不良，最終形成組織的壞死潰瘍[9]。這類患者以老年人居多，很多老年人隨著年齡的增長(zhǎng)，常伴有其他嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病，有些甚至?xí)?dǎo)致其軀體運(yùn)動(dòng)障礙，加之老年人群肌肉及皮膚松弛，更易萎縮，長(zhǎng)期臥床壓迫發(fā)展為壓瘡。為了探索長(zhǎng)期臥床老年人壓迫性潰瘍的發(fā)病機(jī)制，尋求更優(yōu)化的診療方式，全世界的科研工作者們進(jìn)行了諸多研究，模擬了不同的動(dòng)物模型，目的是為了獲得更貼近臨床的壓瘡模型。陳澤群等[7]選用4頭5～6月齡雄性小豬，禁食12 h，在對(duì)仔豬進(jìn)行注射麻醉之后，采用自制可調(diào)節(jié)螺紋—彈簧壓力模具，根據(jù)“壓力大小/壓迫時(shí)間”進(jìn)行分組，結(jié)果顯示15 kg/2 h和20 kg/2 h兩組壓瘡模型效果最好。這兩組模型中受壓皮膚出現(xiàn)完全缺氧，從而導(dǎo)致小動(dòng)脈閉塞，光鏡下可以看到，斷裂壞死的膠原纖維和脂肪細(xì)胞；血管表現(xiàn)為管腔內(nèi)充血或破裂，表皮與真皮脫離，并在交界處有明顯的裂隙，造成永久性不可逆性損傷。20 kg/2 h組的創(chuàng)面中，膠原纖維斷裂及壞死程度要明顯高于15 kg/2 h組。因此，20 kg的壓力，作用2 h來制作小型豬深度壓瘡模型最為合適。在臨床上，壓瘡的發(fā)生與發(fā)展是壓力、剪切力和摩擦力三者共同作用形成的，剪切力加重組織缺血程度，摩擦力損傷皮膚表面，加速壓瘡形成[10]；剪切力主要影響深部組織，摩擦力主要作用于表皮組織[11]。由此可見，壓力、摩擦力及剪切力這三大因素都在臨床壓瘡形成中占有重要地位。該模型的不足之處只模擬出了壓力因素所導(dǎo)致的潰瘍面。另外，由于壓瘡的患者主要集中于老年人，而豬的皮膚緊致，因此保持實(shí)驗(yàn)條件不變的情況下，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物換成兔子更加貼近于老年臨床患者。在下一步的研究中，不僅可以逐漸加入剪切力和摩擦力兩因素，還可以采用兔子制作壓瘡模型進(jìn)行橫向?qū)Ρ?，逐漸完善并趨近于臨床的壓瘡模型。

3 靜脈性潰瘍模型

目前，我國(guó)下肢靜脈性潰瘍患者占下肢慢性潰瘍患者的90%，而下肢慢性潰瘍的發(fā)病率達(dá)到了0.5%～3%[12-13]。美國(guó)的老年人下肢靜脈潰瘍的平均發(fā)病率是2.2%，而年輕人發(fā)病率是 0.5%[13]。由此可見該病在老年人群體中更應(yīng)該引起我們的重視和關(guān)注。下肢靜脈性潰瘍的發(fā)生是由于長(zhǎng)期的靜脈功能不全和靜脈高壓，血液回流受阻，導(dǎo)致局部組織瘀滯性缺氧、營(yíng)養(yǎng)不良，日久潰破形成潰瘍。因此，建立合適的靜脈性潰瘍動(dòng)物模型，在臨床醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中十分重要。王茜等[14]通過下肢深靜脈血栓模型和局部皮膚缺損模型相結(jié)合的方法制備靜脈性潰瘍模型的方法是：選取大鼠左側(cè)腹股溝內(nèi)側(cè)的髂—骨靜脈1 cm，在近、遠(yuǎn)心端用動(dòng)脈夾夾閉此靜脈，并且在動(dòng)脈夾相鄰位置用無齒蚊式鉗夾閉3 s，之后縫合皮膚。24 h后，將血管夾取出，下肢深靜脈血栓模型制備成功。3 d后，在左大腿外側(cè)剪去直徑1.5 cm圓形創(chuàng)面的全層皮膚，制作局部皮膚缺損模型，最終制成靜脈性潰瘍模型。結(jié)果顯示，模型動(dòng)物血漿中的D-二聚體含量明顯增高，凝血酶生成增多及纖溶酶活性增強(qiáng)。這些都特異性反映出血液凝結(jié)狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)[15-16]。以上結(jié)果證明血栓模型是可行的。另外，大鼠后期潰瘍面積增大、愈合率降低、電鏡下細(xì)胞破壞嚴(yán)重及結(jié)構(gòu)疏松、炎細(xì)胞明顯增多并有纖維結(jié)締組織增生，證明靜脈性潰瘍模型建立良好。該模型的建立具有創(chuàng)新性，成模率較高，為今后靜脈性潰瘍的基礎(chǔ)研究提供了參考。另外，根據(jù)靜脈性潰瘍的發(fā)病機(jī)制來看，模擬建立慢性靜脈高壓模型，并且配合組織損傷，是否也能達(dá)成靜脈性潰瘍動(dòng)物模型的成功制備。張智輝等[17]通過環(huán)縮SD大鼠下腔靜脈下段和髂總靜脈，建立了合適的慢性靜脈高壓的動(dòng)物模型。將大鼠下腔靜脈下段進(jìn)行分離，于外表面平行放置一直徑0.25 mm導(dǎo)管管芯，隨后1號(hào)絲線結(jié)扎，抽出管芯，同樣方法環(huán)縮雙側(cè)髂總靜脈。結(jié)果表明，在同時(shí)縮窄髂總靜脈和下腔靜脈后，大鼠后肢的靜脈高壓持續(xù)了12周以上。回顧以往建立后，肢靜脈高壓動(dòng)物模型，一般選擇直接結(jié)扎股靜脈或髂靜脈，或制造股動(dòng)靜脈瘺，這些方法構(gòu)建的模型死亡率高，并且壓力上升幅度太大[18]，而同時(shí)環(huán)縮大鼠下腔靜脈和髂總靜脈的建模方式更加符合下肢慢性靜脈功能不全的病理生理改變。不足的是，該實(shí)驗(yàn)過程中，并未出現(xiàn)大鼠下肢水腫或潰瘍，并且12周以后壓力逐漸下降直到恢復(fù)正常。是否可以用該方法進(jìn)行靜脈性潰瘍發(fā)生前的有關(guān)研究，亦或是完善實(shí)驗(yàn)方案，人為干預(yù)形成潰瘍，觀察是否符合臨床下肢靜脈潰瘍的病理特點(diǎn)。

總的來說，靜脈性潰瘍的動(dòng)物模型建立的研究還是偏少，靜脈性潰瘍動(dòng)物模型構(gòu)建體系尚不成熟，仍需要不斷探索新的建模方式，篩選出最合適的靜脈性潰瘍動(dòng)物模型，實(shí)現(xiàn)模型標(biāo)準(zhǔn)化。

4 糖尿病足模型

糖尿病足作為糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，危害巨大，嚴(yán)重情況下可以致殘甚至威脅生命。Zhang等[19]報(bào)道顯示，全世界每年有910萬～2 610萬糖尿病患者患有足潰瘍，全球患病率高達(dá)6.3%，而在我國(guó)50歲以上的糖尿病患者后期并發(fā)糖尿病足的發(fā)病率高達(dá)8.1%[20]。相比于正常的創(chuàng)傷，糖尿病足的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。Rathur等[21]、Snyder等[22]及Anderws等[23]研究表明，由于長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)造成神經(jīng)及外周血管病變，直接引起患者下肢末端感覺缺失、血流不足及營(yíng)養(yǎng)不良。因此，日久潰破難以愈合。

目前，最常用的糖尿病足動(dòng)物模型是鼠類模型，少數(shù)研究者選用豬[24-25]、兔[26-27]等較大型動(dòng)物。由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自發(fā)病變形成糖尿病潰瘍時(shí)間較長(zhǎng)，因此研究者們通常使用模擬潰瘍病理因素來幫助建模。目前主流的方法有感染性、缺血性和神經(jīng)性潰瘍模型[28]。在制作糖尿病模型時(shí)，由于成本問題，大部分實(shí)驗(yàn)會(huì)選擇四氧嘧啶(alloxan，ALX)或者鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)結(jié)合高脂飼料飼喂來進(jìn)行建模，該方法所建立的模型更接近于臨床上的2型糖尿病。ALX和STZ作用機(jī)制都是破壞胰島β細(xì)胞，造成內(nèi)分泌紊亂而使血糖升高，形成糖尿病。研究表明，ALX建模的成功率高于STZ，但是ALX的缺點(diǎn)是對(duì)動(dòng)物的肝、腎毒性較大，這也是死亡率偏高的原因，而STZ作用較為緩和，對(duì)阻止損害較輕，死亡率也相應(yīng)地降低[29]。Rakieten等[30]報(bào)道,STZ誘導(dǎo)糖尿病根據(jù)給藥方式的不同其成模效果也有差異，如：小劑量分次給藥可以建立類似于人類1型糖尿病的動(dòng)物模型；采用較大劑量一次性注射給藥，可以模擬人類2型糖尿病的速發(fā)型糖尿病模型。基于此原因，STZ作為常用誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糖尿病的藥物。另外直接選購轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠(db/db)，其病變程度高，更有利于研究[31]。由于糖尿病足缺血模型的制作方式和壓迫性潰瘍以及靜脈性潰瘍的造模方式類似，在這里不再贅述，主要介紹神經(jīng)性和感染性模型。

4.1 神經(jīng)性病變潰瘍模型

外周神經(jīng)病變所導(dǎo)致的糖尿病足潰瘍患者局部感知功能缺失及關(guān)節(jié)變形，足部因過度受壓而產(chǎn)生潰瘍的程度更高危[32-33]。Jin等[34]選用Wistar大鼠，人工使用STZ誘導(dǎo)產(chǎn)生糖尿病，并保持一個(gè)月的高血糖狀態(tài)，促進(jìn)神經(jīng)病變，一個(gè)月后分離大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)，再約一周后，大鼠右后肢自然形成了潰瘍。該方法很好地模擬了臨床上糖尿病足神經(jīng)病變的過程，但是這種方法的自發(fā)率還是偏低，因此采用神經(jīng)病變來建模的方式目前還不常用。

4.2 感染性潰瘍模型

糖尿病同樣會(huì)損害患者的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致其免疫低下，比健康者更易受感染。因此，感染性潰瘍模型也被研究者們所采用的。根據(jù)大部分的糖尿病足傷口感染的是金黃色葡萄球菌，因此通常會(huì)選用該菌種作為建模所需的病原菌。Chhibber等[35]選用四氧嘧啶誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生糖尿病，在小鼠足部皮下注射甲氧西林金黃色葡萄球菌懸液，分別于注射后的1、3、5、7、9和12 d處死小鼠，取足部感染組織勻漿稀釋液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)來證明建模成功。

以上兩種建模方式主要目的在研究糖尿病足自發(fā)性潰瘍，但是如果僅僅為了模擬糖尿病足潰瘍的外在狀態(tài)，目前主要采用的是直接對(duì)糖尿病鼠進(jìn)行皮膚切除或者皮膚燙傷，這種方式只是延遲了傷面的愈合，并不能算嚴(yán)格意義上的慢性難愈創(chuàng)面，并不是適用于糖尿病潰瘍的機(jī)制研究。

5 展望

慢性創(chuàng)面又稱慢性難愈性創(chuàng)面，目前對(duì)它沒有明確的定義，但一般把由內(nèi)外因作用下導(dǎo)致創(chuàng)面無法通過正常的愈合過程而痊愈，具有病理性炎癥反應(yīng)表現(xiàn)，最終致使創(chuàng)面經(jīng)久難愈的稱為慢性難愈性創(chuàng)面[36-39]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，慢性創(chuàng)面只是一種疾病并發(fā)癥。付小兵[40]提出，應(yīng)該把慢性創(chuàng)面當(dāng)成一種疾病來看待。該類型的創(chuàng)面老年群體中發(fā)生的幾率偏大，因而在近些年，國(guó)內(nèi)外很多關(guān)注老年病的研究都在不斷研究促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合的治療方法，包括研發(fā)新型敷料、新的創(chuàng)面應(yīng)用藥物、物理療法等，并且不斷深入研究細(xì)胞通路領(lǐng)域，以進(jìn)一步闡明發(fā)病機(jī)制。這些都離不開基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，就需要更加完善的及可重復(fù)性高的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。復(fù)制率高、專一性好且再現(xiàn)性好是一個(gè)好的疾病模型應(yīng)該具備的特點(diǎn)[41]。

任何一種動(dòng)物模型都不能完全模擬出臨床患者疾病的所有表現(xiàn)，只能作為一種間接研究，做到某個(gè)發(fā)病階段或某個(gè)方面和臨床疾病相似，動(dòng)物模型終究無法代替人體。因此，即使動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果是有效的，也還需要在人體上得到驗(yàn)證。一旦發(fā)現(xiàn)與臨床疾病不同之處，必須及時(shí)分析差異，找出原因，正確評(píng)估實(shí)驗(yàn)方案。