miR-486-5p對博萊霉素致小鼠肺纖維化的作用及機制研究

徐婷婷 馮海英 朱振華

[摘要] 目的 研究觀察微小核糖核酸-486-5p（miR-486-5p）對博萊霉素致肺纖維化（PF）小鼠中的作用及機制。 方法 選取健康、清潔級雄性C57BL/6小鼠40只，10只分為正常組，剩余30只建立博萊霉素致PF模型，為模型組、miR-486-5p低表達組、miR-486-5p過表達組，各10只。檢測miR-486-5p表達，觀察病理組織，統(tǒng)計肺指數(shù)、HYP含量，檢測FN、α-SMA蛋白表達及TGFβ1/Smad通路相關(guān)蛋白。 結(jié)果 miR-486-5p過表達組miR-486-5p表達高于模型組、miR-486-5p低表達組（P<0.05）。miR-486-5p過表達組肺指數(shù)、HYP含量低于模型組，F(xiàn)N、α-SMA、TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表達低于模型組（P<0.05）;miR-486-5p過表達組肺指數(shù)、HYP含量以及FN、α-SMA、TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表達低于miR-486-5p低表達組（P<0.05）。 結(jié)論 miR-486-5p過表達調(diào)控TGFβ1/Smad信號通路對博萊霉素致PF小鼠肺纖維化有抑制作用。

[關(guān)鍵詞] 微小核糖核酸-486-5p;博萊霉素;肺纖維化;作用機制

[中圖分類號] R563.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）34-0024-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of microRNA-486-5p （miR-486-5p） on bleomycin-induced pulmonary fibrosis（PF） in mice and its underlying mechanism. Methods Forty healthy， clean-grade male C57BL/6 mice were selected， 10 of which were assigned into the normal group， and the remaining 30 were used to establish bleomycin-induced PF models and were divided into the model group， the miR-486-5p low expression group and the miR-486-5p overexpression group， with 10 mice in each group. The miR-486-5p expression was detected， and the pathological tissue was observed. In addition， the lung index and hydroxyproline （HYP） content were counted， and the expression of fibronectin （FN） and α-smooth muscle actin （α-SMA）， and transforming growth factor-β1 （TGFβ1）/Smad pathway-related proteins were detected. Results The miR-486-5p expression in the miR-486-5p overexpression group was higher than that in the model group and the miR-486-5p low expression group（P<0.05）. The lung index and HYP content in the miR-486-5p overexpression group were lower than those in the model group， and the expressions of FN， α-SMA， TGFβ1， Smad2 and Smad3 protein in the miR-486-5p overexpression group were lower than those in the model group（P<0.05）. The lung index， HYP content， and the expressions of FN， α-SMA， TGFβ1， Smad2， and Smad3 protein in the miR-486-5p overexpression group were lower than those in the miR-486-5p low expression group（P<0.05）. Conclusion The miR-486-5p overexpression plays a role of inhibiting bleomycin-induced PF in mice through regulating the TGFβ1/Smad signaling pathway.

[Key words] microRNA-486-5p; Bleomycin; Pulmonary fibrosis; Mechanism

肺纖維化（Pulmonary fibrosis，PF）屬于一種慢性炎癥反應(yīng)疾病，患者主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎、間質(zhì)纖維化等，且近年來顯示其發(fā)病率逐年增加，患者5年生存率低于50%[1]。目前臨床關(guān)于PF發(fā)布機制較為復(fù)雜，主要通過糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等治療，但治療效果不理想[2]。目前，在動物研究中常常通過氣管運送博萊霉素建立肺纖維化模型，模擬人特發(fā)性肺纖維化疾病，研究其發(fā)病機制[3]。已經(jīng)有研究證實，在肺纖維化發(fā)病過程中，涉及到多種細胞因子、基因等復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，微小核糖核酸（miRNAs）在肺纖維化發(fā)生中至關(guān)重要[4]。已有研究證實，在矽肺及特發(fā)性肺纖維化患者血清和肺組織中，miR-486-5p表達下調(diào)，可作為早期肺纖維化疾病標志物[5]。目前臨床缺乏miR-486-5p參與肺纖維化作用機制，因此本研究旨在探討miR-486-5p對博萊霉素致PF小鼠的作用及機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料來源

選取健康、清潔級雄性C57BL/6小鼠40只，體質(zhì)量20～25 g，均由賽業(yè)（固安）生物科技有限公司提供，SYXK（冀）2021-005。鼠齡為6～8周。所有小鼠均給予常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水，黑/白光照交替12 h，溫度為20～25℃，濕度為40%～50%。

1.2 方法

1.2.1 博萊霉素致PF模型建立? 40只小鼠隨機選取10只作為正常組，剩余30只參考文獻[6]建立博萊霉素致PF模型，小鼠麻醉蘇醒后常規(guī)飼養(yǎng)21 d。

1.2.2 分組及干預(yù)? 30只模型小鼠隨機分為模型組、miR-486-5p低表達組、miR-486-5p過表達組，各10只。腺病毒載體Ad-miR486及空載腺病毒（由上海漢恒生物公司提供）。miR-486-5p過表達組使用微量注射器給予75 μL攜帶miR-486-5p腺病毒溶液（正義鏈：TGGGATCCATGAGGAAGGGACATGAAGA;反義鏈：ACCGAAGCTTAAAAAAGCTCGGTCCCAGAGTCAG）;miR-486-5p低表達組使用給予75 μL腺病毒載體溶液（正義鏈：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT;反義鏈：ACGUGACACGUUCGGAGAATT）;模型組、正常組兩組均給予75 μL的生理鹽水干預(yù)，直接注射到肺組織中，各組均連續(xù)干預(yù)5 d。

1.3 觀察指標

1.3.1 miR-486-5p檢測? 取小鼠尾部靜脈血3 mL，3000 r/min離心10 min，取得上層血清，放置-20℃凍箱內(nèi)備用。采用實時熒光定量PCR檢測，嚴格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit）逆轉(zhuǎn)成cDNA操作說明書進行，2-ΔΔCT法對miR-486-5p表達水平分析。

1.3.2 病理組織觀察? 干預(yù)后5 d小鼠麻醉處死后，采集小鼠肺部組織，提取后采用生理鹽水沖洗后，清除干凈，吸干后制備切片，經(jīng)過二甲苯脫蠟后，梯度酒精水化，蘇木精染色5 min，流水沖洗后給予伊紅染色30 s，觀察。

1.3.3 統(tǒng)計肺指數(shù)、羥脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）含量? 小鼠處死后取肺組織稱重，生理鹽水沖洗后吸干水分再次稱重，肺指數(shù)=肺濕重/小鼠體質(zhì)量。取適量肺組織勻漿采用堿水水解法檢測肺組織中HYP含量。

1.3.4 α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)n）表達檢測? 酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA），試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所，試驗操作嚴格根據(jù)說明書的步驟進行。

1.3.5 轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad信號通路相關(guān)蛋白檢測? 采用免疫印跡（Western blot）將標本提取液通過1000 rpm離心處理后提取沉淀，滴加裂解液、反復(fù)凍融后，120 000rpm離心處理，提取上清液，采用酶標儀檢測TGFβ1、Smad2、Smad3 蛋白濃度，保存。滴加10%的分離膠，封閉，吸干水分，給予5%的濃縮膠灌注，凝固后，將其在電泳槽中固定，加5 μL Marker、變性蛋白樣品，電泳干預(yù)30 min，待蛋白分離膠底，結(jié)束電泳;轉(zhuǎn)膜成功后將硝酸纖維素膜（Nitrocellulosefilter membrane，NC）在5%的脫脂奶粉中封閉固定1 h，加一抗（TGFβ1、Smad2、Smad3 1∶1000）孵育，經(jīng)過震蕩洗膜后加二抗（TGFβ1、Smad2、Smad3 1∶10 000），孵育，再次震蕩洗膜，使用紅外熒光成像系統(tǒng)對結(jié)果給予分析，以GAPDH為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析處理。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差齊性檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠miR-486-5p表達比較

模型組、miR-486-5p低表達組miR-486-5p表達低于正常組，miR-486-5p過表達組miR-486-5p表達高于正常組（P<0.05）;miR-486-5p過表達組miR-486-5p表達高于模型組、miR-486-5p低表達組（P<0.05）。見圖1。

2.2各組小鼠肺病理組織觀察

正常組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡中無炎癥浸潤;模型組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡中有大量炎癥細胞浸潤，肺泡間隔變寬，有大量成纖維細胞出現(xiàn);miR-486-5p低表達組肺泡結(jié)構(gòu)、肺泡間隔等表現(xiàn)更為嚴重;miR-486-5p過表達組肺泡結(jié)構(gòu)逐漸清晰，肺泡中炎癥細胞浸潤改善。見封三圖2。

2.3 各組小鼠肺指數(shù)、HYP含量比較

模型組、miR-486-5p低表達組、miR-486-5p過表達組肺指數(shù)、HYP含量高于正常組（P<0.05）;miR-486-5p低表達組肺指數(shù)、HYP含量高于模型組，miR-486-5p過表達組肺指數(shù)、HYP含量低于模型組（P<0.05）;miR-486-5p過表達組肺指數(shù)、HYP含量低于miR-486-5p低表達組（P<0.05）。見表1。

2.4 各組小鼠FN、α-SMA蛋白表達比較

模型組、miR-486-5p低表達組、miR-486-5p過表達組FN、α-SMA蛋白表達高于正常組（P<0.05）;miR-486-5p低表達組FN、α-SMA蛋白表達高于模型組，miR-486-5p過表達組FN、α-SMA蛋白表達低于模型組（P<0.05）;miR-486-5p過表達組FN、α-SMA蛋白表達低于miR-486-5p低表達組（P<0.05）。見表2。

2.5各組小鼠TGFβ1/Smad信號通路相關(guān)蛋白相對表達量比較

模型組、miR-486-5p低表達組、miR-486-5p過表達組TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表達高于正常組（P<0.05）;miR-486-5p低表達組TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表達高于模型組，miR-486-5p過表達組TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表達低于模型組（P<0.05）;miR-486-5p過表達組TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表達低于miR-486-5p低表達組（P<0.05）。見表3、圖2。

3討論

博萊霉素屬于一種抗腫瘤藥物，其主要的不良反應(yīng)是肺毒性，導(dǎo)致肺泡炎發(fā)生，發(fā)展為肺間質(zhì)纖維化，通過博萊霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化模型病理特點與早期普通間質(zhì)性肺炎及特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化相似[7-8]。

在動物實驗研究中證實，miR-29、miR-200等均具有一定的抗纖維化作用[9-10]，但關(guān)于miR-486-5p抗纖維化作用研究較少。本研究結(jié)果顯示，miR-486-5p過表達組miR-486-5p表達高于模型組、miR-486-5p低表達組，提示miR-486-5p過表達構(gòu)建成功。PF主要病理變化主要體現(xiàn)在肺組織結(jié)構(gòu)被破壞，伴隨大量的炎性細胞浸潤，成纖維細胞異?；罨痆11]。本研究中博萊霉素致PF小鼠肺組織HE染色發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎，肺泡中有大量炎性細胞浸潤，說明博萊霉素致PF模型建立成功，與付鈺等[12]研究結(jié)果保持一致。

肺指數(shù)能有效反映肺組織炎癥、PF嚴重程度，HYP含量在肺組織膠原纖維中大量存在，其含量高低能反映肺組織膠原纖維變化，對膠原組織代謝有評估作用[13]。本研究結(jié)果顯示，miR-486-5p過表達組肺指數(shù)、HYP含量明顯降低，提示miR-486-5p過表達可以降低PF小鼠肺組織中HYP含量，有助于組織修復(fù)，抑制肺纖維化進程。FN主要存在于細胞外基質(zhì)中，對成纖維細胞有趨化刺激作用，在肺纖維化過程中，F(xiàn)N會促進成纖維細胞增生，加快膠原細胞合成和轉(zhuǎn)錄[14]。張翠影等[15]研究指出，α-SMA蛋白在肺纖維化組織中顯示高表達，與纖維化程度呈正相關(guān)。以上研究證實，F(xiàn)N、α-SMA蛋白參與肺纖維化發(fā)生過程。本研究結(jié)果顯示，miR-486-5p過表達組FN、α-SMA蛋白表達下降，提示miR-486-5p過表達通過抑制FN、α-SMA蛋白表達，控制肺纖維化疾病發(fā)展。

本研究中肺成纖維細胞TGFβ處理后，會促進miR-155表達上調(diào)，成纖維細胞生長因子（FGF-7）屬于miR-155靶基因，miR-155表達水平與博萊霉素致PF小鼠纖維化程度相關(guān)[16]。TGFβ信號通路在纖維化過程中至關(guān)重要，TGFβ1直接作用于成纖維細胞，促進其增殖，向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，大量細胞外基質(zhì)釋放，導(dǎo)致纖維化產(chǎn)生[17-18]。本研究結(jié)果證實，miR-486-5p過表達組TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表達降低，分析miR-486-5p作用機制為miR-486-5p下調(diào)TGFβ1表達，避免Smads蛋白發(fā)生磷酸化，避免介質(zhì)Smad4蛋白形成三聚體，抑制肺成纖維細胞轉(zhuǎn)化，減少肺組織中FN、α-SMA蛋白表達[19-20]。

綜上所述，miR-486-5p過表達能改善博萊霉素致PF小鼠肺病理組織，降低肺指數(shù)、HYP含量及FN、α-SMA蛋白表達，通過調(diào)控TGFβ1/Smad信號通路相關(guān)蛋白，抑制小鼠肺纖維化，為臨床研究肺纖維化疾病治療提供有效的靶點。

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（收稿日期：2021-06-28）