表面增強拉曼光譜對抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶的檢測研究

周國良，黃光耀，李盼，王宏志,3*，楊良保*

(1 中國科學院合肥物質科學研究院醫(yī)學物理與技術中心，安徽合肥 230031;2 中國科學技術大學，安徽合肥 230026 3 中國科學院合肥腫瘤醫(yī)院，安徽合肥 230031)

1 引言

腫瘤一直是威脅人類生命健康的重大疾病之一，全世界每年有1400多萬新病例和800多萬癌癥患者死亡。隨著醫(yī)療行業(yè)的不斷發(fā)展，抗腫瘤藥物方面的研究也有著巨大的進步。但是一般的抗腫瘤藥物本身就帶有毒性，不僅僅對腫瘤細胞產生效果也會對自身的其他良好細胞造成一定的傷害，因此出現(xiàn)很多不良癥狀。5-FU是一種臨床應用于結腸癌、直腸癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、絨毛膜上皮癌、惡性葡萄胎、頭頸部鱗癌、皮膚癌、肝癌、膀胱癌等的治療藥物[1]。它通過抑制DNA來控制腫瘤細胞的增殖，但是其治療劑量與中毒劑量[2]是相近的，因此建立一種快速有效的檢測5-FU藥物濃度的方法，確定5-FU安全有效的劑量，在臨床用藥方面具有重要意義。

目前，高效液相色譜(HPLC)[3]，已被廣泛應用于全血5-FU的測定。雖然HPLC在靈敏度、準確性以及精密度上有很大的優(yōu)勢，但是對5-FU樣品的前處理過程復雜，回收率低，檢測時間長，同時也不利樣本的快速檢測。其次應用較多的是液質聯(lián)用技術(LC-MS/MS)[4]。雖然上述常用方法在檢測5-FU中有很好

的應用，但是存在不同程度的操作復雜、費時費力、成本高和試劑保存時間短等諸多缺點，且操作人員需要較高的專業(yè)技術，有礙于該技術的推廣。因此，建立一種快速有效的方法來檢測5-FU，具有重要的意義。

表面增強拉曼光譜(Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)[5]是指當分子吸附于某些粗糙的金屬(Ag、Au、Cu 等)表面或金屬納米顆粒表面時，吸附分子的散射截面會被金屬表面的局域電磁場劇烈放大，其拉曼散射強度會增加 104-108倍。SERS技術因快速靈敏、無損，具備分子指紋、專一性和單分子靈敏性的特點，能在分子水平上提供物質、結構的豐富信息，已逐漸成為化學、生物、環(huán)境、食品、藥物等領域一種強有力的檢測手段[6-11]。本文將利用種子生長法合成的均一分散的銀納米顆粒[12]作為SERS基底，結合便攜式拉曼光譜儀器，開展 5-FU的檢測研究。

2 實驗部分

2.1 儀器設備

數顯智能控溫磁力攪拌器(型號SZCL-2，鞏義市予華儀器責任有限公司)，超聲波清洗器(型號KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司)，低溫高速離心機(型號Sigmal1-16K，德國Sigma公司)，十萬分之一電子天平(型號EX125DZH，奧豪斯儀器有限公司)，場發(fā)射掃描電子顯微鏡(型號FEI Sirion-200，日本島津公司)，紫外-可見分光光度計(型號UV-2550，日本島津公司)，便攜式拉曼光譜儀(型號Spk-2-0588，上海如海光電科技有限公司)。

2.2 實驗材料與試劑

氟尿嘧啶注射液(旭東海普藥業(yè)有限公司)，檸檬酸鈉(AR，上海國藥試劑公司)，結晶紫(AR，上海阿拉丁試劑有限公司)，氫氧化鈉(AR，上海國藥試劑公司)，雙氧水(AR，上海國藥試劑公司)，鹽酸(AR，上海國藥試劑公司)，硝酸(AR，上海國藥試劑公司)，硫酸(AR，上海國藥試劑公司)。

2.3 銀溶膠制備

通過種子生長法合成均一分散的Ag NPs。首先合成種子溶液：將1 mL檸檬酸鈉溶液(1 wt %)，0.25 mL AgNO3水溶液(1 wt%)和0.2 mL NaCl水溶液(20 mM)依次加入1.05 mL水中，在室溫下攪拌預混合5分鐘后，將上述預混合物快速加入47.5 mL沸水中。加熱攪拌1 h后，將所得溶液冷卻至室溫，最終得到亮黃色的Ag NPs種子溶液。第二步：使用不同體積的種子溶液合成不同粒徑的Ag NPs。將2 mL AgNO3水溶液(1 wt %)與800 μL NH3·H2O混合(25～28%)制備銀氨溶液，用于Ag NPs的合成。將200 μL Ag NPs種子溶液添加到4.73 mL水中在室溫下攪拌。隨后，將70 μL銀氨溶液和AA水溶液(2 mL，2.5 mM)加入上述種子溶液中用與納米顆粒的生長。攪拌1小時后，獲得粒徑約85 nm的Ag NPs。將上述溶液離心濃縮后，再分散于檸檬酸鈉水溶液(0.02 wt%)中保存?zhèn)溆??？梢酝ㄟ^調節(jié)種子溶液的量合成不同粒徑的Ag NPs。根據所得到的Ag NPs粒徑大小與粒子數濃度的關系，通過改變Ag NPs種子的數量，可以精確地調控Ag NPs的粒徑大小。此方法可以通過一鍋種子介導生長法在水中合成大尺寸跨度(從40到300 nm)的準球形銀納米粒，不需要再使用額外的強穩(wěn)定劑，并不是多步驟種子介導生長。利用Mie理論可以制備出不同尺寸和可預測消光譜的高質量準球形銀納米粒子，從而使我們能夠將這些尺寸不同的均勻銀納米粒子擴展到不同的領域。研究結果還表明，形狀和尺寸分布窄(例如小于10%)的Ag NPs能夠在溶液中實現(xiàn)SERS信號的均勻性和再現(xiàn)性；在空間和時間尺度上，它們的RSD可以低至5%。因此，我們制備的形狀和尺寸均勻的銀納米粒子的方法可以實現(xiàn)溶液中SERS的定量測定。

2.4 SERS基底的制備

在進行表征以及表面增強拉曼檢測之前需要制備SERS基底，將合成的銀納米顆粒進行離心、濃縮處理。

2.5 銀納米顆粒粒徑的選擇和基底穩(wěn)定性研究

由于CV分子拉曼散射截面大，信號穩(wěn)定，能夠穩(wěn)定吸附在基底表面，因此選擇CV[13]作為探針評估SERS基底的增強效果以及穩(wěn)定性。實驗中選擇CV(10-6M)對三種不同粒徑的Ag NPs的增強效果進行對比，選擇增強效果最好的作為基底檢測5-FU。其次，滴加10 μL 10-6M的CV至篩選的基底表面，在室溫下自然干燥后，評估基底的穩(wěn)定性。

圖1 5-FU拉曼光譜圖和SERS圖Fig.1 Raman and SERS spectra of 5-FU

圖2 銀基底靈敏度和穩(wěn)定性研究圖譜Fig.2 Characterization of sensitivity and stability of SERS substrates

2.6 抗腫瘤藥物5-FU的SERS檢測

(1)5-FU的標準品的拉曼光譜:將5-FU注射液加入比色皿中，采集其拉曼光譜。結果如圖4。

(2)銀基底的背景信號采集:移取2 μL濃縮銀基底放到硅片上，用便攜式拉曼儀采集銀基底的信號，評估基底對檢測信號的干擾。

(3)檢測不同濃度的5-FU:將配制的不同濃度5-FU與銀基底混合，然后用便攜式拉曼儀進行檢測，激發(fā)波長為785 nm，激發(fā)功率為100 mw，積分時間為2 s。得到不同濃度5-FU的SERS光譜，并指認5-FU的特征光譜譜帶。檢測結果如圖5。

2.7 血清中5-FU的檢測[14]

將不同濃度的5-FU加入血清中，搖勻混合，加入乙醇與血清混合(體積比3∶1)，沉淀去蛋白質等干擾物。離心后取上清液與基底混合檢測，結果如圖7。

3 結果與討論

3.1 Ag NPs掃描電鏡表征和紫外-可見吸收光譜表征

對本實驗所制備的Ag NPs進行掃描電鏡測試。將離心再分散后的Ag NPs滴在干凈的硅片上，待其自然變干后，進行數據采集。圖3A、B、C是不同粒徑Ag NPs的電鏡掃描圖。根據掃描電鏡對其形貌表征結果可知：通過調節(jié)種子的量，可以獲得粒徑約60～80 nm之間的納米顆粒，且顆粒排列有序，無明顯的團聚現(xiàn)象。

圖3 不同粒徑Ag NPs的光學照片、掃描電鏡圖以及紫外-可見吸收光譜圖。Fig.3 Optical photographs,Scanning electron microscopy (SEM) and ultraviolet-visible absorption spectra of Ag NPs with different diameter

對制備的銀納米顆粒進行紫外表征。取一定量的Ag NPs加入到比色皿中，用紫外可見分光光度計采集400 nm～800 nm之間Ag NPs的吸收峰。納米粒子的大小、形貌不同，會導致其產生吸收峰的位置有所不同，因此可以通過紫外可見吸收光譜反映其形貌顆粒大小等特點。通過上圖可以觀察到本實驗制備的銀納米顆粒在488、468、460 nm 處有吸收峰。根據文獻報道，粒徑分布在60～80 nm之間，與SEM結果一致。

3.2 銀基底的篩選

圖4A-C分別是700 μL、1000 μL和1200 μL種子溶液合成的Ag NPs對10-6M CV的檢測結果。如圖所示，不同粒徑的Ag NPs均可以實現(xiàn)CV分子的可靠檢測。實驗中以1602 cm-1的強度進行統(tǒng)計。如圖D所示，通過三種不同粒徑的Ag NPs對CV檢測的特征峰強度對比。700 μL種子溶液合成的Ag NPs(粒徑80左右)對CV的增強效果最好。因此，選用銀納米粒子作為SERS基底對 5-FU進行檢測。

圖4 不同粒徑銀納米粒子的增強效果對比圖Fig.4 Comparison of Enhancement Effect of Silver Nanoparticles with Different Diameter

3.3 銀基底的重復性表征

基底的重復性是SERS基底可靠性的重要參數之一。為了考察銀基底的重復性，實驗中選擇10-6MCV作為探針分子評估基底重復性。只有基底具有較好的重復性，才能保證SERS信號的穩(wěn)定性。CV是一種三苯甲烷類分子，拉曼活性高，在可見區(qū)域有明顯的電子吸收光譜。如圖3A所示，在基底表面隨機采集30條光譜，SERS光譜表現(xiàn)出較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。1585 cm-1和1616 cm-1歸屬于苯環(huán)伸縮振動分裂；1370 cm-1歸屬于C-H面內彎曲振動和N-C-環(huán)-C-C對稱伸縮振動疊加而成；1173 cm-1歸屬于苯環(huán)上C-H面內彎曲振動模式；915 cm-1歸屬于C-H面外彎曲振動模式；803 cm-1歸屬于C-N-C對稱伸縮振動模式。實驗中以特征峰1616 cm-1強度進行統(tǒng)計，量化基底的均一性。如圖3B和3D所示，基底的相對標準偏差在10%左右，因此基底的均一性較好，為后期SERS信號的穩(wěn)定性和重復性提供了保障?；谏鲜鯯ERS譜圖，可以初步說明Ag NPs基底對待測物能夠進行信號放大。

3.4 5-FU標準品的拉曼光譜圖和SERS圖

圖A為5-FU標準品的拉曼光譜圖，770 cm-1拉曼光譜為嘧啶環(huán)振動，拉曼儀的設置條件為：波長為785 nm、功率為100 mw、積分時間2 s。

圖B為5-FU(25 mg/L)的SERS光譜。通過文獻調研，5-FU的特征峰歸屬如下:1234 cm-1的譜帶歸屬于C-F 伸縮振動；1340 cm-1歸屬于C-H 伸縮振動；1400 cm-1歸屬于N-H 伸縮振動；1672 cm-1歸屬于C=O 伸縮振動。

圖A的拉曼光譜圖與圖B的SERS光譜圖差異較大，可能是因為分子與金屬表面之間強烈的化學作用，可能導致分子的對稱性甚至電子結構的改變。這種效應導致相對強度的變化和頻移。這種差異還由金屬表面電磁場決定的表面選擇規(guī)則。

3.5 不同濃度5-FU的SERS檢測圖譜

圖5為不同濃度的5-FU以及基底的SERS光譜，圖A中5-1分別是25 μg/mL、12.5 μg/mL、2.5 μg/mL、0.25 μg/mL 5-FU的SERS特征峰以及銀基底的空白背景峰。根據圖A可以得知，5-FU的特征峰不受基底信號影響。圖B為四種不同濃度5-FU在1234cm-1特征峰處的強度對比圖。

圖5 不同濃度的5-FU SERS檢測譜圖Fig.5 SERS Spectra of 5-FU with Different Concentrations

由圖B的特征峰強度對比可得：5-FU濃度越高，特征峰越強，目前5-Fu的檢測限為0.25 μg/mL。

3.6 血清中的5-FU的SERS檢測

將5-FU按照標準加入法加入到血清中，配制不同濃度5-FU的血清溶液。根據優(yōu)化的前處理技術，取40 μL 血清與120 μL乙醇混合，由于乙醇與水的親和力大，破壞了蛋白質表面的水滑坡，從而導致蛋白質的溶解度降低，引起蛋白質沉淀。1為銀基底的光譜，2為血清的光譜，3～5分別為血清去除蛋白質后，31.25 μg/mL、15.625 μg/mL和3.125 μg/mL 5-FU的特征光譜。如圖所示，純化蛋白之后，血清的特征峰對5-FU的檢測不產生干擾。血清中5-FU的檢測限為3.125 μg/mL。

圖6 血清中不同濃度5-FU SERS檢測譜圖Fig.6 SERS Spectra of 5-FU with different concentrations spiked in serum

4 結論

本研究建立了SERS快速檢測血清中5-FU的方法，利用種子生長法制備粒徑約為80 nm Ag NPs，通過CV分子評估銀基底的增強能力?；椎腞SD小于10%，結果表明種子生長法合成的Ag NPs，粒徑均一且增強效果以及穩(wěn)定性較好。對不同濃度5-FU標品進行SERS檢測，檢測限為0.25 μg/mL。針對血清中5-FU檢測，利用乙醇沉淀去除蛋白，降低檢測干擾，實現(xiàn)了血清中3.125 μg/mL 5-FU的靈敏檢測。本方法操作簡單，十分鐘內能完成檢測，有望應用于其他抗腫瘤藥物的分析測定，為臨床給藥提供新的技術支撐。