孫麗莉, 張朝, 彭曉萌, 徐冰霞, 陳剛

光譜法研究阿維菌素與溶菌酶的相互作用

孫麗莉, 張朝, 彭曉萌, 徐冰霞, 陳剛

(煙草化學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 安徽 合肥, 230088)

為研究阿維菌素殘留被生物體吸收后, 在生物體內(nèi)的作用機(jī)理, 在模擬生理?xiàng)l件下, 應(yīng)用熒光光譜、圓二色譜和同步熒光研究阿維菌素與溶菌酶相互作用的活性機(jī)理。研究表明, 阿維菌素與溶菌酶的作用機(jī)理為熒光靜態(tài)猝滅; 兩者通過氫鍵和范德華力形成1︰1結(jié)合, 結(jié)合距離為4.55 nm; 298、303和308 K時(shí)的結(jié)合常數(shù)分別為1.10×105、1.08×105和0.38×105L·mol-1, 結(jié)合強(qiáng)度緊密; 同步熒光和圓二色譜證實(shí)阿維菌素影響溶菌酶的二級結(jié)構(gòu), 使溶菌酶分子–螺旋結(jié)構(gòu)含量減小。本文為農(nóng)藥殘留在生物體內(nèi)中代謝過程、解毒和指導(dǎo)科學(xué)使用農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

溶菌酶; 阿維菌素; 熒光光譜; 圓二色譜; 同步熒光

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中, 由于安全意識淡薄, 農(nóng)藥時(shí)有被過量使用, 導(dǎo)致農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)增加。殘留的農(nóng)藥可通過空氣和食物鏈等被生物體吸收, 與生物體中蛋白質(zhì)反應(yīng)引起急性中毒, 嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡[1]。目前, 農(nóng)藥殘留檢測和降解方法研究較多, 對農(nóng)藥在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和中毒機(jī)制研究較少。因此, 研究農(nóng)藥與生物體中蛋白質(zhì)的相互作用非常重要。

阿維菌素(Avermectin, AVM)是一種廣泛用在農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的新型抗生素, 具有結(jié)構(gòu)新穎、殘效期長等優(yōu)點(diǎn)。由于其在動物體內(nèi)殘留的時(shí)間較長, 動物組織中殘留的阿維菌素會對人體健康造成嚴(yán)重危害。溶菌酶(Lysozyme, lys)是一種廣泛分布于生物體內(nèi)的小分子堿性蛋白, 也是生物體內(nèi)不可或缺的非特異性體液免疫因子, 能夠與很多的外源和內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合, 常被用作蛋白質(zhì)模型, 研究蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、酶動力學(xué)以及分子進(jìn)化與分子免疫間的關(guān)系, 發(fā)揮其抗菌、消炎、抗病毒等諸多的生物功能[2–4]。

本文以溶菌酶作為蛋白質(zhì)模型, 用熒光光譜法研究阿維菌素猝滅溶菌酶內(nèi)源熒光的機(jī)理, 同步熒光和圓二色譜研究阿維菌素對溶菌酶結(jié)構(gòu)的影響, 以期從分子角度分析研判阿維菌素在生物體內(nèi)的活性機(jī)制, 為研制低毒高效農(nóng)藥、解毒方法和安全使用農(nóng)藥提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

阿維菌素(純度98%, 濃度0.1 mmol/L, 阿拉丁); 溶菌酶(純度99%, 濃度0.01 mmol/L, 上海生物制品有限公司); NaCl(0.1 mol/L); pH=7.4 Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液; 無水乙醇; 水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

F-4500熒光分光光度計(jì)(日立公司); UV-757CRT紫外可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司); Jasco-20c圓二色譜儀(日本島津公司)。KQ-500DE 超聲波發(fā)生器(昆山市超聲儀器有限公司); AL-204-IC電子天平(感量0.000 1 g, 瑞士Mettler Toledo公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 熒光光譜分析

準(zhǔn)確移取1 mL溶菌酶溶液(0.01 mmol/L)、1 ml Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液、1 ml NaCl溶液(0.1 mol/L)于10 mL比色管中, 阿維菌素溶液(0.1 mmol/L)依次取0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 mL, 用二次蒸餾水定容, 分別在298、303、308 K下水浴反應(yīng)15 min, 立即進(jìn)行熒光測定。

熒光光譜: 在280 nm激發(fā)波長下, 掃描溶液300–500 nm的熒光發(fā)射光譜。調(diào)狹縫寬5 nm, 光電管負(fù)高壓為400 V, 響應(yīng)速度2.0 s, 掃描速度1 200 nm/min。

1.3.2 同步熒光

固定發(fā)射波長與激發(fā)波長差Δ分別為60 nm和15 nm, 調(diào)節(jié)儀器參數(shù):波長范圍240～360 nm, 光電管負(fù)高壓400 V, 狹縫寬度5 nm, 掃描速度1 200 nm/min。

1.3.3 圓二色譜分析

將待測液置于1 mm石英吸收池中, 步幅1 nm, 掃描速度200 nm·min-1, 掃描200～350 nm范圍內(nèi)阿維菌素與溶菌酶作用前后的CD光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 AVM與Lys相互作用的熒光光譜

Lys的內(nèi)源熒光由色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸三種熒光團(tuán)組成, 但Lys的熒光強(qiáng)度主要來源于色氨酸殘基[5]。AVM與Lys相互作用發(fā)生的熒光變化見圖1。隨著AVM濃度的逐漸增加, Lys的最大熒光強(qiáng)度規(guī)律性減小, 且最大發(fā)射峰發(fā)生明顯紅移, 表明AVM與Lys發(fā)生相互作用, Lys的內(nèi)源熒光被猝滅。

圖1 AVM與Lys相互作用熒光光譜

2.2 AVM對Lys熒光猝滅機(jī)理

2.2.1 AVM-Lys的動態(tài)猝滅常數(shù)(SV)

AVM對Lys的內(nèi)源熒光猝滅可能是動態(tài)猝滅或靜態(tài)猝滅[6]。為明確AVM對Lys的猝滅類型, 研究298、303和308 K下AVM-Lys反應(yīng)體系。假設(shè)體系是動態(tài)猝滅, 遵循Stern-Volmer[7]方程:0/= 1+SV[] = 1+qτ[], 式中0是Lys的熒光強(qiáng)度,為AVM-Lys體系的熒光強(qiáng)度; [Q]是AVM的摩爾濃度;SV是AVM-Lys體系的動態(tài)猝滅常數(shù);q為猝滅速率常數(shù);0為Lys的熒光壽命(一般取生物大分子熒光壽命的平均值10-8s[5])。

圖2是298、303、308 K下, 由Stern-Volmer方程做出的AVM對Lys的猝滅圖, 斜率(SV)和截距(q)見表1。

圖2 AVM-Lys的Stern-Volmer圖

若AVM-Lys體系為動態(tài)猝滅, 則動態(tài)猝滅常數(shù)隨溫度的升高而不斷增大[8]。但由表1數(shù)據(jù)可知sv隨溫度的升高反而降低, 且298、303、308 K時(shí)的q均大于猝滅劑對生物大分子最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù), 由此判斷AVM-Lys體系不屬于動態(tài)猝滅, 該體系為靜態(tài)猝滅, 即AVM與Lys作用生成不發(fā)熒光的復(fù)合物, 導(dǎo)致Lys的熒光猝滅[8]。

表1 不同溫度下AVM與Lys的動態(tài)猝滅常數(shù)

2.2.2 靜態(tài)結(jié)合常數(shù)(A)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)()

AVM與Lys發(fā)生靜態(tài)猝滅作用時(shí)可能存在n個(gè)相同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)[6], 根據(jù)公式[9]: lg(0-)/= lgA+ nlg[], 由lg(0-)/～lg[]作圖(圖3), 斜率為AVM與Lys的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n), 截距為兩者的結(jié)合常數(shù)A[6], 結(jié)果見表2。

由表2可知, AVM–Lys的結(jié)合常數(shù)達(dá)到105L·mol-1以上, 說明兩者結(jié)合較強(qiáng); 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)近似為1, 說明一個(gè)Lys分子有一個(gè)AVM結(jié)合位點(diǎn); AVM–Lys的結(jié)合常數(shù)隨溫度的升高而減小, 說明該過程是靜態(tài)猝滅過程, 反應(yīng)生成的復(fù)合物受溫度影響較大, 溫度升高復(fù)合物穩(wěn)定性降低[6]。

圖3 lg(F0－F)/F與lg[Q]的關(guān)系

表2 AVM-Lys的靜態(tài)猝滅常數(shù)

2.2.3 熱力學(xué)參數(shù)及作用力類型

AVM與Lys結(jié)合的作用力可能有氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水力等[5]。根據(jù)Van’t-Hoff方程[10]: ln= －Δ/+ Δ/, Δ= Δ-Δ[11]。

以ln對1作圖, 由斜率-Δ/和截距Δ/求得Δ和Δ, 得到AVM–Lys結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)。根據(jù)前人的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)得出:Δ和Δ均大于0時(shí)的作用力為疏水作用, ΔHΔ均小于0時(shí)的作用力為氫鍵和范德華力, 當(dāng)Δ<0, Δ>0, 作用力為靜電引力[12]。298、303和308K下, AVM與Lys體系的熱力學(xué)參數(shù)見表3。

表3 AVM–Lys結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)

表3中, ΔG、Δ、Δ均小于0, 表明AVM–Lys體系是一個(gè)自發(fā)的放熱過程, 作用力主要是氫鍵和范德華力; 溫度升高時(shí), AVM–Lys復(fù)合物的穩(wěn)定性減弱, 復(fù)合物可能發(fā)生分解, 導(dǎo)致AVM–Lys的結(jié)合常數(shù)減小[6], 更進(jìn)一步證實(shí)AVM–Lys為靜態(tài)猝滅。

2.2.4 結(jié)合距離

為AVM︰Lys = 1∶1時(shí)的復(fù)合物熒光強(qiáng)度,是熒光光譜(Lys)與吸收光譜(AVM)的重疊積分,為熒光量子產(chǎn)率(Lys),()為Lys在波數(shù)為時(shí)的熒光強(qiáng)度,ε()為AVM在波數(shù)為時(shí)的摩爾吸光系數(shù)[6]。對于AVM, 取向因子取給體受體各向隨機(jī)分布的平均值2= 2/3 , 量子產(chǎn)率= 015, n折射指數(shù)取水和有機(jī)物平均值= 1.336[6]。

根據(jù)公式計(jì)算得出AVM與Lys的結(jié)合距離()為4.55 nm, 結(jié)合距離小于7 nm, 符合F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移條件, Lys的能量通過形成復(fù)合物轉(zhuǎn)移給AVM, 再一次驗(yàn)證AVM與Lys相互作用為靜態(tài)猝滅。

圖4 AVM吸收光譜(1)與Lys熒光光譜(2)的重疊光譜

2.3 AVM對Lys二級結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 同步熒光

AVM能猝滅Lys的內(nèi)源熒光, 我們推測Lys的構(gòu)象可能發(fā)生變化。酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸是Lys主要的熒光發(fā)色團(tuán), 但色氨酸對微環(huán)境的變化最敏感[5]。Δ= 15 nm主要提供酪氨酸殘基的微環(huán)境變化信息, Δ= 60 nm主要提供色氨酸殘基的微環(huán)境變化信息[14], 見圖5。

圖5 Δλ = 16 nm (a) 和60 nm (b) 的同步熒光光譜

由圖5(a)和(b)可知, AVM對Lys中酪氨酸殘基和色氨酸殘基均有猝滅作用, 且熒光強(qiáng)度均隨AVM濃度的增加而降低, 但色氨酸殘基(Δ= 60 nm)最大發(fā)射峰明顯紅移, 酪氨酸殘基(Δ= 15 nm)最大熒光峰位移不明顯, 說明色氨酸殘基微環(huán)境發(fā)生變化, 色氨酸殘基對環(huán)境變化更敏感, 由此推斷AVM對Lys的熒光猝滅, 主要是Lys分子中色氨酸殘基的熒光猝滅, 色氨酸殘基所處微環(huán)境的疏水性減弱, AVM與Lys可能在疏水空腔外結(jié)合。

2.3.2 圓二色譜

AVM對Lys二級結(jié)構(gòu)的影響還可以應(yīng)用CD法研究。圖6是AVM加入前、后的CD譜圖。由圖6(a)可知, Lys在207 nm和216nm處有負(fù)的吸收峰, 加入AVM后(圖6(b))Lys兩個(gè)負(fù)峰向低波數(shù)移動, 吸收強(qiáng)度也減弱, 說明AVM使Lys的二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性減弱。

根據(jù)公式:% = [(－[θ]208－ 4000)/(33000 － 4000)] × 100%[15]

計(jì)算得出Lys的-螺旋結(jié)構(gòu)含量由47.10%降低到33.28%, 表明AVM改變Lys的二級結(jié)構(gòu), AVM通過氫鍵和范德華力與Lys分子的肽鍵形成配位鍵, 使Lys分子肽鏈伸展。

3 結(jié)論

通過熒光光譜研究得知AVM與Lys的猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅, 該反應(yīng)是一個(gè)自發(fā)過程; AVM主要通過氫鍵和范德華力與Lys分子形成1︰1的較強(qiáng)結(jié)合, 結(jié)合常數(shù)達(dá)到105L·mol-1以上, 結(jié)合距離是4.55 nm。同步熒光和CD的研究結(jié)果表明AVM使Lys分子中色氨酸殘基的疏水性減弱, Lys分子的-螺旋結(jié)構(gòu)含量由47.10%降低到33.28%, 證實(shí)AVM影響Lys的構(gòu)象。

圖6 AVM-Lys的圓二色譜

本研究詳細(xì)闡述了阿維菌素農(nóng)藥殘留被生物體吸收后, 與體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)理, 這對揭示農(nóng)藥殘留在生物體內(nèi)代謝過程、解毒和安全科學(xué)使用農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

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Spectrctroscopic studies on the interaction betweenavermectin and Lysozyme

Sun Lili, Zhang Zhao, Peng Xiaomeng, Ge Shaolin, Xu Bingxia ,Chen Gang

(Anhui Key Laboratory of Tobacco Chemistry, Hefei 230088, China)

To investigate interactions between avermectin pesticide residues with protein, the interaction between avermectin and Lysozyme is studied in physiological conditions by spectroscopic methods. It is shown that fluorescence quenching mechanism of avermectin with Lysozyme is a static quenching procedure, the interaction are mainly the hydrogen bond and Van der Waals force; The distance between them is 4.55 nm by F?rster non-radiative energy transfer theory and the apparent binding constants (A) are 1.10×105(298 K)、1.08×105(303 K) and 0.38×105(308 K) L·mol-1, the binding sites () is 1; The results of CD spectra and the synchronous fluorescence indicated that the secondary structure of Lysozyme is changed when avermectin bound to Lysozyme, the content of-helical structure decreased. This study provides theoretical reference for the transport, metabolism and poisoning mechanism of residual pesticides, and provide guidance for the scientific and effective use of pesticides.

lysozyme; avermectin; fluorescence spectroscopy; CD spectroscopy; synchronous fluorescence

10.3969/j.issn.1672–6146.2021.01.019

0657

A

1672–6146(2021)01–0090–05

陳剛, 358444884@qq.com; 孫麗莉, 18756997517@126.com。

2020–4–20

安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目(2017122)。

(責(zé)任編校: 郭冬生)