陳 雷申琳溪馬翠紅王光玉

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 生物工程系,山東 威海264209)

植物內(nèi)生菌是指在植物的部分或全部生活史中,生長在植物細胞間或細胞內(nèi),且不會對植物造成直接或明顯負面影響的一類微生物,包括內(nèi)生細菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌[1]。放線菌是一類革蘭氏陽性菌,相比于其他內(nèi)生菌群,內(nèi)生放線菌有著其獨特的代謝產(chǎn)物,是新型生物活性化合物的重要來源[2]。研究表明,內(nèi)生菌普遍存在于各種陸生及水生植物中,而最早發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生放線菌是與非豆科植物共生固氮的弗蘭克氏屬(Frankia)放線菌[3-4]。2003年Strobel和Daisy[5]曾指出,用于分離內(nèi)生菌的植物宿主要有選擇性,應(yīng)選擇有重要植物學(xué)價值、處于不常見環(huán)境、有特殊生物學(xué)意義等的植物。目前對于植物內(nèi)生放線菌的研究,以紅樹林、熱帶常綠灌木林及一些藥用植物研究居多。

大葉藻(Zostera marina)是一種水生單子葉植物,是最常見的海草床種類之一,在太平洋和大西洋沿海均有廣泛分布[6]。我國的大葉藻主要分布于遼寧、河北和山東等沿海水域[7]。目前對于大葉藻的研究主要集中在其生態(tài)作用和生態(tài)修復(fù)等方面。相較于其他陸生高等植物,大葉藻因生長于海中,生長代謝機制獨特,其體內(nèi)可能蘊藏著獨特的共生微生物資源,目前有關(guān)這方面的研究報道較少。研究表明,自然環(huán)境中可在實驗室條件下被分離培養(yǎng)的稀有放線菌較少,所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等都不同[8-9]。本研究通過純培養(yǎng)法,使用多種培養(yǎng)基對榮成天鵝湖濕地大葉藻的內(nèi)生放線菌進行分離,以期獲得較多的菌株,豐富濱海植物內(nèi)生菌資源,為內(nèi)生放線菌資源的利用和天然產(chǎn)物的開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大葉藻樣品

大葉藻(Zostera marina)樣品采自山東省威海市榮成天鵝湖濕地(122°33′E,37°20′N)。將采集到的樣品進行表面清潔后裝入無菌封口袋中,并放在冷藏箱內(nèi)(4℃)帶回實驗室用于分離試驗。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基:采用2216E[10],HV[11],SCA[12],M2[13],ISP2[14],R2A[15]和RO七種培養(yǎng)基[16]。為抑制細菌和真菌的生長,本試驗需在培養(yǎng)基滅菌后加入抗生素(放線菌酮的終濃度為100 mg/m L,萘啶酸的終濃度為20 mg/m L),用0.22μm的濾膜過濾備用。

M1固體及液體培養(yǎng)基[10]用于待測菌的純化、培養(yǎng)與保藏。Mueller-Hinton肉湯(Mueller-Hinton Broth,MHB)和Mueller-Hinton瓊脂(Mueller-Hinton Agar,MHA)均購于青島海博生物技術(shù)有限公司,用于指示菌的培養(yǎng)與抗菌活性篩選。

1.1.3 指示菌

本試驗采用的指示菌包括:大腸埃希氏菌(Escherichia coli,簡稱Ec)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,簡稱Sa)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis,簡稱Bs)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,簡稱Pa)和白假絲酵母(Candida albicans,簡稱Ca),5種均來自中國科學(xué)院微生物研究所的中國普通微生物菌種保藏管理中心;副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,簡稱Vp)來自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;鰻弧菌(Vibrio anguillarum,簡稱Va)由中國科學(xué)院海洋研究所的鄒玉霞副研究員提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 大葉藻內(nèi)生放線菌的分離

將采集到的大葉藻樣品置于超凈工作臺中,為避免大葉藻表面附著的微生物和其他雜質(zhì)對試驗的干擾,需要對采集到的大葉藻樣品進行表面消毒:首先,在超凈工作臺中將大葉藻樣品用無菌海水沖洗3～5次;然后,將大葉藻置于滅過菌的平皿中,用次氯酸鈉溶液(有效氯5%)浸泡5 min,用無菌水清洗3次;用乙醇(V乙醇∶VH2O=3∶1)浸泡3 min[17],再用無菌水清洗3次,使用無菌濾紙吸干大葉藻樣品表面的水分;最后,取最后一遍清洗的無菌水100μL涂布于2216E培養(yǎng)基上,28℃恒溫培養(yǎng)14～21 d后如果無菌落長出,表明大葉藻葉片的表面消毒較徹底[18]。

用無菌的鑷子和剪刀將樣品剪成約2 mm×2 mm的小塊,在滅過菌的研缽中研磨成勻漿用于分離試驗。首先,將大葉藻勻漿置于55℃水浴鍋中加熱6 min,取0.5 m L勻漿加入到含有4.5 m L無菌海水的試管中,振蕩混勻;然后,進行梯度稀釋,用移液器從1∶1000、1∶10000和1∶100000的試管中分別取100 μL的溶液均勻涂布于7種固體分離培養(yǎng)基上,每種濃度在每種培養(yǎng)基上做3個平行;最后,放于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～30 d。

用接種環(huán)挑取形態(tài)不同的菌落進行多次平板劃線純化,同時進行菌落數(shù)量和種類的記錄,將純化后的放線菌保存到M1固體培養(yǎng)基斜面上,置于4℃冰箱保藏。同時用質(zhì)量分數(shù)15%的甘油進行菌種保藏,置于-80℃冰箱中。

1.2.2 抗菌活性篩選

采用紙片法[19-20],通過觀察待測放線菌的發(fā)酵產(chǎn)物粗提物對7種指示菌生長的抑制來篩選抗菌活性。用接種環(huán)將待測菌株接種于50 m L M1液體培養(yǎng)基中,在150 r/min,28℃的搖床條件下培養(yǎng)7～10 d。發(fā)酵結(jié)束后,在發(fā)酵液中加入等量的乙酸乙酯萃取3次。將有機相合并后,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸干,用DMSO溶解粗提物,配成25 mg/m L的溶液,置于4℃冰箱中保存,用于抗菌活性檢測。

將7種指示菌分別接種于MHB培養(yǎng)基中,28℃搖床中培養(yǎng)過夜。在直徑為6 mm的濾紙片上滴10μL粗提物溶液。將適量的指示菌在二次傳代培養(yǎng)后24 h內(nèi),用生理鹽水配制成麥氏濁度為0.5的菌懸液,并將該菌懸液各100μL涂布于MHA培養(yǎng)基平板上,放置3～5 min,讓表面多余的水分被瓊脂吸收,然后將濾紙片放在平板上。用等量的二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)作為陰性對照;用氯霉素(30μg)、慶大霉素(10μg)和制霉菌素(10μg)作為陽性對照,所有試驗需重復(fù)3次。然后將抗菌活性測試平板放在指示菌適宜的溫度下培養(yǎng)1～2 d。通過測定在紙片周圍產(chǎn)生的抑菌圈的直徑來反映其抗菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 大葉藻內(nèi)生放線菌的分離結(jié)果

從大葉藻中共分離出內(nèi)生放線菌62株。根據(jù)菌株在培養(yǎng)基上的菌落特征,比較了不同培養(yǎng)基的放線菌分離效果,結(jié)果見表1。其中,RO培養(yǎng)基分離出的放線菌的種類和數(shù)量最多,其次是ISP2培養(yǎng)基,M2培養(yǎng)基分離出的放線菌的種類和數(shù)量都是最少的。

表1 大葉藻內(nèi)生放線菌在7種培養(yǎng)基上的分離效果Table 1 Isolation result of endophytic actinomycetes associated with Zostera marina on seven kinds of media

2.2 抗菌活性篩選結(jié)果

本試驗采用紙片法,選取了7株指示菌,對62株大葉藻內(nèi)生放線菌的抗菌活性進行篩選。由圖1可見,大葉藻內(nèi)生放線菌對每種指示菌有抑制作用的菌株數(shù)?？咕囼灲Y(jié)果如表2和圖1所示,其中有48株放線菌至少對1種指示菌有抑制作用,占待測菌株的77.42%;有36株放線菌同時對2種及2種以上的指示菌有抑制作用,占待測菌株的58.06%;有16株放線菌同時對3種及3種以上指示菌有抑制作用,占待測菌株的25.80%;DYZ047同時對6種指示菌有抑制作用,其中DYZ047對大腸埃希氏菌E.coli、銅綠假單胞菌P.aeruginosa和副溶血性弧菌V.parahemolyticus的抗菌結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明,大葉藻內(nèi)生放線菌對多種指示菌都顯示出抗性。

圖1 大葉藻內(nèi)生放線菌抑制指示菌的菌株數(shù)Fig.1 Number of endophytic actinomycetes inhibiting indicator strains

列Va +只----+---++++++++-++--------++--++中表Vp++++++++mm。-------++++++++-++----------d≥12表Ca +---++++-------------------+”代++Pa -+--++++++--+++++++-----------marina＜12mm,“++++++Bs +++++++++++++++++++++++++++++-+-++++++++++-++++-10≤d表Sa ++++++++++++++++-+++++++++++++++”代++++++-+++++++++++++++++++++++++++++性Ec ++mm,“++--++++---++--------------活++菌++抗的號8≤d＜10表菌株線DYZ038 DYZ039 DYZ040 DYZ041 DYZ042 DYZ043 DYZ044 DYZ045 DYZ046 DYZ047 DYZ048 DYZ049 DYZ050 DYZ051 DYZ052 DYZ053 DYZ054 DYZ055 DYZ056 DYZ057 DYZ059 DYZ060 DYZ061 DYZ062放+”代Va菌-藻生----內(nèi)------------------++++2葉++Table2 Antimicrobialactivityofendophytic actinomycetesassociatedwith Zostera大6＜d＜8mm,“+表Vp +++++--++---+++++-++----++---++表Ca +,“+”代------++-----------------示表d用Pa 徑-----------------------++直圈菌抑Bs ++。------++-+---++----++++++--+++制抑有表Sa ++++++++++++++++++++++++++++++++-++++++++++++++++++++++++;“+”代據(jù)數(shù)的制株Ec抑-----------------+------有沒菌性活表菌號抗株DYZ001 DYZ002 DYZ004 DYZ005 DYZ009 DYZ011 DYZ013 DYZ015 DYZ017 DYZ019 DYZ022 DYZ023 DYZ024 DYZ027 DYZ028 DYZ029 DYZ030 DYZ031 DYZ032 DYZ033 DYZ034 DYZ035 DYZ036 DYZ037:“-”代有菌注具了出

圖2 菌株DYZ047的抗菌活性結(jié)果Fig.2 Antimicrobial activities of the isolated strain DYZ047

大葉藻內(nèi)生放線菌對革蘭氏陽性指示菌的抗菌效果明顯優(yōu)于革蘭氏陰性指示菌。對金黃色葡萄球菌S.aureus有抑制作用的放線菌有45株,占放線菌總數(shù)的72.58%;12株菌的抑制作用較強,抑制圈直徑在12.0 mm以上,其中DYZ019的抑菌圈直徑最大達到15.8 mm。對枯草芽孢桿菌B.subtilis有抑制作用的放線菌有28株,占放線菌總數(shù)的45.16%;3株菌的抑制作用很強,抑制圈直徑超過12.0 mm,其中DYZ047抑制作用最強,抑菌圈達到20.7 mm。

大葉藻內(nèi)生放線菌對革蘭氏陰性指示菌和真菌的抗菌活性菌株相對較少。對白假絲酵母C.albicans有抑制作用的放線菌有3株,占放線菌總數(shù)的4.84%。對大腸埃希氏菌E.coli有抑制作用的放線菌有6株,占放線菌總數(shù)的9.68%。對銅綠假單胞菌P.aeruginosa有抑制作用的有9株,占放線菌總數(shù)的14.52%。對鰻弧菌V.anguillarum有抑制作用的放線菌有7株,占放線菌總數(shù)的11.29%。其中,有3株菌(DYZ013,DYZ047和DYZ049)的抑制作用較強,抑制圈直徑在12.0 mm以上,DYZ047抑制作用最強,抑菌圈達到20.1 mm。對副溶血性弧菌V.parahemolyticus有抑制作用的放線菌有17株,占放線菌總數(shù)的27.42%;其中,有3株菌(DYZ037,DYZ046和DYZ047)的抑制作用較強,抑制圈直徑在12.0 mm以上,DYZ047的抑菌圈直徑為18.0 mm,DYZ037的抑菌圈最大為18.6 mm。

3 討 論

在純培養(yǎng)法中培養(yǎng)基的選擇對放線菌的分離結(jié)果有很大影響,放線菌適合在干燥、堿性的條件下生長[21]。RO培養(yǎng)基中微量元素豐富,有利于放線菌的生長,取得較好的分離效果。ISP2培養(yǎng)基含有放線菌偏愛的糖成分(麥芽糖),分離到的大葉藻內(nèi)生放線菌總數(shù)和種類數(shù)也較好。由于實驗室培養(yǎng)放線菌時無法完全模擬自然環(huán)境,放線菌可能會迫于環(huán)境壓力發(fā)生生理上的變化,處于休眠狀態(tài),稱為活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(Viable But Non-Culturable State,VBNC),采用常規(guī)的培養(yǎng)方法無法使其恢復(fù)生長活性[22]。由于分離條件等的限制,目前得到的大葉藻中內(nèi)生放線菌的種類和數(shù)量可能還遠遠不夠,以后可以進一步通過與免培養(yǎng)相結(jié)合的方法研究其多樣性[23]。

本試驗所選用的兩株革蘭氏陽性指示菌,分別為金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。分離出的大葉藻內(nèi)生放線菌對這兩株革蘭氏陽性指示菌的抑制作用較強。李靜等[24]對從海南東寨港真紅樹植物中分離到46株內(nèi)生放線菌,使用乙酸乙酯提取發(fā)酵液進行抗菌活性篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)40株菌對革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出較好的抑制作用。林嬋春等[25]對分離自川芎的30株內(nèi)生放線菌進行抗菌活性篩選,對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出抑制活性的有25株菌,占其待測總數(shù)的83.33%,對枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出抑制活性的有23株,占其待測總數(shù)的76.67%。本試驗中大葉藻內(nèi)生放線菌對革蘭氏陰性指示菌的抑制作用較弱。這可能是由于革蘭氏陰性細菌具有外膜屏障和多藥外排泵,通常比革蘭氏陽性細菌更耐抗生素[26]。革蘭氏陰性細菌的外膜對大的帶電分子不滲透,限制了各種抗生素類藥物進入細胞內(nèi)[27]。多藥外排泵是膜定位的轉(zhuǎn)運蛋白,能夠?qū)⒍喾N化合物(包括藥物分子)轉(zhuǎn)運出細胞,從而阻止藥物進入靶細胞[28]。

4 結(jié) 語

本研究采用純培養(yǎng)方法從山東省威海市的榮成天鵝湖采集的大葉藻中分離內(nèi)生放線菌,并對放線菌的抗菌活性進行篩選。結(jié)果表明,從大葉藻中共分離到內(nèi)生放線菌62株,內(nèi)生放線菌資源較為豐富;對多種指示菌都表現(xiàn)出較好的抗性,有48株放線菌(占77.42%)至少對1種指示菌表現(xiàn)出一定的抑制作用,有36株放線菌(占58.06%)抑制2種及2種以上指示菌,發(fā)現(xiàn)了一批具有較好抗菌活性的菌株,DYZ047同時對6株指示菌有抑制作用;對革蘭氏陽性指示菌的抗菌效果明顯優(yōu)于革蘭氏陰性指示菌,有45株放線菌(占72.58%)對金黃色葡萄球菌有抑制作用,有28株放線菌(45.16%)對枯草芽孢桿菌有抑制作用。后期可以繼續(xù)進行抗菌活性化合物的分離,為海洋來源抗生素的研究提供新資源。