余志輝

幽門螺桿菌是一種定植胃內(nèi)的革蘭陰性致病菌，為引起消化性潰瘍和慢性胃炎的主要原因，因此被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為胃癌的一類主要病原菌[1]。感染幽門螺桿菌應(yīng)使用抗生素根除治療，否則感染可持續(xù)終身，因此有效地根除幽門螺桿菌感染具有重要的臨床意義。目前治療幽門螺桿菌的方法也不斷發(fā)生變化，從早期標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法到目前的四聯(lián)療法、序貫療法、伴同療法和混合療法，然而隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，幽門螺旋桿菌對抗生素的耐藥性不斷提高，尤其是對克拉霉素的耐藥性，我國幽門螺旋桿菌對克拉霉素的耐藥性高達(dá)20%，幽門螺旋桿菌對抗生素耐藥性已成為根除其最大的困難之一[2]。降低藥物對抗生素的耐藥性首先必須明確其耐藥發(fā)生的機(jī)制。研究表明，細(xì)菌對克拉霉素耐性的一種重要機(jī)制為細(xì)菌23S rRNA中A2142G/A2143G的堿基突變，藥物的作用靶點(diǎn)發(fā)生變化，細(xì)菌對克拉霉素產(chǎn)生耐藥[3]。前期研究報道認(rèn)為，革蘭陰性耐藥產(chǎn)生的機(jī)制與外排泵家族關(guān)系極為密切，其中Acr AB-Tol C被認(rèn)為是許多細(xì)菌產(chǎn)生耐藥特有機(jī)制之一[4]。研究報道，幽門螺旋桿菌中存在三種編Acr AB-Tol C外排泵的同源基因?yàn)閔ef A、hef D和hef G[5]。本研究分析幽門螺桿菌Acr AB-Tol C外排泵相關(guān)基因hefA/D/G對克拉霉素的耐藥性。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料來源 選取2018年3月-2019年12月因消化不良于佛山市第五人民醫(yī)院就診的患者303例，經(jīng)過13C檢測確認(rèn)為幽門螺旋桿菌感染100例，行胃鏡檢查，男64例，女36例；年齡20～86(53.8±7.9)歲，排除實(shí)質(zhì)性病變、胃腫瘤、胃炎及胃潰瘍等器質(zhì)性病變的患者，胃鏡取組織活檢。幽門螺旋桿菌對克拉霉素耐藥性采用RT-PCR檢測Hp23s rRNA基因V區(qū)A2142G和A2143G突變和克拉霉素藥敏實(shí)驗(yàn)確診是否耐藥[6]，然后將100例患者依據(jù)是否耐藥分為克拉霉素敏感組和克拉霉素耐藥組。收集完畢樣本后分析hef A、hef D和hef G mRNA表達(dá)差異。

1.2 試劑與儀器 TakaRa Prime ScriptTMreagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ、RNAiso Reagent Kit均購于大連寶生物公司，三氯甲烷、異丙醇等有機(jī)溶劑均采用分析純試劑，7300 PCR儀購于ABI公司。

1.3 核酸提取 患者行胃鏡檢查取組織后進(jìn)行RNA總提取?？俁NA提?。喝〕鼋M織后無酶PBS漂洗組織2次，用液氮研磨組織，待組織研磨成粉末狀時，加入RNAiso Reagent Kit 1 ml至研磨后的組織中冰上靜置10 min。收集裂解液加入1/5體積三氯甲烷混勻，13 000 rpm 4 ℃離心10 min。吸取上清液加入等體積的異丙醇，13 000 rpm 4 ℃離心10 min保留沉淀。使用75%乙醇漂洗，13 000 rpm 4 ℃離心10 min，棄上清后-80 ℃保存。

1.4 RT-real time PCR RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA：使用TakaRa Prime ScriptTMreagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的混合體系：Prime ScriptTMRT Enzyme MixⅠ 1.0 μl，Random 6 Primer (100 μM) 1.0 μl，Oligo dT Primer (50 μM) 1.0 μl，5×Prime ScriptTMBuffer 4 μl，20 μl的反應(yīng)體系中去總RNA為1 000 ng，補(bǔ)RNase Free水至20 μl。反應(yīng)條件：37 ℃ PCR中反應(yīng)15 min，85 ℃ 5 s滅活反應(yīng)體系，獲得反應(yīng)產(chǎn)物-20 ℃保存。PCR擴(kuò)增檢測所需要引物，依據(jù)本次實(shí)驗(yàn)的要求在genbank下載目的序列的mRNA，設(shè)計合成目的引物序列。hef A：Forward5′-CAGCTGGCGCTTATTTGGATAG-3′and Reverse5′-TTCCGCTTGGAGTTGTTGGGTG-3′；hef D：Forward5′-GCAGCACGCCTAGCCAATATCAA-3′and Reverse5′-ATTCCAAAGTTCGCTTCTC

GTTG-3′；hef G：Forward5′-GCAGCTTTATGATGCCTGAAATGC-3′and Reverse5′- GGAATTCCATTAAATTGGGCGAACTG-3′；16S rRNA：Forward5′-ACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′Reverse5′-GTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。Real time-PCR檢測：按照Applied Biosystems公司7300 PCR儀器操作說明和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2×)試劑盒的說明嚴(yán)格進(jìn)行操作，此次PCR的反應(yīng)體系為20 μl，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，退火31 s，40個循環(huán)。 Real-time RT-PCR數(shù)據(jù)分析處理采用2-△△Ct處理數(shù)據(jù)[7]。

2 結(jié) 果

2.1 幽門螺旋桿菌感染率 消化不良患者303例中，幽門螺旋桿菌檢測陽性100例(33.00%)。男女幽門螺旋桿菌感染率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.090，P=0.296)。見表1。

表1 幽門螺旋桿菌感染結(jié)果

2.2 幽門螺旋桿菌耐藥性檢測 100例幽門螺旋桿菌患者中，總耐藥率為39.00%。男女耐藥率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.045，P=0.833)。見表2。

表2 幽門螺旋桿菌耐藥性檢測分析結(jié)果

2.3 hefA/D/G mRNA PCR分析結(jié)果 克拉霉素耐藥組hef A、hef D、hef G mRNA表達(dá)水平高于卡拉霉素敏感組(P<0.01)。見表3。

表3 hefA/D/G mRNA PCR分析結(jié)果

3 討 論

幽門螺旋桿菌是一類胃內(nèi)的革蘭陰性致病菌，徹底清除幽門螺旋桿菌對胃部的健康和保護(hù)至關(guān)重要。幽門螺旋桿菌感染多發(fā)生在兒童時期，并且不能通過自身的免疫力自我清除。流行病學(xué)調(diào)查顯示，幽門螺旋桿菌的感染與經(jīng)濟(jì)的發(fā)展程度及人們的生活習(xí)慣密切相關(guān)，感染率存在地區(qū)差異[8]。幽門螺旋桿菌感染后容易引起消化性潰瘍、萎縮性胃炎、胃癌等相關(guān)胃實(shí)質(zhì)性病變[9]。幽門螺旋桿菌感染患者必須及時治療，但目前隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌對抗生素的耐藥性不斷提高，尤其是幽門螺旋桿菌對克拉霉素的耐藥性不斷提高，因此成為目前治療幽門螺旋桿菌的一大難題[5]。目前治療幽門螺旋桿菌的一線藥物為枸櫞酸鉍鉀、雷貝拉唑、阿莫西林及克拉霉素[10]，對克拉霉素耐藥的患者需使用呋喃唑酮代替克拉霉素治療?？死顾貫榇蟓h(huán)內(nèi)酯類抗生素，作用于幽門螺旋桿菌的23S核糖體抑制肽基酰基轉(zhuǎn)移酶，抑制mRNA的合成，從而達(dá)到抑制細(xì)菌蛋白的合成，引起核糖體的構(gòu)象發(fā)生變化，最終導(dǎo)致克拉霉素對其抑制的減弱[7]。研究顯示，外排泵將藥物排出體外是細(xì)菌的重要耐藥機(jī)制之一，其中Acr AB-Tol C外排泵是革蘭陰性細(xì)菌產(chǎn)生多種耐藥最主要的機(jī)制之一[4]。研究表明，幽門螺旋桿菌含有編碼Acr AB-Tol C外排泵系統(tǒng)相關(guān)基因，其中hef ABC、hef DEF 和hef GHI成為組成型的表達(dá)，hef A、hef D、hef G編碼外膜通道蛋白依次扮演不同的功能[6]。本文研究表明hef A、hef D、hef G基因在克拉霉素耐藥患者的中表達(dá)水平顯著升高。

幽門螺旋桿菌感染后引起一系列的胃實(shí)質(zhì)性的病變，然而我國幽門螺旋桿菌的感染率相對較高，因地區(qū)不同存在一定的差異，本文結(jié)果顯示，幽門螺旋桿菌感染率為33.00%，其中感染患者無性別差異。目前根除幽門螺旋桿菌主要通過抗生素聯(lián)合治療，治療過程容易產(chǎn)生耐藥，尤其是對克拉霉素產(chǎn)生的耐藥性，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國克拉霉素的耐藥性為20%～40%。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總耐藥率為39.00%，與文獻(xiàn)的報道數(shù)據(jù)基本一致。目前，幽門螺旋桿菌的耐藥機(jī)制是否與其組成型hef A、hef D、hef G的表達(dá)有關(guān)仍有爭議，本文通過RT-real-time檢測幽門螺旋桿菌感染100例，對克拉霉素耐藥39例，對克拉霉素敏感61例，結(jié)果顯示，幽門螺旋桿菌對克拉霉素耐藥組hef A、hef D、hef G的mRNA表達(dá)水平顯著高于克拉霉素敏感組，結(jié)果表明，幽門螺旋桿菌耐藥性菌的細(xì)胞內(nèi)外排泵的同源基因hef A、hef D、hef G表達(dá)水平升高，其表達(dá)升高加速了藥物的外排，導(dǎo)致體內(nèi)藥物濃度降低，進(jìn)而影響克拉霉素對幽門螺旋桿菌的抑制作用。

綜上所述，幽門螺旋桿菌對克拉霉素的耐藥已成為根除其主要的困難之一，必須明確其耐藥發(fā)生的機(jī)制，然后進(jìn)行有效的治療，以提高根除效率，預(yù)防胃實(shí)質(zhì)性的病變。本研究結(jié)論表明，幽門螺旋桿菌耐藥患者中外排泵的同源基因hef A、hef D、hef G表達(dá)水平升高，幽門螺旋桿菌對克拉霉素的耐藥性與其細(xì)胞內(nèi)外排泵關(guān)系極其密切，可能成為幽門螺旋桿菌耐克拉霉素發(fā)生機(jī)制之一。