脫落酸對棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響

劉佩佩，魏喜，陳艷麗，王曄，張桂寅，李付廣*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)/ 棉花生物學(xué)國家重點實驗室河北基地，河北 保定071001；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南 安陽455000）

棉花作為纖維和油料作物，集軍需、民用于一體，是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一[1]。傳統(tǒng)育種技術(shù)存在優(yōu)勢品種篩選效率低、性狀改良方向不可控和品種培育周期長等不足之處，轉(zhuǎn)基因遺傳育種成為棉花品種改良的重要工具。 棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生是棉花轉(zhuǎn)基因育種的主要途徑之一， 受基因型、外植體、植物生長調(diào)節(jié)劑、培養(yǎng)基組分等多種因素影響[2]。 棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系依然存在褐化、畸形、遺傳轉(zhuǎn)化率低等問題，因此，建立穩(wěn)定高效的棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系十分重要。

植物激素的合理使用是植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)展中的一個里程碑，絕大多數(shù)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中都需要添加一種或多種激素來促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生獲得再生植株，外源激素的濃度和類型對細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)變至關(guān)重要[3]。 目前研究最成功的是細(xì)胞分裂素和生長素，已廣泛應(yīng)用于多種植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系中[4]。 脫落酸作為五大激素之一，主要功能集中在植物細(xì)胞形態(tài)建成、種子休眠與萌發(fā)、逆境脅迫應(yīng)答方面，同時在體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)和調(diào)控中也發(fā)揮重要作用。 Ge 等研究發(fā)現(xiàn)，棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中，低于0.04 μmol·L－1ABA（Abscisic acid, 脫落酸） 能促進(jìn)棉花球形胚生長， 高于0.2 μmol·L－1時抑制球形胚發(fā)育，0.04 μmol·L－1ABA 能顯著增加正常子葉胚的數(shù)量， 外源ABA 處理誘導(dǎo)LEC1、LEC2、FUS3 和WUSCHEL 基 因 的 表 達(dá)，這些基因的表達(dá)調(diào)節(jié)ABA 和赤霉素的動態(tài)平衡促進(jìn)棉花體細(xì)胞胚的產(chǎn)生及成熟[5]。 擬南芥體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中， 外源添加10 nmol·L－1ABA對擬南芥初級體細(xì)胞胚發(fā)生基本無影響，而100 nmol·L－1ABA 則明顯抑制擬南芥初級和次級體細(xì)胞胚的產(chǎn)生； 外源添加10 nmol·L－1氟利酮（內(nèi)源ABA 合成抑制劑）顯著降低擬南芥體細(xì)胞胚再生率，1 μmol·L－1氟利酮則使愈傷組織褐化并完全抑制體細(xì)胞胚再生；ABA 通過介導(dǎo)生長素生物合成和極性運(yùn)輸，在愈傷組織中建立生長素應(yīng)答模式，從而在體細(xì)胞胚發(fā)生啟動過程中起作用[6]。 以火炬松合子胚為外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚產(chǎn)生， 外源添加3.7 μmol·L－1ABA 顯著提高體細(xì)胞胚的起始分化率， 并促進(jìn)胚性組織生成[7]。ABA 預(yù)處理水稻愈傷組織，在合適的劑量范圍內(nèi)ABA 能影響愈傷組織結(jié)構(gòu)，縮短愈傷組織生成再生芽的時間，提高后期植株再生率[8]。棗椰樹離體懸浮培養(yǎng)中， 外源添加ABA 能增加糖和蛋白質(zhì)的積累，提高體細(xì)胞胚的產(chǎn)量和成熟度[9]。胡蘿卜胚狀體發(fā)育期， 胚性細(xì)胞內(nèi)源ABA 含量在10 d時達(dá)到最大值，13 d 時降至低水平； 非胚性細(xì)胞在13 d 時達(dá)到最大值，17 d 時降低到低水平，說明ABA 在胚性細(xì)胞和非胚性細(xì)胞的發(fā)育中均具有重要作用； 但胚性細(xì)胞內(nèi)ABA 積累快于非胚性細(xì)胞， 胚性細(xì)胞中快速積累的ABA 保證了胚性細(xì)胞的生長活力高于非胚性細(xì)胞[10]。

體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程十分復(fù)雜，涉及到差異基因表達(dá)、激活或抑制多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[11]。從體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)轶w細(xì)胞胚的過程中，有一些基因發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，這些基因我們稱之為標(biāo)記基因。與野生型相比，擬南芥lbd16-2 突變體在愈傷組織形成中有749 個基因表達(dá)水平顯著降低，且lbd16 突變體有顯著的芽再生缺陷， 試驗結(jié)果證明LBD16 通過促進(jìn)細(xì)胞分裂及細(xì)胞多能性的獲得促進(jìn)愈傷的形成[12]。 愈傷轉(zhuǎn)變成胚性愈傷的過程中，一些標(biāo)記基因BBM、AGL15、LEC1、FUS3、ABI3 等有重要的調(diào)控作用。 BBM 基因?qū)儆贏P2/ERF 家族，與分生組織中細(xì)胞發(fā)育及細(xì)胞增殖有關(guān)，BBM 異位表達(dá)能影響植物激素合成、增加細(xì)胞對激素的敏感性從而促進(jìn)體細(xì)胞向胚性細(xì)胞的轉(zhuǎn)變[13]。 BBM 通過調(diào)控LEC1、FUS3 和ABI3 的表達(dá)誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生[14]。 AGL15 屬于MADS 轉(zhuǎn)錄因子家族， 能夠促進(jìn)擬南芥和大豆的體細(xì)胞胚胎發(fā)生[15]。棉花中過表達(dá)GhAGL15促進(jìn)棉花胚性愈傷的形成[16]。 LEC1 能誘導(dǎo)體細(xì)胞向胚性細(xì)胞的轉(zhuǎn)變， 擬南芥lec1 突變體對ABA 敏感性降低， 異位表達(dá)導(dǎo)致畸形胚產(chǎn)生[17]。具有高分化率的CIR24 棉花品種中GhLEC1 和GhFUS3 的表達(dá)量顯著高于低分化率的棉花品種中兩個基因的表達(dá)量， 證明LEC1 和FUS3 基因參與棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的調(diào)控[18]。 體細(xì)胞胚發(fā)育過程中會伴隨著特異蛋白的積累，例如晚期胚胎發(fā)生富集蛋白LEA， 研究表明LEA 基因的表達(dá)是受脫落酸誘導(dǎo)的，外源添加脫落酸處理后會顯著增加LEA 的表達(dá)水平[19]。 FUS3 和ABI3 通過介導(dǎo)赤霉素和脫落酸的動態(tài)平衡影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生[20]，非胚性愈傷組織向胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)變過程中伴隨著內(nèi)源ABA 含量的快速升高，而ABI3 的高表達(dá)參與ABA 的快速合成?；谏鲜鼋Y(jié)果，推測棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生中，ABA 可能通過影響相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控棉花愈傷組織脫分化和胚性愈傷組織分化。

目前，多數(shù)研究集中在對體細(xì)胞胚胎發(fā)生后期胚胎形成過程的調(diào)控，愈傷組織脫分化和再分化分子機(jī)制仍不明確[21]。 本研究通過外源添加ABA， 研究ABA 對棉花愈傷組織脫分化和胚性愈傷組織分化的影響，為深入研究激素對植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響、棉花愈傷組織脫分化和再分化分子機(jī)制，以及優(yōu)化棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以易分化的陸地棉品種中棉所24 無菌苗下胚軸為外植體材料，棉花種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所轉(zhuǎn)基因研究與應(yīng)用實驗室提供。 濃硫酸脫絨后挑選成熟飽滿的棉花種子，用3%（體積分?jǐn)?shù)）的雙氧水避光浸泡消毒10 h，滅菌蒸餾水沖洗4 次，接種于無菌苗培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)5 d，光培養(yǎng)1 d。 在超凈工作臺中取棉花下胚軸切成5～7 mm切段，置于MSB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 棉花無菌苗和下胚軸均置于恒溫（28±2）℃恒濕培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

棉花無菌苗培養(yǎng)基成分：大量元素MSⅠ[31]50 mL·L－1，蔗糖28 g·L－1，瓊脂粉5.5 g·L－1，純凈水溶解。 培養(yǎng)基使用高壓滅菌鍋121 ℃滅菌14 min 后冷卻備用。 MSB 培養(yǎng)基[31]成分：大量元素MSⅠ50 mL·L－1， 微量元素MSⅡ5 mL·L－1，B5維生素5 mL·L－1， 鐵鹽5 ml·L－1葡萄糖28 g·L－1，瓊脂粉5.5 g·L－1，純凈水溶解，pH 調(diào)至6.0。 培養(yǎng)基使用高壓滅菌鍋121 ℃滅菌14 min，待培養(yǎng)基降溫至45～50 ℃時按濃度需求添加過濾除菌后的ABA 溶液。

1.2 試驗設(shè)計

設(shè)置0、0.02、0.04、0.06、0.08 μmol·L－1ABA（分別用A0、A1、A2、A3、A4 表示）， 分別添加至MSB 培養(yǎng)基，以A0 為空白對照。 無菌條件下將下胚軸切段以每瓶6 段的數(shù)量均勻放置在培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)室同一區(qū)域培養(yǎng)，觀察棉花下胚軸脫分化和再分化過程。 下胚軸接種至含ABA的MSB 培養(yǎng)基當(dāng)天記為0 d，30 d 時繼代1 次至相同培養(yǎng)基， 文中培養(yǎng)時間均為下胚軸培養(yǎng)時間。 每種濃度處理120 段下胚軸切段，以60 段為1 組，分為2 組重復(fù)。

1.3 形態(tài)觀察

采用石蠟切片法觀察下胚軸初始細(xì)胞脫分化。 下胚軸培養(yǎng)5 d 時取樣制成縱切切片， 使用Olympus 熒光顯微鏡觀察。 組織培養(yǎng)過程中，愈傷組織生長狀態(tài)均使用體式顯微鏡觀察[22]。

下胚軸培養(yǎng)20 d 時，將愈傷組織按以下標(biāo)準(zhǔn)分為3 種類型：大型（Large，L），切段兩端均生成愈傷組織，含水量高，有少量霜狀的愈傷細(xì)胞團(tuán)存在；中型（Medium，M），切段一端生成愈傷組織，一端有少量愈傷組織或霜狀組織，總體生長速度緩慢；小型（Small，S）型，切段兩端均無愈傷組織生成，只有少量致密、霜狀組織，下胚軸基本為未分化狀態(tài)。

1.4 愈傷和胚性愈傷（脫）分化率、增殖率統(tǒng)計

愈傷脫分化率 （Callus dedifferentiation rate，CDR）， 即已脫分化形成愈傷組織的外植體數(shù)量與初始外植體總數(shù)的比值。愈傷增殖率[23]（Callus proliferation rate，CPR）， 即培養(yǎng)一定時間后形成愈傷組織的外植體增加的重量與初始外植體鮮重的比值。 胚性愈傷分化率（Embryogenic callus differentiation rate，ECDR），即繼代培養(yǎng)一定時間后分化形成胚性愈傷組織的愈傷組織塊數(shù)量與繼代愈傷組織塊數(shù)量的比值。 胚性愈傷組織增殖率（Embryogenic callus proliferation rate，ECPR），即繼代培養(yǎng)一定時間后形成胚性愈傷組織的外植體增加的重量與初始外植體鮮重的比值。 非胚性愈傷組織增殖率 （Non-embryogenic callus proliferation rate，N-ECPR），即繼代培養(yǎng)一定時間后為非胚性愈傷組織的外植體增加的重量與初始外植體鮮重的比值。

1.5 基因表達(dá)分析

通過熒光定量PCR (Quantitative real-timepolymerase chain reaction,qRT-PCR) 分析LBD16（Gh_A11G1186）、LBD29 （Gh_D11G1344）、BBM（Gh_A08G2008）、LEC1（Gh_D05G1686）、AGL15（Gh_D08G162500）、FUS3 （Gh_A07G2123）、LEA（Gh_A10G1465）、ABI3（Gh_A07G2239）基 因 表達(dá)變化。反轉(zhuǎn)錄使用TaKaRa 公司的RT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒，Real-time PCR 使 用 SYBR Premix Ex Taq(DRR041A) 熒光定量試劑盒， 引物序列見表1，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序均參考試劑盒說明書。 內(nèi)參基因為GhHistone3，每個反應(yīng)設(shè)置3 次重復(fù)。

表1 本研究中使用的引物Table1 Primers used in this study

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)使用DPS 軟件進(jìn)行處理與分析，以最小顯著差數(shù)法（The least significant difference，LSD）進(jìn)行顯著性檢驗。 基因表達(dá)量使用2－△△Ct方法計算， 采用t 檢驗法進(jìn)行顯著性檢驗。試驗作圖使用GraphPad Prism 5 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源添加ABA 促進(jìn)下胚軸初始細(xì)胞脫分化

以MSB 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 設(shè)置梯度濃度脫落酸， 研究脫落酸對下胚軸初始細(xì)胞脫分化的影響。 無菌苗生長過程主要為黑暗處理，棉花下胚軸呈現(xiàn)為白色，培養(yǎng)至5 d 時，外植體整體轉(zhuǎn)為綠色， 體式顯微鏡下可觀察到切段兩端輕微膨起，在切段傷口處生成少量愈傷組織（圖1A）。 通過石蠟切片可觀察到初生形成層細(xì)胞快速分裂，愈傷組織細(xì)胞團(tuán)由內(nèi)向外涌出，A1、A2、A3、A4 處理下愈傷組織量均大于A0 處理，且ABA 濃度越高愈傷組織量越大（圖1A）。取5 d 時下胚軸提取RNA， 對GhLBD16 和GhLBD29 進(jìn)行qRT-PCR定量分析，結(jié)果顯示，A1、A2、A3、A4 處理下兩個基因表達(dá)量均極顯著高于A0 處理（圖1B）。綜合該試驗結(jié)果可以認(rèn)為，棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生中外源ABA 通過顯著上調(diào)GhLBD16 和GhLBD29的表達(dá)量促進(jìn)下胚軸初始細(xì)胞脫分化。

2.2 外源添加ABA 促進(jìn)棉花愈傷組織脫分化

圖1 ABA 對下胚軸初始細(xì)胞脫分化的影響Fig. 1 Effect of ABA on dedifferentiation of initial cellular in hypocotyl

培養(yǎng)下胚軸時，脫落酸顯著促進(jìn)愈傷組織脫分化。 培養(yǎng)20 d 時的愈傷組織按形態(tài)分為L、M、S 共3 種類型（圖2A）。 由圖2B 可以看出，A0 愈傷分化集中于速度較慢的M 型，A1、A2、A3、A4處理下則是集中于快速分化的L 型。 統(tǒng)計L、M、S 型愈傷組織所占比例（圖2B），發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加ABA 顯著增加L 型愈傷比例，降低M 和S 型愈傷比例。以L 型愈傷為標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計愈傷脫分化率（圖2C），20 d 時，A0 處理CDR 為15.1%左右；與A0 相比，A1、A2、A3、A4 處理下CDR 為71.6%～84.3%，ABA 顯著促進(jìn)愈傷脫分化。A4 處理CDR顯著高于A1、A2；A4 和A3 處理CDR 無顯著差異，表明ABA 濃度越高促進(jìn)效果越明顯。結(jié)果表明， 外源添加脫落酸顯著促進(jìn)愈傷組織脫分化，顯著提高愈傷組織脫分化率， 且高濃度ABA（A4）較低濃度ABA（A1、A2）對愈傷脫分化的促進(jìn)效果更顯著。

2.3 外源添加ABA 促進(jìn)愈傷組織增殖

各組處理下， 培養(yǎng)至10 d、20 d 時愈傷組織顏色、質(zhì)地等無顯著差異（圖3A）。 培養(yǎng)至30 d時，A0、A1、A2 處理下愈傷組織為綠色，A3 和A4處理下愈傷組織為較深的黃綠色，質(zhì)地?zé)o明顯差異（圖3A）。 20 d 和30 d 時A1、A2、A3、A4 處理下愈傷體積明顯大于A0 處理， 愈傷組織增殖率可以反映出愈傷組織生長速度，稱量20 d 和30 d時L 型愈傷組織鮮重，計算CPR（圖3B）。20 d 時A0 處 理 的CPR 為3.8，A1、A2、A3、A4 處 理 的CPR 較A0 分別提高2.4、2.4、3.2、2.5， 顯著高于A0 處理。 30 d 時A0 處理的CPR 為10.2，A1、A2、A3、A4 處理的CPR 較A0 分別提高5.9、4.7、4.3、2.9，顯著高于A0 處理。 A1、A2、A3、A4 處理在20 d 時無顯著差異，30 d 時A1 處理的CPR 顯著高于A4 處理的CPR， 表明低濃度ABA 對愈傷增殖更有利（圖3B）。研究結(jié)果證明外源ABA 顯著促進(jìn)愈傷組織增殖，0.02～0.06 μmol·L－1ABA 促進(jìn)愈傷組織增殖的效果優(yōu)于0.08 μmol·L－1ABA。

圖2 ABA 對愈傷組織脫分化的影響Fig. 2 The effect of ABA on dedifferentiation of callus

圖3 ABA 對愈傷組織增殖的影響Fig. 3 The effect of ABA on proliferation of callus

2.4 外源ABA 對胚性愈傷組織分化和增殖的影響

試驗證明，淡黃色、松散、米粒狀胚性愈傷組織更容易在后期誘導(dǎo)培養(yǎng)中分化形成體細(xì)胞胚。培養(yǎng)55 d 時， 各處理下胚性愈傷組織在形態(tài)、顏色（圖4A）和分化率（圖4B）差異明顯。A0 處理下胚性愈傷組織呈淡黃色、質(zhì)地疏松、米粒狀，愈傷組織顏色偏綠；A1、A2 處理下胚性愈傷組織同樣質(zhì)地疏松、呈淡黃色米粒狀，但愈傷組織為淡黃色；A3、A4 處理下胚性愈傷組織整體呈稀軟、灰白色顆粒，基礎(chǔ)愈傷組織塊小且顏色偏黑。 培養(yǎng)35 d、45 d、55 d 時胚性愈傷分化率統(tǒng)計結(jié)果顯示，35 d 時A0 處理的ECDR 為7%，A1 處理顯著高于A0 為19%，A2、A3 處理與A0 相比無顯著差異，A4 處理顯著低于A0 為3%；45 d 時A0處理ECDR 為28%，A1 處理為39%， 顯著高于A0，A2、A3、A4 處理顯著低于A0；55 d 時A0 處理為42%，A1 處理為43%， 與A0 相比無顯著差異，A2、A3、A4 處理顯著低于A0。 45 d 時統(tǒng)計胚性愈傷增殖率（ECPR），A0 處理為23.0，A1、A2、A3、A4 處理的ECPR 均顯著高于A0， 其中最低是A2 處理，為28.2，最高是A1 處理，為36.5（圖4C）。 結(jié)果表明，在愈傷分化階段和胚性愈傷分化階段持續(xù)添加外源ABA， 雖然0.02～0.08 μmol·L－1ABA 都促進(jìn)胚性愈傷增殖，但低濃度（0.02 μmol·L－1）ABA 促進(jìn)胚性愈傷分化，而高濃度（0.04～0.08 μmol·L－1）ABA 抑制胚性愈傷分化。

圖4 ABA 對胚性愈傷組織的影響Fig. 4 The effect of ABA on embryonic callus

2.5 外源ABA 對非胚性愈傷組織的影響

外源ABA 處理對非胚性愈傷組織的顏色、質(zhì)地、增殖率也產(chǎn)生了顯著影響。 如圖5A，培養(yǎng)45 d 時，A0 處理非胚性愈傷組織顏色偏綠、結(jié)構(gòu)致密、質(zhì)地較硬、少量霜狀組織，A1 和A2 處理下非胚性愈傷為淡黃色、結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較軟、少量霜狀組織，A2 處理顏色較A1 處理偏黃、A3 和A4 處理非胚性愈傷為褐色發(fā)黑，稀泥狀、含水量較高， 隨ABA 濃度升高非胚性愈傷組織顏色由黃綠色向黑色加深。與A1 相比，A2、A3、A4 處理造成的逆境脅迫大， 非胚性愈傷組織質(zhì)地變差。統(tǒng)計45 d 時N-ECPR，A0 為26.1， 與A0 相比，A1、A2、A3、A4 處 理 的N-ECPR 提 高7.9～13.9（圖F）， 均顯著高于A0 處理。 外源添加低濃度（0.02 μmol·L－1）ABA 顯著促進(jìn)非胚性愈傷組織的增殖，改善非胚性愈傷組織生長狀態(tài)，高濃度ABA 則抑制非胚性愈傷分化， 進(jìn)一步證明ABA對愈傷組織分化有重要作用。

圖5 ABA 對非胚性愈傷組織的影響Fig. 5 ABA effect on non-embryogenic callus

2.6 愈傷組織脫分化階段體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)標(biāo)記基因表達(dá)分析

外源ABA 處理棉花下胚軸對愈傷脫分化和再分化有顯著影響，推測脫落酸可能通過調(diào)控體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)來促進(jìn)或抑制愈傷組織的脫分化和胚性愈傷組織的分化。 在愈傷組織誘導(dǎo)階段和胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段，A1 處理對下胚軸的綜合影響效果最優(yōu)，因此，本研究針對A0 和A1 處理對一些體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)的標(biāo)記基因進(jìn)行定量分析。 A0、A1 處理下培養(yǎng)15 d、20 d 和30 d 的下胚軸分別取樣對AGL15、LEC1、BBM、FUS3、LEA、ABI3 進(jìn)行熒光定量分析。15 d 和20 d 時，與A0 相比A1 處理均顯著提高BBM 表達(dá)量，但20 d 時差異更顯著（圖6A）。LEC1 表達(dá)在15 d 時不受ABA 的影響，20 d 時被ABA 誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)（圖6B）。 AGL15 表達(dá)在15 d 時被ABA 抑制，20 d 時被誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)（圖6C）。 FUS3 表達(dá)在20 d 時不受ABA的影響，30 d 時被ABA 誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá) （圖6D）。培養(yǎng)至20 d 和30 d 時，與A0 相比A1 均顯著提高LEA 表達(dá)量， 但30 d 時差異更顯著（圖6E）。ABI3 表達(dá)在20 d 時不受ABA 的影響，30 d時被ABA 誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)（圖6F）。 綜上所述，ABA 誘導(dǎo)的體胚發(fā)生標(biāo)記基因的表達(dá)有時空特異性，不同時間點誘導(dǎo)的基因不同，愈傷增殖早期和中期0.02 μmol·L－1ABA 誘導(dǎo)了BBM、LEC1 和AGL15 基因的表達(dá)，愈傷增殖后期激活FUS3、LEA 和ABI3 的表達(dá)， 這些體胚發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)水平的增加是ABA 調(diào)控體細(xì)胞胚胎發(fā)生的基礎(chǔ)。

3 討論

圖6 qRT-PCR 分析基因的表達(dá)量Fig. 6 Analysis of the gene expression by qRT-PCR

棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生普遍經(jīng)歷愈傷組織誘導(dǎo)、胚性愈傷組織誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚誘導(dǎo)和再生苗誘導(dǎo)4 個階段[24]，在此過程中涉及到復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)導(dǎo)和以特定方式調(diào)控的相關(guān)基因表達(dá)模式的重新編程。 本研究通過外源添加ABA 處理外植體，研究ABA 對棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響，以期對體細(xì)胞胚胎發(fā)生遺傳機(jī)制的研究做出些許貢獻(xiàn)。

3.1 ABA 對下胚軸初始細(xì)胞脫分化的影響

初始細(xì)胞脫分化伴隨著表皮細(xì)胞的擴(kuò)張，初始形成層細(xì)胞進(jìn)入快速分裂期，初始細(xì)胞脫分化是體細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變的開始，對后期愈傷組織生長和胚性愈傷組織分化具有重要意義[25]。 在擬南芥中過表達(dá)AtLBDs 基因能夠使外植體在不添加外源生長素的培養(yǎng)基上長出愈傷組織， 而LBD 基因表達(dá)被抑制后， 愈傷組織不能被誘導(dǎo)， 提示LBD 基因在愈傷組織形成過程中必不可少[26]。 本研究中，棉花下胚軸初始細(xì)胞脫分化階段，新生的愈傷組織細(xì)胞團(tuán)由內(nèi)而外涌出， 隨著ABA 濃度升高愈傷組織細(xì)胞數(shù)量顯著增加。 同時，A1、A2、A3、A4 處理下GhLBD16 和GhLBD29 基因表達(dá)量極顯著高于A0。結(jié)果表明，外源添加ABA顯著上調(diào)GhLBD16 和GhLBD29 基因的表達(dá)，促進(jìn)了愈傷組織形成。

3.2 ABA 對愈傷組織脫分化和增殖的影響

陳軍營等研究顯示，0.1 mg·L－1的脫落酸對小麥愈傷組織誘導(dǎo)效果最好[27]，而周玲艷等認(rèn)為一定量的脫落酸使水稻愈傷組織的分裂生長受到抑制[28]。研究結(jié)果表明，不同的植物愈傷誘導(dǎo)階段對脫落酸的敏感性不同，作用也不唯一。 愈傷組織脫分化和愈傷組織增殖是緊密相關(guān)的，愈傷組織脫分化率高的同時，愈傷組織的適度增殖也有利于后期胚性愈傷組織的形成。本研究中，A1、A2、A3、A4 處理能顯著提高愈傷組織分化率和增殖率，脫落酸對棉花愈傷組織的形成具有正向誘導(dǎo)的作用。 在玉米體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中，AGL15-like 和BBM 基因表達(dá)量在玉米幼胚到脫分化過程中顯著上調(diào)，ZmLEC1 表達(dá)量顯著下調(diào)[29]。 本研究中，愈傷脫分化和增殖過程中，A1處理下AGL15、BBM 和LEC1 表達(dá)量均顯著高于A0， 外源ABA 可能通過誘導(dǎo)這些基因的表達(dá)從而促進(jìn)愈傷脫分化和增殖。 玉米中LEC1表達(dá)量下調(diào)，棉花中LEC1 上調(diào)，可能是單子葉和雙子葉植物中LEC1 的時空特異性表達(dá)模式不同。

3.3 ABA 對胚性愈傷組織分化的影響

胚性愈傷組織是愈傷組織進(jìn)一步再分化形成的，細(xì)胞胚性能力的獲得不具有普遍性，只有少量愈傷組織分化成胚性愈傷。 胚性愈傷組織的質(zhì)量主要取決于前期愈傷組織的脫分化情況。 在胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)中， 愈傷組織中內(nèi)源ABA 含量基本不變， 而在誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性細(xì)胞時ABA 含量顯著升高， 并在體細(xì)胞胚時期保持較高含量，說明ABA 含量的增加對愈傷組織細(xì)胞轉(zhuǎn)變成胚性細(xì)胞有促進(jìn)作用[30]。 試驗結(jié)果顯示，A1 處理下胚性愈傷組織分化率顯著高于A0， 而A2、A3、A4處理下胚性愈傷組織分化率顯著低于A0。4 個處理均顯著促進(jìn)愈傷組織增殖， 隨著ABA 濃度的增加，愈傷增殖率提高，愈傷組織脫分化階段過量細(xì)胞增殖不利于胚性愈傷組織的形成。 相似的研究也表明，棉花組織培養(yǎng)過程中，利用不同紅藍(lán)配比的光質(zhì)控制愈傷增殖，發(fā)現(xiàn)愈傷組織適度增殖有利于胚性愈傷組織分化，過度增殖可能起相反作用[31]。 因此適宜濃度的ABA 能平衡愈傷組織增殖和胚性愈傷分化， 高濃度的ABA 造成愈傷組織過度增殖及后期胚性愈傷組織分化不理想。 本研究發(fā)現(xiàn)0.02 μmol·L－1ABA 對棉花下胚軸胚性愈傷分化有正向作用，本試驗濃度之外的ABA 對棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的作用有待進(jìn)一步研究。

3.4 ABA 調(diào)控體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)

愈傷組織向胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)變過程中伴隨著內(nèi)源ABA 含量的快速升高， 進(jìn)而通過調(diào)控FUS3 和ABI3 等基因的表達(dá)影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生。 本研究結(jié)果表明，ABA 處理后，體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)發(fā)生變化，ABA 可能通過改變內(nèi)源ABA 水平誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而影響愈傷組織脫分化和胚性愈傷組織分化。 A1 處理， 培養(yǎng)20 d 時愈傷組織中LEC1 和BBM 表達(dá)量顯著上調(diào)，30 d 時愈傷組織中FUS3、LEA 和ABI3 表達(dá)量顯著上調(diào)，證明脫落酸通過時空特異性的調(diào)節(jié)上述基因的表達(dá)從而影響胚性愈傷組織的分化。 脫落酸處理下，體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)量的變化及其具體涉及和作用的激素信號作用網(wǎng)絡(luò)需進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)錄組分析等開展研究。 值得注意的是，在表型觀察中發(fā)現(xiàn)A2、A3、A4 處理中胚性愈傷分化率降低、胚性愈傷組織質(zhì)地變差，推測高濃度的ABA 可能產(chǎn)生較強(qiáng)的逆境， 大多細(xì)胞在這種逆境條件下死亡，只有少量胚性愈傷產(chǎn)生。 A1 處理體胚發(fā)生相關(guān)的標(biāo)記基因表達(dá)量顯著升高，胚性愈傷分化率顯著高于A0， 其可能的原因是適度的逆境脅迫，加上體胚發(fā)生標(biāo)記基因的激活，共同導(dǎo)致愈傷組織分化成胚性愈傷組織。 正如生長素多用于愈傷組織誘導(dǎo)階段， 在胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段則需要降低生長素濃度； 脫落酸也是主要在愈傷誘導(dǎo)階段發(fā)揮正調(diào)控作用， 胚性愈傷誘導(dǎo)階段不添加脫落酸或者使用較低濃度的脫落酸是否能提高胚性愈傷獲得率需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

棉花下胚軸初始細(xì)胞脫分化、愈傷組織和胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段對ABA 敏感性和響應(yīng)機(jī)制不同。 在下胚軸初始細(xì)胞脫分化中，ABA 能誘導(dǎo)LBD16 和LBD29 基因高表達(dá)， 促進(jìn)愈傷組織快速形成。 在棉花愈傷組織和胚性愈傷組織發(fā)育過程中，ABA 顯著提高愈傷組織、胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織增殖率，0.02 μmol·L－1ABA 處理誘導(dǎo)BBM、AGL15、LEC1、FUS3、ABI3、LEA 基因的表達(dá)，并顯著提高胚性愈傷組織分化率，0.04～0.08 μmol·L－1ABA 抑制胚性愈傷組織分化。