周小嬪, 王衍廷, 劉 斌△
(1武警特色醫(yī)學(xué)中心感染科,天津300162;2解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)960醫(yī)院神經(jīng)外科,山東濟(jì)南250000)
創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)可由于其神經(jīng)系統(tǒng)功能改變引起應(yīng)激性潰瘍(stress ulcer),臨床稱為庫欣潰瘍(Cushing ulcer)[1],其發(fā)生與TBI 的嚴(yán)重程度密切相關(guān),即病情越重,其發(fā)生率越高。對于應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生機(jī)制目前存在多種解釋,其中主要有神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)、胃黏膜保護(hù)功能損傷及胃黏膜損傷因子作用增強(qiáng)[2],對應(yīng)激性潰瘍分子機(jī)制的闡釋也有研究[3]。Wnt 信號通路的上游啟動子Wnt1 及中心因子富含亮氨酸重復(fù)序列的G 蛋白偶聯(lián)受體5(leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5,LGR5)與人體多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān),包括胃癌、肝癌、基底細(xì)胞癌、卵巢癌和食管癌等[4-7]。近年來發(fā)現(xiàn)這一信號通路也參與介導(dǎo)胃粘膜炎癥性改變,導(dǎo)致攻擊因子和/或防御因子失衡,進(jìn)而誘發(fā)應(yīng)激性潰瘍[8]。本實(shí)驗(yàn)研究觀察了Wnt1 和LGR5 在顱腦創(chuàng)傷后應(yīng)激性潰瘍大鼠胃粘膜中表達(dá)變化,進(jìn)而探討其與顱腦創(chuàng)傷后應(yīng)激性潰瘍的相關(guān)性,為臨床闡釋應(yīng)激性潰瘍發(fā)生機(jī)制及應(yīng)激性潰瘍的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
免疫組化試劑盒(北京中衫金橋);抗β-actin 抗體(Absmart);抗LGR5抗體(Epitomics);Ⅱ抗(KPL);Trizol 試劑(Invitrogen)。電子皮質(zhì)損傷撞擊儀(electronic cortical contusion impactor,eCCI)和多普勒激光流量計(PF-5000,瑞典帕瑞醫(yī)學(xué)公司)。
2.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 SPF 級雄性7 周齡SD 大鼠30 只由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供,許可證號為SCXK(軍)2007-004,體重(300±15)g。將大鼠編號、稱重,隨機(jī)分為3 組,即假手術(shù)(sham)組、輕度TBI(mild TBI,mTBI)組和重度TBI(severe TBI,sTBI)組,每組10只。
2.2 模型復(fù)制 (1)將sham 組大鼠用5%水合氯醛(6 mL/kg)腹腔麻醉后固定于立體定向儀,頭部備皮消毒,手術(shù)刀片沿正中切開頭皮,剝脫分離骨膜,以牙科鉆在冠狀縫后5 mm、矢狀縫右側(cè)5 mm 交匯處,擴(kuò)大骨窗至5 mm×5 mm,保持硬膜完整。(2)mTBI組大鼠重復(fù)上述操作,待夾尾反射出現(xiàn)后,將其固定于eCCI:設(shè)置打擊深度2 mm,持續(xù)時間120 ms,打擊速率3 m/s,打擊 1 次。(3)sTBI 組大鼠待夾尾反射出現(xiàn)后,將其固定于eCCI儀:設(shè)置打擊深度4 mm,持續(xù)時間120 ms,打擊速率4 m/s,打擊1次。
2.3 神經(jīng)功能缺損評分(neurological severity score,NSS) eCCI 打擊后待動物完全蘇醒,由不了解實(shí)驗(yàn)分組情況、經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的研究人員分別在24和48 h兩個時點(diǎn)參照 Wang 等[9]的 NSS 表,應(yīng)用盲法對大鼠進(jìn)行評分。大鼠出現(xiàn)平衡障礙、向輕癱側(cè)傾倒、抱緊平衡木肢體從平衡木垂落可認(rèn)為是mTBI;sTBI在以上癥狀體征出現(xiàn)同時伴有耳廓反射、角膜反射和驚恐反射消失,甚至可以出現(xiàn)肌陣攣和肌張力障礙。
2.4 胃黏膜大體結(jié)構(gòu)觀察及HE 染色 造模后48 h,將大鼠處死,應(yīng)用多聚甲醛灌流固定后,正中線開腹,游離胃組織,取胃組織沿胃大彎處剖開,生理鹽水沖洗胃組織內(nèi)壁殘留物,直接肉眼觀察胃黏膜皺襞情況。另取胃組織石蠟包埋,切片放在60 ℃烘箱中烘烤30 min,常規(guī)脫蠟,流水沖洗10 min 后,蘇木素染色2 min。隨后用流水沖洗10 min,伊紅復(fù)染2 min,流水沖洗10 min,乙醇脫水,二甲苯兩次透明,中性樹膠封固。每張切片在100 倍顯微鏡視野下對胃黏膜進(jìn)行觀察。
2.5 Western blot 實(shí)驗(yàn) eCCI 打擊后 48 h 取材,選取大鼠胃黏膜3 個部位(胃大彎處、賁門部和幽門部),按100 g 組織樣本加入100 μL 2× SDS 緩沖液(1 mol/L Tris-HCl,1%SDS,50%glycerol,pH 6.8)的比例裂解樣本,研磨后于冰上裂解10 min,12 000 r/min(離心半徑8 cm)離心20 min,取上清液-80℃?zhèn)溆?。BCA 試劑盒測定蛋白濃度后,取 50 μg 蛋白樣品,經(jīng)SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜,脫脂奶粉封閉2 h,分別加入抗Wnt1 和LGR5 的Ⅰ抗,4℃過夜,洗膜后加Ⅱ抗,37℃孵育2 h。使用ECL 液顯色,最后進(jìn)行顯影、定影,用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)掃描吸光度值,用Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行分析。定量結(jié)果應(yīng)用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計作圖軟件繪制。
2.6 免疫組織化學(xué)染色 造模48 h 后,應(yīng)用兔超敏二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)進(jìn)行免疫組化染色:大鼠胃組織切片用3%的H2O2封閉10 min 后,pH 6.0 的枸櫞酸溶液加熱孵育15 min 以修復(fù)抗原;冷卻至室溫后用5%的山羊血清室溫封閉20 min;滴加抗LGR5 的Ⅰ抗(1∶150),4℃過夜;PBS 清洗后依次滴加試劑1 和2,室溫孵育20min;DAB 顯色劑顯色,沖洗,蘇木素復(fù)染,用乙醇脫水,再用二甲苯透明,最后中性樹脂封片。在Nikon偏振光倒置顯微鏡下觀察免疫陽性反應(yīng)物的分布與定位。隨機(jī)選取5 個不重復(fù)的視野,鏡下計數(shù)形態(tài)完整的LGR5陽性細(xì)胞,計算各組陽性細(xì)胞平均數(shù)。
2.7 大鼠胃組織血流量的多普勒監(jiān)測 致傷48 h后,各組取5 只大鼠,水合氯醛溶液腹腔麻醉后,行多普勒超聲監(jiān)測胃粘膜表面血流量,正中線剖腹,游離胃組織,插入激光血流儀探頭,分別置于胃底部、胃大彎、賁門部和幽門部4 處測定胃黏膜表面血流量。各部位記錄時間均為30 min,取平均值,單位為mL/(min×100 g)。
采用GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計作圖軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較行單因素方差分析,兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
如圖1所示,sham組未傷及正常腦組織,神經(jīng)功能未缺損,評分正常;mTBI 組及sTBI 組神經(jīng)功能出現(xiàn)明顯受損,主要表現(xiàn)為無法沿直線行走,平衡功能明顯障礙,外周感知能力下降,NSS 均顯著升高(P<0.01),且sTBI 組較mTBI 組進(jìn)一步升高(P<0.01),提示sTBI 組大鼠神經(jīng)功能損傷更重,即腦損傷程度更重。
Figure 1.NSS scores of the rats.Mean±SD. n=10.**P<0.01 vs sham group;##P<0.01 vs mTBI group.圖1 大鼠NSS評分
如圖2所示,sham組可見胃黏膜呈淡紅色,表面光滑,黏膜皺襞平整,黏膜上皮完整度好;mTBI組及sTBI 組均有不同程度胃黏膜組織損傷,表現(xiàn)為黏膜表面有血痂,部分胃黏膜表面可見散在不規(guī)則點(diǎn)狀出血灶,sTBI 組還可見黏膜水腫及片狀出血灶,部分黏膜可見皺襞變淺甚至消失。在光鏡下可見sham組大鼠胃組織結(jié)構(gòu)正常,黏膜表面完整,未見炎癥細(xì)胞浸潤滲出;mTBI組及sTBI組大鼠可見部分黏膜上皮萎縮,正常腺體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)萎縮,部分可見紅細(xì)胞滲出,黏膜下層有炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。
Western blot 結(jié)果顯示,mTBI 組及 sTBI 組大鼠胃大彎、賁門和幽門處胃黏膜中Wnt1 和LGR5 蛋白表達(dá)水平較sham 組均顯著升高(P<0.05),且sTBI組Wnt1 和LGR5 蛋白表達(dá)水平較mTBI 組升高更明顯(P<0.01),見圖3。
如圖4 所示,LGR5 免疫陽性產(chǎn)物主要定位于胞漿中,sham 組免疫陽性產(chǎn)物也有表達(dá)但表達(dá)量較低(76±5),mTBI 組及sTBI 組的免疫陽性產(chǎn)物表達(dá)量均顯著增多(P<0.05),且sTBI 組(236±11)較mTBI組(178±11)顯著增多(P<0.05)。
Figure 2.The structure of gastric tissue and pathological changes of gastric body in each group(HE staining,×100).Images g,h and I were the local enlarged views of d,c and f,respectively.圖2 各組大鼠胃組織大體結(jié)構(gòu)及胃組織胃體部病理變化
Figure 3.The protein expression of LGR5 and Wnt1 in gastric mucosa(great curvature,cardia and pylorus)of the rats detected by Western blot.Mean±SD. n=10.*P<0.05,**P<0.01 vs sham group;#P<0.05 vs mTBI group.圖3 大鼠胃黏膜三個部位(胃大彎、賁門和幽門)胃組織LGR5和Wnt1
Figure 4.Immunohistochemical staining of LGR5 in the rat gastric mucosa tissues(×200).Images a,b and c were the local enlarged views of A,B and C,respectively.LGR5 immunopositive products were mainly localized in cytoplasm.Mean±SD. n=10.**P<0.01 vs sham group;##P<0.01 vs mTBI group.圖4 大鼠胃黏膜組織LGR5免疫組織化學(xué)染色
如圖5所示,sham組與2個TBI組胃大彎處血流量基本保持同一水平,而2個TBI組賁門部近胃小彎處黏膜血流量較sham組顯著下降(P<0.05),sTBI組血流量均值較mTBI 組下降更為明顯(P<0.05)。這一結(jié)果提示TBI 確實(shí)改變了胃黏膜組織的血流,降低了局部胃黏膜的血流量。
Figure 5.The measurement results of gastric mucosal blood flow by Doppler ultrasound.Mean±SD. n=10.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs mTBI group.圖5 多普勒超聲檢測胃黏膜血流量的結(jié)果
近年來的研究表明,有關(guān)TBI 的實(shí)驗(yàn)多采用電子皮質(zhì)損傷撞擊儀造模,均報道了TBI 模型未見死亡[9],造模成功后,大鼠胃組織大體觀察及胃黏膜上皮HE染色可見,傷后大鼠胃組織宏觀與鏡下觀察的確出現(xiàn)了胃黏膜的點(diǎn)狀、片狀出血灶,局部胃黏膜炎癥細(xì)胞浸潤[10],紅細(xì)胞滲出,腺細(xì)胞萎縮甚至消失,上皮細(xì)胞連續(xù)性中斷,損傷深達(dá)黏膜下層組織,這印證了創(chuàng)傷后應(yīng)激性潰瘍發(fā)生的客觀性,這種病變的機(jī)制可能是通過上調(diào)了Wnt1 及LGR5 的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的,在TBI干預(yù)后,蛋白水平Western blot 證實(shí)大鼠胃黏膜中Wnt1及LGR5蛋白的表達(dá)上升,LGR5的免疫組化實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平證實(shí)TBI 后LGR5 的異常高表達(dá),且隨著 TBI 嚴(yán)重程度增加,Wnt1 及 LGR5 的表達(dá)均出現(xiàn)上升趨勢,證實(shí)了Wnt 信號通路相關(guān)蛋白高表達(dá)確實(shí)與TBI 的干預(yù)相關(guān)。本研究中mTBI 組及sTBI 組的胃黏膜血流量較Sham 組明顯降低,這可能與TBI 干預(yù)后的血液再分布有關(guān)。近年來研究認(rèn)為,胃黏膜血流量下降在應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生中起主導(dǎo)作用[11]。局部胃黏膜的血流量充足是其保護(hù)性重要機(jī)制,TBI后使得黏膜血流量下降反過來又會導(dǎo)致黏液屏障完整性下降,從而加重潰瘍病的出現(xiàn),從實(shí)驗(yàn)中還可發(fā)現(xiàn),這種局部血流量保護(hù)屏障作用損傷會隨著TBI 程度加重而加重,既是創(chuàng)傷后應(yīng)激性潰瘍發(fā)生的原因又是結(jié)果。
以往大量的研究證實(shí),Wnt 信號通路在腫瘤的形成和發(fā)展中起到重要調(diào)節(jié)作用[12],例如各種消化道腫瘤,基底細(xì)胞癌,卵巢癌發(fā)生機(jī)制過程中都有Wnt 信號通路的作用。Wnt基因其實(shí)是一大基因家族,其中的Wnt1 在整個Wnt 信號通路中扮演啟動子角色[13]。經(jīng)典的Wnt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要以Wnt/β-cantenin 途徑為主,其過程主要通過β-cantenin 向細(xì)胞核移位,激活TCF 轉(zhuǎn)錄活性,調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)水平,這一重要靶基因即本研究中LGR5。LGR5 是具有18個富含亮氨酸的重復(fù)單位和7個跨膜區(qū)域組成的大分子蛋白,LGR5在人體多個組織結(jié)構(gòu)中均有表達(dá)[14],其作為Wnt 信號通路關(guān)鍵中心蛋白,在腫瘤研究領(lǐng)域備受關(guān)注,其異常表達(dá)或激活與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15-16]。Sen 等[14]和 Polzer 等[17]的研究證實(shí)Wnt 信號通路介導(dǎo)了消化道黏膜損害過程以及參與一些慢性炎癥疾病,如風(fēng)濕樣關(guān)節(jié)炎和動脈粥樣硬化。激活的Wnt 聯(lián)合下游靶基因LGR5介導(dǎo)了正常消化道黏膜組織修復(fù)、愈合和再生,很大程度上這一信號通路高表達(dá)會加重炎癥反應(yīng),可能在消化道黏膜炎癥進(jìn)一步向消化道潰瘍轉(zhuǎn)化方面扮演重要角色[18]。這為創(chuàng)傷后消化性潰瘍的發(fā)生機(jī)制提供了新的解釋。
綜上所述,本研究成功應(yīng)用eCCI 建立了大鼠TBI后應(yīng)激性潰瘍模型,與國內(nèi)外類似研究比較具有一定創(chuàng)新和先進(jìn)之處。通過對Wnt信號通路中Wnt1及LGR5 在TBI 后出現(xiàn)高表達(dá)的研究,為顱腦創(chuàng)傷后應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù),也為研究治療TBI 后應(yīng)激性潰瘍的新型藥物靶點(diǎn)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。另外,本實(shí)驗(yàn)只研究了Wnt1 及LGR5 兩個重要蛋白表達(dá)變化情況,對于Wnt1 及LGR5 所在Wnt通路的上下游因子相互作用的關(guān)系,還有待進(jìn)一步研究探討。