任 敏，多拉娜，王 帥，李 敏，楊成聰，孫志宏，孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點實驗室內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點實驗室 呼和浩特010018）

發(fā)酵乳制品尤其是酸奶，憑借其獨特的風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)深受廣大消費者的喜愛。風(fēng)味作為評定酸奶感官品質(zhì)重要的屬性之一，主要受到酸奶發(fā)酵劑菌種德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌產(chǎn)生的乳酸以及各種揮發(fā)性有機芳香類化合物的影響[1-2]。?elik[3]認(rèn)為由發(fā)酵劑代謝產(chǎn)生的乙酸、丁二酮、乙偶姻、乳酸和揮發(fā)性脂肪酸這5種物質(zhì)是影響酸奶風(fēng)味的關(guān)鍵性物質(zhì)[4-5]。由此可見，發(fā)酵劑菌株的發(fā)酵特性對生產(chǎn)高品質(zhì)酸奶至關(guān)重要。

乳酸乳球菌是乳球菌屬中最具代表性的菌種，其2 個亞種（乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種）憑借優(yōu)良的產(chǎn)酸、產(chǎn)香等特性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于奶酪、發(fā)酵乳以及酸菜等產(chǎn)品的生產(chǎn)中[6]。在產(chǎn)酸特性方面，大量基因組研究結(jié)果證實乳酸乳球菌有著完整的乳糖代謝通路[7-8]，它們通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)或透性蛋白實現(xiàn)乳糖的降解并產(chǎn)生乳酸。自然發(fā)酵乳制品是乳酸乳球菌的良好來源，然而，許多研究發(fā)現(xiàn)從自然發(fā)酵乳制品中分離得到的乳酸乳球菌產(chǎn)酸能力存在顯著差異[9-10]。Gutiérrez-Méndez 等[11]研究表明乳酸乳球菌的產(chǎn)酸能力與蛋白水解能力存在相關(guān)性。其它研究還發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸能夠調(diào)節(jié)酪蛋白水解，進(jìn)而影響產(chǎn)品風(fēng)味[12]。目前關(guān)于不同發(fā)酵特性，包括產(chǎn)酸、蛋白水解能力的乳酸乳球菌與發(fā)酵乳滋氣味關(guān)系的研究鮮有報道。

本研究采用電子鼻和電子舌技術(shù)對191 株分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的乳酸乳球菌所制備的發(fā)酵乳進(jìn)行滋氣味評價，旨在獲得不同發(fā)酵特性菌株與發(fā)酵乳滋氣味之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

191 株乳酸乳球菌均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳酸菌菌種資源庫提供，詳細(xì)信息見表1。

1.2 主要試劑與設(shè)備

全脂乳粉，新西蘭恒天然；M17 液體培養(yǎng)基、M17 固體培養(yǎng)基，英國Oxoid 公司；PBS 緩沖液，天津市大茂化學(xué)試劑廠；電子舌所需內(nèi)部溶液、參比溶液、陰離子溶液、陽離子溶液和味覺標(biāo)準(zhǔn)溶液，日本Insent 公司。

PEN3 電子鼻：配備10 個金屬氧化傳感器，德國Airsense 公司；SA 402B 電子舌：配備5 個味覺傳感器和2 個參比電極，日本Insent 公司；Eppendorf Centrifuge 5810 高速冷凍離心機，德國Ep-pendorf 公司；LRH-250 恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；ZHJH-C1214C 無菌工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；Vortex-genie 2 漩渦振蕩器，美國Scientific Industries 公司；TW-PB3X5L水浴槽，上海沃迪自動化裝備股份有限公司；SRH 60-70 高壓均質(zhì)機，上海申鹿均質(zhì)機有限公司。

表1 191 株乳酸乳球菌菌株信息Table 1 Information of 191 Lactococcus lactis

（續(xù)表1）

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵乳的制備 將191 株乳酸乳球菌活化至第3 代，其培養(yǎng)液采用梯度稀釋法進(jìn)行活菌計數(shù)。全脂復(fù)原乳經(jīng)均質(zhì)、殺菌后，按106CFU/mL 的接種量接入菌體，30 ℃發(fā)酵至pH 4.6，將發(fā)酵乳置于4 ℃后熟24 h 后用于滋氣味的測定。同時，記錄發(fā)酵時間，測定0 h 及發(fā)酵終點的滴定酸度以及游離氨基氮（FAN，mmol/L） 含量，計算產(chǎn)酸速率（Δ°T/h）以及蛋白水解度。

1.3.1.1 產(chǎn)酸速率的測定 pH 值的測定使用精密pH 計。滴定酸度的測定方法依據(jù)國標(biāo)GB5009.239-2016[13]。

產(chǎn)酸速率（Δ°T/h）=（發(fā)酵終點滴定酸度-發(fā)酵起點滴定酸度）/發(fā)酵時間[14]

1.3.1.2 蛋白水解度的測定 本研究采用鄰苯二甲醛法（OPA） 測定發(fā)酵乳0 h 以及發(fā)酵終點的FAN 含量，通過其變化值來衡量菌株的蛋白水解程度[15]。

蛋白水解度（ΔFAN，mmol/L）=發(fā)酵終點FAN含量-發(fā)酵起點FAN 含量

1.3.2 電子鼻對發(fā)酵乳的測定 取發(fā)酵乳樣品10 mL 兩倍稀釋后置于120 mL 樣品瓶中使用電子鼻進(jìn)行氣味檢測，采用10 個金屬氧化傳感器測定不同敏感物質(zhì)類型。每隔1 s 測定一個響應(yīng)值，共測定60 s。響應(yīng)值在45 s 后達(dá)到穩(wěn)定，選擇49，50，51 時的響應(yīng)值為測試原始數(shù)據(jù)[16-17]。

1.3.3 電子舌對發(fā)酵乳的測定 取發(fā)酵乳50 g，按照1∶3 加水稀釋，10 000×g 離心10 min 后取上清液抽濾備用。將100 mL 發(fā)酵乳上清液均勻的倒在品杯中進(jìn)行樣品測定[18]。每個樣品測定4 個平行值，選取后3 次測定值作為原始數(shù)據(jù)，以減少系統(tǒng)誤差[19]。

1.4 統(tǒng)計分析

使用主成分分析法（Principal component analysis，PCA） 對發(fā)酵乳整體滋氣味品質(zhì)進(jìn)行分析；使用Mann-Whiney 分析確定與發(fā)酵乳滋味品質(zhì)差異顯著相關(guān)的指標(biāo)，通過Spearman 相關(guān)性分析確定各指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系。使用R 語言進(jìn)行Mann-Whiney 以及Spearman 相關(guān)性分析，使用SAS 9.0 進(jìn)行主成分分析，使用Origin 8.6 以及GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的產(chǎn)酸速率以及蛋白水解程度分析

乳酸乳球菌能發(fā)酵牛奶中的乳糖等碳水化合物生成乳酸和一些有機酸，在降低發(fā)酵乳pH 值的同時賦予發(fā)酵乳良好的滋氣味。而產(chǎn)酸能力不同的菌株對發(fā)酵乳最終的品質(zhì)有重要影響。劉文俊[5]認(rèn)為酸奶發(fā)酵是一個動態(tài)的過程，產(chǎn)酸速率可以反映整個發(fā)酵過程中菌株的產(chǎn)酸特性，宋宇琴[14]也將產(chǎn)酸速率的快慢作為衡量保加利亞乳桿菌產(chǎn)酸能力的指標(biāo)之一。本研究團(tuán)隊先前已測定了供試菌株的產(chǎn)酸能力（圖1a），191 株乳酸乳球菌的產(chǎn)酸速率范圍在1.70～6.88 Δ°T/h[20]。參考劉文俊[5]、宋宇琴[14]的方法將191 株乳酸乳球菌分為3 組，分別為慢速產(chǎn)酸菌株72 株（S 組，產(chǎn)酸速率＜3.5 Δ°T/h）、中等產(chǎn)酸菌株71 株（M 組，3.5 Δ°T/h≤產(chǎn)酸速率≤4.5 Δ°T/h）和快速產(chǎn)酸菌株48 株（F 組，產(chǎn)酸速率≥4.5 Δ°T/h），方差分析結(jié)果表明3 組菌株之間的產(chǎn)酸速率存在極顯著差異（P＜0.01）。

發(fā)酵乳樣品中的蛋白質(zhì)主要是酪蛋白和乳清蛋白，乳清蛋白中含有非蛋白氮，即可溶解于三氯乙酸（TCA）的部分含氮化合物，因此采用OPA 法測定191 株菌在發(fā)酵期間FAN 含量的變化，進(jìn)而評估乳酸乳球菌的蛋白水解能力[21]。同樣的，本研究團(tuán)隊在之前已測定了供試菌株的蛋白水解能力（圖1b），191 株乳酸乳球菌ΔFAN 范圍為0.28～22.47 mmol/L[20]。依據(jù)ΔFAN 不同將全部菌株分為3 組做后續(xù)分析，分別為低蛋白水解菌株73 株（L組，ΔFAN＜3 mmol/L）、中蛋白水解菌株62 株（M組，3 mmol/L≤ΔFAN≤7 mmol/L），高蛋白水解菌株56 株（H 組，ΔFAN＞7 mmol/L），3 組之間也存在極顯著差異（P＜0.01）。

圖1 乳酸乳球菌的產(chǎn)酸速率以及FAN 的變化量Fig.1 The acid producing rate and FAN value of Lactococcus lactis

2.2 不同產(chǎn)酸速率菌株制備發(fā)酵乳滋氣味品質(zhì)的差異性分析

采用主成分分析法（PCA）對不同產(chǎn)酸速率的乳酸乳球菌制備發(fā)酵乳的滋氣味進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。電子鼻和電子舌的結(jié)果均顯示出S組發(fā)酵乳與M 組以及F 組有輕微的重疊，然而整體上呈分離趨勢，這表明慢速產(chǎn)酸菌株所制備發(fā)酵乳的滋氣味與快速和中速產(chǎn)酸菌株存在一定差異。表2為電子鼻的主成分特征向量值，PC1 中甲烷、乙醇以及有機硫化物具有最高的正系數(shù)，芳香成分具有極高的負(fù)系數(shù)，PC2 中氮氧化合物和硫化物的特征向量值較高。結(jié)合圖2a 可知，位于右半圖的S 組發(fā)酵乳，即慢速產(chǎn)酸菌株制備的發(fā)酵乳中，甲烷、乙醇以及有機硫化物響應(yīng)值較高，而芳香成分響應(yīng)值較低。

表2 電子鼻主成分特征向量值Table 2 Eigenvector value of principal component of electronic nose

圖2 不同產(chǎn)酸速率乳酸乳球菌制備酸乳的滋氣味品質(zhì)PC1 與PC2 因子得分圖Fig.2 Graphical representation of the principal component analysis of the taste and odor profile of milk fermented by different acidogenic rate Lactococcus lactis

同樣的，電子舌的主成分特征向量值（表3）顯示，PC1 中酸味具有最大的正系數(shù)，而鮮味具有最大的負(fù)系數(shù)，PC2 中澀味的回味和鮮味的回味特征向量值分別為0.66 和0.46。結(jié)合圖2b 可知，位于左側(cè)的S 組發(fā)酵乳具有強烈的鮮味以及較弱的酸味。

表3 電子舌主成分特征向量值Table 3 Eigenvector value of principal component of electronic tongue

使用Mann-Whiney 分析確定與發(fā)酵乳滋味品質(zhì)差異顯著相關(guān)的指標(biāo)（圖3和圖5）。由圖3可知，3 組不同產(chǎn)酸速率菌株制備的發(fā)酵乳在氫氣和烷烴以及澀味的回味上沒有顯著差異。在芳香成分上，S 組顯著低于M 組和F 組，而在甲烷、乙醇以及有機硫化物上卻顯著高于M 組和F 組（P＜0.001）。在滋味方面，S 組發(fā)酵乳在酸味和澀味方面顯著低于M 組和F 組，而在鮮味、鮮味的回味、咸味方面顯著高于其余2 組（P＜0.001）。因此可知，中等和快速產(chǎn)酸菌株所制備的發(fā)酵乳與慢速產(chǎn)酸菌株相比芳香成分含量更高，并且具備較強的酸味和較弱的鮮味。

圖3 不同產(chǎn)酸速率乳酸乳球菌制備發(fā)酵乳滋氣味品質(zhì)的差異性分析Fig.3 Difference analysis of the taste and odor profile of milk fermented by different acidogenic rate Lactococcus lactis

2.3 不同蛋白水解能力菌株制備發(fā)酵乳滋氣味品質(zhì)的差異性分析

按照2.2 節(jié)中的方法對具有不同蛋白水解程度的乳酸乳球所制備發(fā)酵乳的氣味和滋味進(jìn)行分析。結(jié)果表明，高蛋白水解組（H 組）與其它2 組的滋氣味存在一定的分離趨勢（圖4）。結(jié)合表2和表3可知，高蛋白水解組的菌株比其它2 組有較高的甲烷、乙醇以及有機硫化物和較低的芳香成分；在滋味方面，H 組具有較強烈的鮮味，而M 組和L 組酸味較強。

由圖5可知，不同蛋白水解程度的3 組菌株制備的發(fā)酵乳在氫氣、烷烴成分以及澀味的回味上沒有顯著差異。而芳香成分、乙醇指標(biāo)的響應(yīng)值3 組間均具有極顯著差異（P＜0.001），這表明蛋白水解程度的差異對于芳香成分以及乙醇含量的影響較大。H 組的芳香成分顯著低于其余2 組，而甲烷、乙醇、有機硫化物顯著高于其余2 組（P＜0.001）。在滋味方面，H 組在咸味、鮮味和鮮味的回味上比其它2 組更為強烈，而在酸味和澀味方面弱于其它2 組。

圖4 不同蛋白水解程度乳酸乳球菌制備酸乳的滋氣味品質(zhì)PC1 與PC2 因子得分圖Fig.4 Graphical representation of the principal component analysis of the taste and odor profile of milk fermented by different proteolysis level Lactococcus lactis

圖5 不同蛋白水解程度乳酸乳球菌制備發(fā)酵乳滋氣味品質(zhì)的差異性分析Fig.5 Difference analysis of the taste and odor profile of milk fermented by different proteolysis level Lactococcus lactis

2.4 發(fā)酵乳滋氣味品質(zhì)與發(fā)酵特性的相關(guān)性分析

為探究發(fā)酵乳滋氣味指標(biāo)以及菌株產(chǎn)酸和蛋白水解程度之間的相關(guān)性，依據(jù)電子鼻和電子舌的響應(yīng)值以及產(chǎn)酸速率、ΔFAN 值計算相關(guān)性指標(biāo)，結(jié)果見圖6。菌株的產(chǎn)酸速率與芳香類風(fēng)味物質(zhì)呈顯著正相關(guān)，與甲烷類和乙醇呈顯著負(fù)相關(guān)（圖6a）。在滋味方面，菌株的產(chǎn)酸速率與酸味呈顯著正相關(guān)，而與鮮味、鮮味的回味、咸味之間呈顯著負(fù)相關(guān)（圖6b）。菌株的產(chǎn)酸速率與蛋白水解程度呈顯著負(fù)相關(guān)，因此蛋白水解程度與各滋氣味的相關(guān)關(guān)系與產(chǎn)酸速率及各滋氣味之間的關(guān)系正好相反。此外，各滋氣味之間也存在相關(guān)性，例如：芳香成分與甲烷類和乙醇、酸味和鮮味存在顯著負(fù)相關(guān)。

圖6 相關(guān)性分析圖Fig.6 Correlation analysis chart

3 討論與結(jié)論

電子鼻和電子舌技術(shù)所產(chǎn)生的復(fù)雜數(shù)據(jù)集與多元統(tǒng)計分析相結(jié)合，非常有助于乳制品的滋味和氣味指標(biāo)的數(shù)字化評價，從而快速高效的分類、識別和鑒定樣品[22]。O'riordan 等[23]研究發(fā)現(xiàn)基于電子鼻技術(shù)可以區(qū)分不同發(fā)酵劑在同一標(biāo)準(zhǔn)化方法下制造的干酪。白雪等[24]采用電子鼻檢測后進(jìn)行主成分分析可以很好的區(qū)分奶貝和酸奶中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，且與GC-MS 分析后得到的結(jié)果一致。劉永吉等[25]研究表明電子舌結(jié)合PCA 分析以及判別因子分析（DFA）在區(qū)分崗稔酸乳品質(zhì)方面效果良好，表明電子鼻與電子舌技術(shù)結(jié)合多元方差分析對于區(qū)分發(fā)酵乳制品品質(zhì)具有較高的準(zhǔn)確性。因此，本研究以191 株產(chǎn)酸和蛋白水解特性存在差異的乳酸乳球菌所制備的發(fā)酵乳為研究對象，通過電子鼻和電子舌技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計分析，探究不同發(fā)酵特性的乳酸乳球菌對發(fā)酵乳滋氣味品質(zhì)的影響。

本研究結(jié)果表明，中速和快速產(chǎn)酸菌株制備的發(fā)酵乳中芳香成分的響應(yīng)值顯著高于慢速產(chǎn)酸菌株所制備的發(fā)酵乳，而在甲烷、乙醇、有機硫化物等氣味指標(biāo)上顯著低于慢速產(chǎn)酸組（P＜0.01）。中速以及快速產(chǎn)酸菌株產(chǎn)生的較強烈芳香類物質(zhì)，可能是由于菌株快速代謝的糖類而產(chǎn)生的酸類、酮類以及蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的一些胺類。丁海兵[26]研究表明，乳酸乳球菌在合成雙乙酰時涉及到的酶類受pH 值的影響，當(dāng)pH 值在5 左右時，乙酰乳酸脫羧酶的活性低于乙酰乳酸合成酶的活性時，發(fā)酵乳中的丁二酮才能得到有效積累。García-Cayuela 等[27]研究表明，乳酸乳球菌產(chǎn)生的芳香物質(zhì)還涉及氨基酸的分解代謝，而pH 值變化會對相關(guān)酶的表達(dá)產(chǎn)生差異。倪春梅[28]在干酪成熟的研究中表明，發(fā)酵劑菌株代謝產(chǎn)生的乳酸使乳發(fā)生酸化，能夠提高蛋白酶類活性，使得蛋白質(zhì)進(jìn)一步降解為小分子多肽。因此，快速產(chǎn)酸菌株能夠使原料乳的pH 值快速降低，從而提高了某些酶類的活性進(jìn)而產(chǎn)生了較高的芳香成分。電子舌結(jié)果表明，快速和速等產(chǎn)酸組的發(fā)酵乳酸味強于慢速產(chǎn)酸組，而鮮味較弱（P＜0.01）。這可能是由于產(chǎn)酸能力強的菌株快速分解乳糖產(chǎn)生乳酸，賦予了發(fā)酵乳明顯的酸味；鮮味的主要來源為蛋白質(zhì)分解所產(chǎn)生的一些氨基酸和簡單的肽類[29]。慢速產(chǎn)酸菌株隨著發(fā)酵時間的逐漸延長，底物消耗殆盡，菌株生長進(jìn)入衰亡期。有研究表明，菌體死亡后釋放的蛋白分解酶會逐漸分解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生一些堿性物質(zhì)，如游離氨基酸和小肽等，從而導(dǎo)致一些呈鮮味氨基酸發(fā)揮作用[30]。

依據(jù)蛋白水解程度將菌株進(jìn)行分組，并對其制備的發(fā)酵乳做滋氣味的差異性分析，結(jié)果表明，高蛋白水解菌株所制備的發(fā)酵乳芳香成分響應(yīng)值較低，而甲烷、乙醇、有機硫化物的響應(yīng)值較高。值得注意的是，這一結(jié)果與產(chǎn)酸速率分組后得到的結(jié)果正好相反，進(jìn)一步的Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果表明，菌株的產(chǎn)酸速率與蛋白水解程度呈明顯的負(fù)相關(guān)，與上述結(jié)果吻合。酈金龍等[31]認(rèn)為不同微生物所能產(chǎn)生的酶系不同，導(dǎo)致對碳源的利用能力產(chǎn)生差異，從而影響菌株的產(chǎn)酸能力。關(guān)于菌株不同的蛋白水解能力，Neviani 等[32]研究表明，不同的嗜熱鏈球菌顯示了不同的氨基酸需求，一些氨基酸為基本需求，一些則為一般要求，而另一些則不需要。因此，菌株的蛋白水解能力與產(chǎn)酸能力的差異主要取決于菌株的自身特性。此外，Liu等[33]表明與乳酸乳球菌蛋白水解相關(guān)的蛋白酶、肽酶以及肽轉(zhuǎn)運蛋白通常與菌株中特定質(zhì)粒的存在相關(guān)，從而導(dǎo)致乳酸乳球菌蛋白水解能力存在差異。結(jié)合本研究結(jié)論初步認(rèn)為，產(chǎn)酸速率慢的菌株對于碳水化合物的利用能力差，然而其對氨基酸的要求較高，或具有較高的蛋白酶類活性來供給菌株生長，在這個過程中產(chǎn)生了不同于快速產(chǎn)酸菌的風(fēng)味物質(zhì)從而影響了發(fā)酵乳的滋氣味。

本研究采用電子鼻和電子舌技術(shù)，研究了191 株具有不同發(fā)酵特性的乳酸乳球菌所制備的發(fā)酵乳，在氣味和滋味方面的差異和聯(lián)系。結(jié)果表明，產(chǎn)酸較快而蛋白水解程度較低的菌株，能夠使得發(fā)酵乳具有更多的芳香成分以及更強烈的酸味；產(chǎn)酸慢而具有較高蛋白水解能力的菌株，則使得發(fā)酵乳有更多的甲烷、乙醇、有機硫化物成分以及較強的鮮味。相關(guān)性分析驗證后發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌的產(chǎn)酸能力與蛋白水解程度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。綜上所述，本研究從發(fā)酵乳滋氣味的角度出發(fā)，探究了不同發(fā)酵特性的乳酸乳球菌對發(fā)酵乳滋氣味所做的貢獻(xiàn)，為今后研究具體的差異風(fēng)味物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)，也為探究乳酸乳球菌發(fā)酵特性的差異與聯(lián)系提供了新思路。