煙草轉(zhuǎn)錄因子NtMYB4a響應(yīng)干旱、低溫和茉莉酸甲酯脅迫的功能分析

蔣悅，羅倩，姜超英，孫光軍，聶瓊，2*

（1貴州大學(xué)煙草學(xué)院，貴陽 550025；2貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025；3貴州省煙草公司，貴陽 550081）

植物在生長發(fā)育的各個(gè)階段都會受到各種生物或非生物脅迫的影響而導(dǎo)致減產(chǎn)。為了適應(yīng)自然界中的各種脅迫，植物在長期的生存與進(jìn)化中形成了一系列的應(yīng)對措施，從分子、細(xì)胞、生理和生化水平做出適應(yīng)性調(diào)整，以抵御和適應(yīng)脅迫。如積累甜菜堿、脯氨酸等有益代謝產(chǎn)物來維持細(xì)胞內(nèi)的滲透壓平衡，誘導(dǎo)相關(guān)抗逆基因的表達(dá)，合成具有特殊功能的酶等來增強(qiáng)植物的抗逆性［1］。在植物抗逆應(yīng)答過程中，轉(zhuǎn)錄因子起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。當(dāng)植物遭受干旱、低溫、鹽等非生物脅迫時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子會在轉(zhuǎn)錄水平和代謝水平迅速做出響應(yīng)，誘導(dǎo)和調(diào)控脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)［2］。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，大量研究表明其參與非生物脅迫的應(yīng)答和調(diào)控。如過表達(dá)SbMYB15的煙草能夠顯著提高其對PEG模擬干旱和鹽脅迫的耐性［3］；MaMYBR1在香蕉參與響應(yīng)低溫、干旱和鹽脅迫中起著重要的作用［4］；在鹽和熱脅迫下，Os-MYB340在水稻葉和根中的表達(dá)量明顯上調(diào)［5］；過表達(dá)BpMYB4基因能讓白樺在低溫脅迫中產(chǎn)生具有一定的抵抗低溫能力的物質(zhì)［6］；AtMYB49表達(dá)量的增加提高了擬南芥葉片中的Ca2+水平，增強(qiáng)了擬南芥抗氧化能力［7］；在藍(lán)莓愈傷組織中過表達(dá)Vc-MYB4a增強(qiáng)了其對鹽、干旱、寒冷、冷凍和熱脅迫的敏感性［8］。

脯氨酸是植物體內(nèi)最重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，具有維持植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和清除活性氧的作用［9］。在逆境條件下（熱、凍、旱、鹽堿、冷），植物體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加，而脯氨酸的含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性和抗寒性強(qiáng)的品種中往往積累較多的脯氨酸［10］。丙二醛是膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生能加劇膜的損傷，其含量與植物的抗性呈負(fù)相關(guān)［11］。

煙草起源于雨量充沛的熱帶，對生態(tài)環(huán)境非常敏感，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。發(fā)掘煙草中非生物脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子對通過分子生物學(xué)手段增強(qiáng)煙草的抗逆能力具有重要的意義。目前，有關(guān)煙草MYB轉(zhuǎn)錄因子參與非生物脅迫的研究較少。本研究以NtMYB4a過表達(dá)和CRISPR／Cas9敲除株系及其野生型煙株為材料，分析了干旱、低溫和茉莉酸甲酯（MeJA）脅迫下NtMYB4a表達(dá)變化以及脯氨酸和丙二醛含量的差異，探討了NtMYB4a對干旱、低溫和MeJA脅迫的應(yīng)答反應(yīng)和可能參與的抗逆功能，為闡明NtMYB4a的功能和在植物抗逆基因工程中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生型GDH88煙株、NtMYB4a敲除煙株（K）和過表達(dá)煙株（O）為貴州大學(xué)煙草品質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。采用漂浮育苗的方式，將播種的育苗盤置于培養(yǎng)液中于28℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待幼苗長至6片完整葉時(shí)選取長勢一致的壯苗進(jìn)行脅迫處理。分別將培養(yǎng)盤里的培養(yǎng)液換成50μM的MeJA溶液和20% PEG6000進(jìn)行MeJA、模擬干旱處理；放入4℃的光照培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫脅迫處理。對照為28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)液培養(yǎng)的煙苗。每個(gè)處理20株，3次重復(fù)，分別取處理后0、1、3、6、12、24和48 h葉片，分為2份，用液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。

1.2 RNA提取與cDNA合成

以1.1所保存的葉片為材料，采用天根生化科技有限公司的RNAprep pure Plant Kit總RNA提取試劑盒（DP432）提取RNA，采用天根生化科技有限公司的FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑，合成cDNA第一鏈。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以L25（Gen Bank登錄號為L18908）為內(nèi)參，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）測定NtMYB4基因的相對表達(dá)量。根據(jù)其基因序列，采用Primer5軟件設(shè)計(jì)NtMYB4（Gen Bank登錄號為MN_178131）基因（F：5′-GAAGAAAACCAAAGGAAATGAG-3′，R：5′-GCTGCTGTCTGATGAAGAAAC-3′）和內(nèi)參基因L25（F：5′-CCCCTCACCACAGAGTCTGC-3′，R：5′-AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT-3′）的引物。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為：2×Talentl qPCR PreMix 12.5μL；正向引物（10μM）0.75μL；反向引物（10μM）0.75μL；cDNA模板2μL；RNasefree ddH2O 9μL，總量25μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性30 s，94℃變性5 s，55℃退火30 s，39個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算NtMYB4a的相對表達(dá)量。

1.4 脯氨酸和丙二醛的測定

采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量［12］，采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量［13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱（PEG）脅迫下NtMYB4a表達(dá)及脯氨酸和丙二醛含量變化

以野生型煙株為對照，干旱脅迫下，NtMYB4a在過表達(dá)和敲除突變體中的表達(dá)量變化如圖1-A。敲除突變體中NtMYB4a的表達(dá)量在處理前顯著低于對照，干旱處理后，其表達(dá)量呈緩慢上升的趨勢，處理后1 h，表達(dá)量與對照相當(dāng)，處理后48 h達(dá)到最大值，是對照的2.5倍；過表達(dá)突變體中NtMYB4a的表達(dá)量在處理前和處理后都極顯著高于敲除突變體和野生型煙株，相對表達(dá)量在處理后6 h達(dá)到最大值，是對照的2 810倍。

以處理前（0 h）的葉片為對照，過表達(dá)、敲除突變體和野生型煙株中NtMYB4a表達(dá)量的變化如圖1-B。PEG處理后，敲除突變體中NtMYB4a的表達(dá)量迅速升高，在處理后1 h時(shí)達(dá)到最大值，是處理前的5.76倍，之后迅速下降，到處理后3 h又平緩上升。野生型煙株中NtMYB4a表達(dá)量的變化趨勢與敲除突變體一致。而過表達(dá)突變體中NtMYB4a的表達(dá)量在整個(gè)脅迫過程中沒有顯著變化。說明Nt-MYB4a的表達(dá)易受干旱脅迫的誘導(dǎo)，但過表達(dá)后干旱脅迫的影響變小。

干旱（PEG）脅迫處理下，過表達(dá)、敲除突變體和野生型煙株中丙二醛和脯氨酸含量的變化趨勢一致（圖1-C、1-D）。從圖1-C可見，過表達(dá)、敲除突變體和野生型煙株中丙二醛含量都在處理后6 h達(dá)到最大值，之后緩慢下降。敲除突變體的丙二醛含量顯著高于過表達(dá)和野生型煙株，過表達(dá)突變體略低于野生型煙株。從圖1-D可見，過表達(dá)、敲除突變體和野生型煙株中脯氨酸含量均在處理1 h后隨處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)上升—下降—上升的趨勢，處理后48 h達(dá)到最大值。

圖1 NtMYB4a對干旱（PEG）脅迫的響應(yīng)Fig.1 Response of NtMYB4a to drought（PEG）stress

2.2 MeJA脅迫下NtMYB4a表達(dá)及脯氨酸和丙二醛含量變化

以野生型煙株為對照，過表達(dá)和敲除突變體中NtMYB4a表達(dá)量的變化如圖2-A。敲除突變體中NtMYB4a的表達(dá)在處理前低于對照，處理后呈現(xiàn)增加—降低—增加—降低的變化趨勢，且在處理后12 h達(dá)到最大值，是對照的2.1倍。過表達(dá)突變體中NtMYB4a的表達(dá)量在處理前后都極顯著高于敲除突變體和野生型煙株，在處理后6 h達(dá)到最大值，是對照的495倍。

以0 h的過表達(dá)、敲除突變體和野生型煙株為對照，過表達(dá)、敲除突變體和野生型煙株中Nt-MYB4a表達(dá)量的變化如圖2-B。MeJA脅迫處理后，敲除突變體中NtMYB4a表達(dá)量1 h內(nèi)持續(xù)升高，處理后6 h有所回落，之后再次上升，并在48 h表達(dá)量達(dá)到最大值，是對照的9.79倍，其變化趨勢和野生型煙株一致。而過表達(dá)突變體中NtMYB4a表達(dá)量變化呈現(xiàn)平緩的趨勢。說明NtMYB4a的表達(dá)容易受到MeJA脅迫的誘導(dǎo)，過表達(dá)后脅迫的影響變小。

MeJA脅迫處理下，過表達(dá)、敲除突變體和野生型煙株中丙二醛和脯氨酸含量的變化趨勢一致（圖2-C和2-D）。從圖2-C可見，過表達(dá)、敲除突變體和野生型煙株中丙二醛含量在處理后6 h達(dá)到最小值，之后緩慢增加。從圖2-D可見，過表達(dá)、敲除突變體和野生型煙株中脯氨酸含量隨著脅迫時(shí)間的延長呈現(xiàn)增加—降低的趨勢，都在處理后6 h達(dá)到最大值。

圖2 NtMYB4a對MeJA脅迫的響應(yīng)Fig.2 Response of NtMYB4a to MeJA stress

2.3 低溫（4℃）脅迫下NtMYB4a表達(dá)及脯氨酸和丙二醛含量變化

以野生型煙株為對照，過表達(dá)和敲除突變體中NtMYB4a表達(dá)量的變化如圖3-A。敲除突變體中NtMYB4a的表達(dá)量在處理前低于對照，處理后呈緩慢上升的趨勢，處理后3 h與對照相當(dāng)，在處理后12 h達(dá)到最大值，為對照的1.58倍：過表達(dá)突變體中NtMYB4a的表達(dá)量處理前后都顯著高于敲除和野生型煙株，在處理前最高，為對照的235.6倍，處理后表達(dá)量降低。

以處理前（0 h）為對照，過表達(dá)、敲除突變體和野生型煙株中NtMYB4a表達(dá)量的變化如圖3-B。低溫處理后，敲除突變體中NtMYB4a的表達(dá)量迅速增加，在處理后6 h達(dá)到最大值，為對照的10.15倍，之后迅速下降，與野生型煙株中NtMYB4a表達(dá)量的變化趨勢一致。而過表達(dá)突變體處理前后Nt-MYB4a的表達(dá)量無顯著變化。說明NtMYB4a的表達(dá)易受低溫脅迫的誘導(dǎo)，過表達(dá)后脅迫的影響變小。

低溫脅迫處理下過表達(dá)、敲除突變體和野生型煙株丙二醛和脯氨酸含量的變化趨勢不一致（圖3-C和3-D）。從圖3-C可見，敲除突變體丙二醛含量在處理后24 h時(shí)達(dá)到最大值，顯著高于過表達(dá)突變體和野生型煙株，而過表達(dá)突變體丙二醛含量低于野生型煙株。從圖3-D可見，過表達(dá)、敲除突變體和野生型煙株脯氨酸含量隨著處理時(shí)間的延長均呈增加—降低—增加的趨勢，均在處理后48 h達(dá)到最大值。

圖3 NtMYB4a對低溫脅迫的響應(yīng)Fig.3 Response of NtMYB4a to low temperature stress

2.4 NtMYB4a啟動子順式作用元件分析

從NCBI（美國國家生物技術(shù)信息中心）煙草基因組數(shù)據(jù)庫中獲取NtMYB4a起始密碼子上游2 000 bp的序列，利用Plant-CARE數(shù)據(jù)庫對其順式響應(yīng)元件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NtMYB4a啟動子含有多個(gè)作用元件（表1）。其中最多的是參與光反應(yīng)的元件，如ATCT-motif、Box4、G-Box、MRE、MRE和TCTmotif；還含有赤霉素響應(yīng)元件P-box、干旱誘導(dǎo)位點(diǎn)MBS、低溫響應(yīng)元件LTR、厭氧調(diào)節(jié)因子ARE、脫落酸反應(yīng)元件ABRE、60K蛋白結(jié)合位點(diǎn)Unnamed-1、生長素響應(yīng)元件TGA-element、防御和應(yīng)激反應(yīng)元件TC-rich repeats、茉莉酸甲酯（MeJA）反應(yīng)順式作用調(diào)節(jié)元件CGTCA-motif、啟動子和增強(qiáng)子的共同順式作用元件CAAT-box等。表明煙草NtMYB4a的表達(dá)可能受激素、光、低溫、干旱、氧等調(diào)節(jié)。

表1 煙草NtMYB4a啟動子序列分析結(jié)果Table 1 Tobacco NtMYB4a promoter sequence analysis

續(xù)表1

3 討論

低溫和干旱是作物在生長發(fā)育過程中最常見的非生物脅迫，對作物的產(chǎn)量和質(zhì)量有很大的影響。植物受到脅迫時(shí)，外源MeJA能夠激發(fā)防御基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)植物的化學(xué)防御。在所有的生物體內(nèi)都存在轉(zhuǎn)錄因子，它通過控制靶基因的轉(zhuǎn)錄速率來完成生物體的不同代謝過程［14］。當(dāng)生物遭受脅迫時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子上的結(jié)構(gòu)域就會與其他基序結(jié)合抑制或激活轉(zhuǎn)錄以響應(yīng)內(nèi)源或外源脅迫。研究表明，過量表達(dá)BpMYB4可明顯增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和保護(hù)酶系統(tǒng)在白樺樹中的含量［16］；在鹽旱脅迫下，小麥Tamyb31基因在0.5 h就明顯上調(diào)表達(dá)，說明其參與了早期鹽旱脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)［15］。當(dāng)植株遭受脅迫時(shí)，體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸的積累量通常增多，使植株體內(nèi)滲透勢發(fā)生改變，從而提高植株的抗逆性［16］。一般低溫脅迫下抗凍性強(qiáng)的品種脯氨酸的含量顯著高于抗凍性弱的品種［17］。當(dāng)脅迫持續(xù)加劇時(shí)，植物自身保護(hù)酶系統(tǒng)平衡就會被打破，而產(chǎn)生的大量活性氧離子加劇了對細(xì)胞膜的傷害，丙二醛（MDA）等自由基不斷增加，對植物造成毒害作用。因此MDA可以用作間接預(yù)測植物抗逆性的指標(biāo)［18］。

4 結(jié)論

本研究通過對煙草NtMYB4a基因在干旱、Me-JA和低溫脅迫下的表達(dá)分析及對丙二醛和脯氨酸含量的測定，發(fā)現(xiàn)NtMYN4a在不同材料、不同脅迫處理下表達(dá)模式各不相同。過表達(dá)突變體中Nt-MYB4a表達(dá)量很高，在受到脅迫時(shí)反應(yīng)遲鈍，表達(dá)量變化不明顯，且脯氨酸含量最高，丙二醛含量最低；而敲除突變體和野生型煙株中NtMYB4a表達(dá)量本身較低，在受到脅迫時(shí)極其敏感，其表達(dá)量變化波動大且變化趨勢相似。但與野生型煙株相比，敲除突變體脯氨酸含量更低，丙二醛含量更高。在干旱、MeJA和低溫脅迫下，敲除突變體中丙二醛含量高于過表達(dá)突變體和野生型煙株，脯氨酸含量低于過表達(dá)突變體和野生型煙株。隨著處理時(shí)間的延長，敲除突變體NtMYB4a表達(dá)量上升，同時(shí)丙二醛含量呈現(xiàn)下降的趨勢，而脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)則緩慢增加，說明NtMYB4a表達(dá)量的改變增強(qiáng)了煙株的抗逆性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，NtMYB4a的啟動子上有響應(yīng)低溫、干旱、MeJA及其他防御和應(yīng)激反應(yīng)元件。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測NtMYB4a參與了煙草對低溫、干旱、MeJA脅迫的應(yīng)答，可對其在非生物脅迫中的功能及其在煙草抗逆基因工程中的應(yīng)用進(jìn)行進(jìn)一步的研究。