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      狹果茶藨子黃酮提取工藝優(yōu)化及其體外降血脂活性

      2021-02-07 01:53:34李珊劉耀耀劉哲趙永珍馬虎葉英王樹林
      食品研究與開發(fā) 2021年3期
      關(guān)鍵詞:果茶膽酸脂肪酶

      李珊,劉耀耀,劉哲,趙永珍,馬虎,葉英,3*,王樹林,3*

      (1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,青海 西寧 810016;2.青海圣航農(nóng)牧科技開發(fā)有限公司,青海 尖扎 811200;3.青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810016)

      狹果茶藨子(Ribes stenocarpum Maxim.)又稱長(zhǎng)果醋栗,是茶藨子屬的一種植物,主要分布在我國(guó)甘肅、四川、貴州、青海等地區(qū)[1-2]。茶藨子屬植物是我國(guó)藏醫(yī)常用藏藥,青藏高原人民在長(zhǎng)期的生活實(shí)踐中,用茶藨子防治心腦血管疾病和感冒。茶藨子風(fēng)味獨(dú)特、天然無污染,又被稱為“第三代水果”[3],其果實(shí)為漿果,營(yíng)養(yǎng)豐富,加工性能良好,可用作功能性食品的開發(fā)。

      目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)茶藨子屬的黃酮[4]、花青素[5]、生物堿[6]以及脂肪酸類[7]等物質(zhì)進(jìn)行了研究報(bào)道,我國(guó)茶藨子植物品種資源豐富,但對(duì)其活性成分研究還較欠缺,該屬大部分植物無人問津,相關(guān)研究屈指可數(shù)。盧勝明[8]從川西茶藨子地上部分的95%乙醇提取物中分離鑒定了22種化合物,其中所得化合物為新的聯(lián)苯化合物,兩者對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率分別為10.2%(IC50值 1.00 mg/mL)、17.2%(IC50值 1.00 mg/mL);何可群等[9]對(duì)貴州特有的野生茶藨子根的活性化學(xué)成分進(jìn)行了提取分離,得到東莨菪素、濱蒿內(nèi)酯等7個(gè)單體化合物;周霞[10]對(duì)貴州亨利茶藨子粗提物進(jìn)行了抗菌活性研究,測(cè)試結(jié)果表明根皮部分的氯仿提取物對(duì)小麥赤霉病菌的抑制活性達(dá)90.94%。

      青藏高原茶藨子雖然分布廣泛,但大多為野生,目前尚未對(duì)其進(jìn)行有效的開發(fā)利用。因此,為了有效利用青藏高原分布較多的茶藨子資源,充分發(fā)揮其經(jīng)濟(jì)效益,本研究將對(duì)青藏高原狹果茶藨子果實(shí)中黃酮進(jìn)行提取工藝優(yōu)化,并對(duì)其體外降血脂活性進(jìn)行評(píng)價(jià),以期為青藏高原茶藨子植物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      狹果茶藨子:采自青海門源,50℃烘箱烘干48 h,粉碎后過60目篩,備用。

      胰脂肪酶(90 U/mg)、膽酸鈉、?;悄懰徕c、甘氨膽酸鈉:上海阿拉丁生物科技公司;聚酰胺:江蘇長(zhǎng)豐化工有限公司;辛伐他?。涸迄i醫(yī)藥集團(tuán)有限公司;蘆丁、聚乙烯醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯:天津市富宇精細(xì)化工公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

      1.2 儀器與設(shè)備

      UV-2600型紫外分光光度計(jì):日本島津公司;DHG-9031A恒溫振蕩培養(yǎng)箱:上海一恒科學(xué)儀器公司;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠;HH-2恒溫水浴鍋、FA2204電子天平、PHS-3C pH計(jì):上海力辰邦西儀器科技公司。

      1.3 方法

      1.3.1 微波輔助提取狹果茶藨子黃酮單因素試驗(yàn)

      以乙醇為提取溶劑,黃酮得率為指標(biāo),考察提取時(shí)間(4、6、8、10、12 min),微波功率(300、400、500、600、700 W),料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50(g/mL)]對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的影響。

      1.3.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化狹果茶藨子黃酮提取工藝

      根據(jù)單因素結(jié)果,以提取時(shí)間、微波功率、料液比為考察因素,依據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,通過Design Expert V軟件優(yōu)化狹果茶藨子黃酮制備工藝,根據(jù)響應(yīng)面構(gòu)建的三維圖確定微波輔助提取狹果茶藨子黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)[11]。

      1.3.3 狹果茶藨子黃酮粗提物的制備

      按照最優(yōu)工藝條件,稱取一定量狹果茶藨子果粉,提取3次,合并濾液并濃縮至一定體積,依次用石油醚和乙酸乙酯萃取[12],收集有機(jī)相,制備得狹果茶藨子黃酮粗提物。

      1.3.4 狹果茶藨子黃酮富集

      選取聚酰胺樹脂為柱材料,以樹脂與樣品液的料液比1∶20(g/mL)上樣,待上樣吸附24 h后開始梯度洗脫(蒸餾水、20%、40%、60%、80%乙醇溶液及無水乙醇),每個(gè)梯度洗脫至流出液無色為止,毛細(xì)管吸取少量洗脫液點(diǎn)樣于濾紙上,噴涂1%三氯化鋁乙醇液使之顯色[13],于365 nm紫外燈下觀察,收集檢測(cè)斑點(diǎn)顯黃色的洗脫液,濃縮后于-55℃條件下真空冷凍干燥,得純化后狹果茶藨子黃酮固體粉末。

      1.3.5 狹果茶藨子黃酮得率的測(cè)定

      參考白生文等[14]的方法,稱取蘆丁對(duì)照品,加入80%乙醇配制成2 mg/mL的標(biāo)品液,搖勻,再依次移取溶液 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 于 10 mL 容量瓶中,以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉體系進(jìn)行顯色,于505 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,以蘆丁濃度為x軸,對(duì)應(yīng)濃度下吸光值為y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程y=11.735x-0.004(R2=0.999 3),按公式(1)計(jì)算。

      式中:C為黃酮質(zhì)量濃度,mg/mL;V為測(cè)定液體積,mL;N為稀釋倍數(shù);M為樣品質(zhì)量,mg。

      1.3.6 狹果茶藨子對(duì)胰脂肪酶抑制作用

      1.3.6.1 胰脂肪酶活性測(cè)定

      參考朱曉青等[15]的方法。將磷酸緩沖液5mL(pH7.4)和4%聚乙烯醇橄欖油乳化液4 mL加入錐形瓶中,振蕩搖勻后,在40℃反應(yīng)5 min后,加入1 mL 1 mg/mL的酶液,混勻并準(zhǔn)確計(jì)時(shí),在40℃水浴中持續(xù)保溫30 min,結(jié)束后加入15 mL的95%乙醇,滴加1%酚酞指示劑,用0.025 mol/L的NaOH溶液進(jìn)行滴定,記錄消耗體積。空白對(duì)照組水浴后,先加入15 mL的95%乙醇,搖勻,最后加入1 mL酶液,用0.025 mol/L的NaOH溶液對(duì)空白組進(jìn)行滴定,記錄消耗空白組NaOH的體積。

      1.3.6.2 狹果茶藨子對(duì)胰脂肪酶抑制率的測(cè)定

      配制純化前后不同濃度的狹果茶藨子黃酮樣液及辛伐他汀溶液,按1.3.6.1胰脂肪酶活性測(cè)定方法操作,計(jì)算純化前后不同濃度狹果茶藨子黃酮樣液對(duì)胰脂肪酶的抑制率。

      1.3.7 狹果茶藨子對(duì)膽酸鹽的結(jié)合能力

      參考紀(jì)秀鳳等[16]的方法。配制純化前后不同濃度的狹果茶藨子黃酮樣液,分別取1 mL加入3支離心管中,再各加入4 mL的膽酸鈉、?;悄懰徕c和甘氨膽酸鈉溶液(0.3 mmol/L,pH=6.3),恒溫振蕩(37 ℃,1 h),離心(6 000 r/min,10 min),取2.5 mL上清液于玻璃管中,移取7.5 mL 60%硫酸溶液,輕輕混勻,在70℃下反應(yīng)20 min,再冰浴5 min,于387 nm處測(cè)定吸光度值,計(jì)算純化前后狹果茶藨子不同濃度黃酮樣液對(duì)膽酸鹽的結(jié)合率,見公式(3)。

      式中:A0為空白組吸光度值;A1為樣品組吸光度值;A2為對(duì)照組吸光度值。

      1.4 數(shù)據(jù)處理

      所有數(shù)據(jù)采用Excle 2007和SPSS 22.0軟件分析,并以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 微波輔助提取狹果茶藨子黃酮單因素試驗(yàn)結(jié)果

      2.1.1 提取時(shí)間對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的影響

      提取時(shí)間對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的影響見圖1。

      圖1 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.1 Influence of extraction time to the flavonoid yield

      由圖1可知,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),黃酮得率呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢(shì),可能原因是微波長(zhǎng)時(shí)間的作用導(dǎo)致黃酮結(jié)構(gòu)分解,且容易造成其它成分浸出。當(dāng)提取時(shí)間為8 min時(shí),得率達(dá)到最高,故選取時(shí)間為8 min作為最佳提取時(shí)間。

      2.1.2 微波功率對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的影響

      微波功率對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的影響見圖2。

      圖2 微波功率對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Influence of microwave power to the flavonoid yield

      由圖2可知,當(dāng)微波功率小于500 W,狹果茶藨子黃酮得率隨著微波功率的增大呈上升趨勢(shì),而微波功率在500 W時(shí),黃酮得率最大,隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。微波功率過大,導(dǎo)致溫度變化快,可能會(huì)導(dǎo)致黃酮結(jié)構(gòu)降解,甚至引起爆沸現(xiàn)象,從而影響黃酮得率。故狹果茶藨子黃酮提取的最佳微波功率選擇500 W。

      2.1.3 料液比對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的影響

      料液比對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的影響見圖3。

      由圖 3 可知,當(dāng)料液比在 1∶10(g/mL)~1∶30(g/mL)范圍內(nèi),狹果茶藨子黃酮得率隨溶劑體積增大而增高,料液比1∶30(g/mL)時(shí)得率最高,隨后呈下降趨勢(shì),溶劑體積太大,因其它成分溶出而導(dǎo)致黃酮浸出效率變低,也可能會(huì)導(dǎo)致微波熱能負(fù)荷增大,溶劑競(jìng)爭(zhēng)吸收微波能量改變提取的溫度環(huán)境,不利于黃酮的浸出,從而影響黃酮得率。故選擇料液比為1∶30(g/mL)為宜。

      圖3 料液比對(duì)黃酮得率的影響Fig.3 Influence of solid-to-liquid ratio to the flavonoid yield

      2.2 微波輔助提取狹果茶藨子黃酮響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

      2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果和方差分析

      根據(jù)單因素結(jié)果,對(duì)提取時(shí)間(A)、微波功率(B)、料液比(C)進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì),因素水平見表1,試驗(yàn)結(jié)果見表2,方差分析見表3。

      表1 因素水平Table 1 Factors and levels

      表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test results

      表3 二次回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of quadratic regression model

      根據(jù)表2結(jié)果,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析,得回歸模型,擬合得到回歸方程:得率=22.35+0.029A+0.049B+0.12C-0.42AB+0.33AC+0.21BC-0.52A2-0.43B2-0.91C2。由表3可知,失擬項(xiàng)(P=0.859 1>0.05)不顯著,模型呈極顯著水平(P<0.000 1),R2=0.990 8,R2Adj=0.965 8,說明回歸模型有較好的擬合程度,可以用于狹果茶藨子黃酮微波輔助提取的分析和預(yù)測(cè)。表3表明料液比對(duì)狹果茶藨子黃酮得率有顯著影響,提取時(shí)間與微波功率的相互作用、提取時(shí)間與液料比的相互作用、微波功率與液料比的相互作用都極顯著,且A2、B2、C2分別達(dá)到極顯著水平。各因素對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的影響順序?yàn)椋篊>B>A。

      2.2.2 響應(yīng)面分析

      圖4為提取時(shí)間(A)、微波功率(B)、料液比(C)3個(gè)因素間交互作用對(duì)狹果茶藨子黃酮得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖。

      從圖4可以看出,兩兩因素的三維圖較陡,等高線圖都呈橢圓形,說明兩個(gè)因素對(duì)狹果茶藨子黃酮得率影響均顯著。

      2.2.3 最優(yōu)工藝驗(yàn)證

      根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)得最佳提取參數(shù):提取時(shí)間8.11min,微波功率512.32 W,料液比1∶31.60(g/mL),黃酮得率為22.357%?;趦x器、試驗(yàn)條件進(jìn)行修正,即提取時(shí)間 8 min,微波功率 500 W,料液比 1∶30(g/mL),經(jīng)驗(yàn)證得黃酮得率為22.360%,與預(yù)測(cè)值無顯著差異。

      圖4 各因素間交互作用對(duì)狹果茶藨子黃酮得率的等高線和響應(yīng)面圖Fig.4 Contour plots and response surface for the effect of Ribes stenocarpum Maxim.on dissolution quantity of flavonoids

      2.3 狹果茶藨子黃酮富集結(jié)果

      以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定純化前后狹果茶藨子黃酮含量,得粗提物黃酮含量為14%,而經(jīng)純化后黃酮含量為68.72%。說明聚酰胺樹脂對(duì)黃酮有較好的富集效果,可能是因?yàn)榫埘0肥且环N含有酰胺鍵結(jié)構(gòu)的縮聚高分子化合物,可以與含酚羥基的黃酮類物質(zhì)形成氫鍵締合[17]。

      2.4 狹果茶藨子黃酮對(duì)胰脂肪酶抑制作用結(jié)果

      胰脂肪酶與脂肪水解有密切關(guān)系,能催化其生成甘油和脂肪酸,然后在小腸中利用,如果能對(duì)胰脂肪酶活性進(jìn)行抑制,便能減少脂肪水解,從而控制肥胖[18-20]。狹果茶藨子黃酮對(duì)胰脂肪酶抑制作用結(jié)果如圖5所示。

      圖5 胰脂肪酶抑制作用Fig.5 Effect of pancreatic lipase inhibition

      隨著黃酮質(zhì)量濃度的增加,各樣品對(duì)胰脂肪酶抑制率逐漸增大,且純化前后狹果茶藨子黃酮對(duì)胰脂肪酶活性的抑制差異較大,當(dāng)濃度為32 mg/mL時(shí),純化后的胰脂肪酶抑制率達(dá)91.6%,相較于純化前,提高了16.81%,略低于同濃度下辛伐他汀(抑制率93.28%),這可能是因?yàn)楠M果茶藨子粗提物中黃酮類物質(zhì)含量較高[21],使得其本身具有一定的生物活性,而經(jīng)聚酰胺樹脂初步純化后,黃酮含量增大,對(duì)胰脂肪酶的抑制能力增強(qiáng),進(jìn)一步表明狹果茶藨子黃酮可能是抑制胰脂肪酶的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

      2.5 狹果茶藨子對(duì)膽酸鹽結(jié)合能力試驗(yàn)結(jié)果

      2.5.1 純化前后狹果茶藨子黃酮對(duì)膽酸鹽結(jié)合能力的影響

      為研究純化前后狹果茶藨子黃酮對(duì)3種膽酸鹽的結(jié)合能力,以不同膽酸鹽結(jié)合率為指標(biāo),評(píng)價(jià)純化前后狹果茶藨子黃酮的體外降血脂能力。結(jié)果如圖6所示。

      圖6 純化前后狹果茶藨子黃酮對(duì)膽酸鹽結(jié)合率的影響Fig.6 Effect of Ribes stenocarpum Maxim.flavonoids before and after purification on ability of bile salt-binding

      純化前后狹果茶藨子黃酮對(duì)3種膽酸鹽結(jié)合能力具有一定的差異,純化前狹果茶藨子粗提物對(duì)膽酸鈉、牛磺膽酸鈉和甘氨膽酸鈉的結(jié)合率分別為32.97%、42.99%和35.60%,初步判定狹果茶藨子粗提物中含有較強(qiáng)的結(jié)合膽酸鹽的活性成分。經(jīng)聚酰胺樹脂進(jìn)一步純化后,對(duì)膽酸鈉、?;悄懰徕c和甘氨膽酸鈉的結(jié)合率高達(dá)61.71%、86.47%和84.79%,比純化前分別提高了28.74%、43.48%和49.19%,與純化后黃酮含量呈正相關(guān),表明狹果茶藨子黃酮可能是體外結(jié)合膽酸鹽的主要化學(xué)成分。

      2.5.2 狹果茶藨子黃酮質(zhì)量濃度對(duì)膽酸鹽結(jié)合能力的影響

      狹果茶藨子黃酮質(zhì)量濃度對(duì)膽酸鹽的結(jié)合能力結(jié)果如圖7所示。

      圖7 不同狹果茶藨子黃酮質(zhì)量濃度對(duì)膽酸鹽結(jié)合率的影響Fig.7 Effects of Ribes stenocarpum Maxim.flavonoids mass concentration on ability of bile salt-binding

      狹果茶藨子黃酮對(duì)3種膽酸鹽的結(jié)合能力隨質(zhì)量濃度的增大而增加,當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),對(duì)?;悄懰徕c的結(jié)合率最高為96.70%,甘氨膽酸鈉與膽酸鈉的結(jié)合率相當(dāng),分別為92.72%和91.64%,且對(duì)膽酸鈉、?;悄懰徕c和甘氨膽酸鈉的IC50分別為3.301、1.499、1.847 mg/mL,明顯高于5 mg/mL的紅樹莓籽黃酮[22]。此外,這3種膽酸鹽結(jié)合效果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),狹果茶藨子黃酮對(duì)?;悄懰徕c的結(jié)合能力要強(qiáng)于其它兩種膽酸鹽,推測(cè)可能是由于該鹽中含有磺酸基團(tuán),在中性環(huán)境下易發(fā)生離子化,且酸性遠(yuǎn)強(qiáng)于甘氨膽酸鈉和膽酸鈉中的羧基[23],因此更易與黃酮化合物中的酚羥基結(jié)合。說明狹果茶藨子黃酮具有較強(qiáng)的體外結(jié)合膽酸鹽能力,可用作開發(fā)天然降血脂食品原料。

      3 結(jié)論

      本研究首次采用微波輔助提取法結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化狹果茶藨子黃酮提取工藝參數(shù),以胰脂肪酶抑制率、不同膽酸鹽結(jié)合能力為指標(biāo),評(píng)價(jià)純化前后狹果茶藨子黃酮體外降血脂活性。研究結(jié)果表明:狹果茶藨子黃酮微波輔助提取最佳工藝為:微波功率500 W,料液比 1∶30(g/mL),提取時(shí)間 8 min,此條件下黃酮得率為22.36%。相較于純化前,純化后黃酮含量達(dá)68.72%,狹果茶藨子黃酮體外降血脂活性更強(qiáng),對(duì)胰脂肪酶的抑制率最高達(dá)91.6%,比純化前提高了16.81%;對(duì)膽酸鈉、牛磺膽酸鈉和甘氨膽酸鈉的IC50分別為3.301、1.499、1.847 mg/mL,表明黃酮類化合物是狹果茶藨子發(fā)揮作用的主要活性成分,且青藏高原野生茶藨子植物豐富,尚未進(jìn)行有效開發(fā)利用,因此,研究結(jié)果可為茶藨子降血脂功能作用機(jī)制的研究及功能性食品的開發(fā)提供重要的理論支撐,有利于茶藨子資源的進(jìn)一步研究與開發(fā)。

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