李 森 王雨菲 黨世彬 荊林娜 莫 放 張 微

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193)

原位尼龍袋技術(shù)可測(cè)定飼料在反芻動(dòng)物瘤胃中的降解速度和程度，是評(píng)價(jià)反芻動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的一種常用方法，又稱瘤胃尼龍袋法，屬于半體內(nèi)法。與體外法相比，該方法考慮了瘤胃內(nèi)環(huán)境、食糜外流速率，使檢測(cè)結(jié)果更接近體內(nèi)法；與體內(nèi)法相比，該方法所需樣品少、操作簡(jiǎn)單、測(cè)定迅速、成本低、重復(fù)性好。自1979年?rskov等[1]提出第一動(dòng)力學(xué)模型，并擬合得到飼料蛋白質(zhì)瘤胃動(dòng)態(tài)降解參數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)飼料瘤胃降解情況，極大地推動(dòng)了瘤胃尼龍袋法由靜態(tài)研究向動(dòng)態(tài)研究方向的發(fā)展，也使得該方法近40年里在世界上被廣泛應(yīng)用。雖然瘤胃尼龍袋法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，但是在不同實(shí)驗(yàn)室之間，甚至在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部，瘤胃尼龍袋法測(cè)定結(jié)果存在差異，需要對(duì)此方法進(jìn)行規(guī)范或標(biāo)準(zhǔn)化[2]。國(guó)際上有一些關(guān)于用瘤胃尼龍袋法測(cè)定瘤胃降解率的標(biāo)準(zhǔn)程序或者建議方案(?rskov[3]、AFRC[4]、Madsen等[5]、Wilkerson等[6])，在國(guó)內(nèi)，馮仰廉等[7]提出了在牛上用瘤胃尼龍袋法評(píng)定飼料蛋白質(zhì)降解率的建議方案，并不完全適用于羊。本實(shí)驗(yàn)室曾對(duì)飼糧精粗比、投放方式、沖洗方法、飼喂頻率、投袋時(shí)間、樣品重等因素對(duì)瘤胃尼龍袋法測(cè)定飼料瘤胃降解特性的影響有過(guò)相關(guān)研究[8-9]。目前，國(guó)內(nèi)在新尼龍袋使用之前有幾種處理方法：不浸泡、用水浸泡、瘤胃中浸泡，其中在瘤胃中浸泡的較多。我們推測(cè)新尼龍袋在瘤胃中浸泡，瘤胃食糜可能會(huì)在尼龍袋的表面堆積，尼龍袋的孔徑可能會(huì)堵塞，進(jìn)而影響飼料的瘤胃降解率，即使經(jīng)過(guò)洗滌程序也不能完全洗凈。因此，本試驗(yàn)通過(guò)使用瘤胃預(yù)浸泡和未浸泡的新尼龍袋，分批測(cè)定玉米、豆粕、麥秸、黑麥干草4種常用飼料中干物質(zhì)(DM)和粗蛋白質(zhì)(CP)在瘤胃內(nèi)的動(dòng)態(tài)降解率，研究新尼龍袋使用前在瘤胃中浸泡與不浸泡是否會(huì)影響飼料的瘤胃降解特性，以期為羊上瘤胃尼龍袋法相關(guān)規(guī)程或標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選用3周歲、體重64.9～72.1 kg、體質(zhì)接近、健康狀況良好、進(jìn)行正常驅(qū)蟲和免疫并且裝有永久性瘤胃瘺管的云南半細(xì)毛羊公羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物。

1.2 飼糧配制與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)所用飼糧參考1.3倍NRC(2007)[10]維持營(yíng)養(yǎng)需要配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。飼糧精粗比為3∶7，日采食量分別為：精料0.48 kg，豆糠0.72 kg，青貯1.14 kg(含水量65%)，每天07：00和17：00分2次等量飼喂，先喂青貯，采食完后再飼喂混合均勻的精料和豆糠，料水比為1∶1。試驗(yàn)期間，單欄飼養(yǎng)，保證自由飲水。定期打掃圈舍和護(hù)理瘤胃瘺管。試驗(yàn)前空腹稱重，每期試驗(yàn)包含預(yù)試期7 d，正試期3 d。每期試驗(yàn)結(jié)束后，試驗(yàn)羊休息2 d。試驗(yàn)于昆明易興恒畜牧科技有限公司羊場(chǎng)進(jìn)行。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。選擇300目(孔徑48 μm)的新尼龍布，規(guī)格為6 cm×10 cm。試驗(yàn)組中新尼龍袋使用前在瘤胃中浸泡72 h，取出后沖洗、烘干恒重、編號(hào)備用。對(duì)照組中新尼龍袋用清水沖洗后使用(烘干至恒重、編號(hào)備用)。選取體重相近、健康狀況良好的裝有永久性瘤胃瘺管的云南半細(xì)毛羊公羊8只，隨機(jī)分為2組(對(duì)照組和試驗(yàn)組)，每組4只，分批對(duì)玉米、豆粕、麥秸、黑麥干草4種飼料中DM和CP在瘤胃內(nèi)的動(dòng)態(tài)降解率進(jìn)行測(cè)定。待測(cè)樣品粉碎并通過(guò)8目篩，使用前65 ℃烘8 h，回潮24 h，稱取精料4.0 g或者粗料2.5 g左右放入已知重量的尼龍袋中。每2個(gè)袋子作為平行，4只羊?yàn)?個(gè)重復(fù)。尼龍袋系在內(nèi)徑為3 mm、長(zhǎng)25 cm的半軟塑料管底部，橡皮筋固定，確保樣品不丟失、尼龍袋不脫落。試驗(yàn)采用“同時(shí)投入，依次取出”的方法。于07：00飼喂前投入瘤胃腹囊，精料于2、4、8、16、24、36、48 h從瘤胃瘺管中取出，粗料于4、8、16、24、36、48、72 h從瘤胃瘺管中取出，并立即用兒童洗衣機(jī)(長(zhǎng)虹XPB30-875S，3 kg)，標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下最高水位沖洗3次，每次5 min，換水3次。將洗凈的尼龍袋放入65 ℃的烘箱中烘48 h至恒重，稱取尼龍袋及殘?jiān)闹亓?，并將尼龍袋中瘤胃未降解的殘?jiān)占谧苑獯４郎y(cè)樣品的DM和CP含量見表2。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.4 指標(biāo)測(cè)定與計(jì)算

1.4.1 DM和CP含量測(cè)定

DM和CP含量按照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》(第3版)[11]中方法進(jìn)行測(cè)定。其中DM含量使用恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏)測(cè)定，CP含量使用FOSS半自動(dòng)凱式定氮儀(北京福斯)測(cè)定。

表2 待測(cè)樣品的DM和CP含量(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.4.2 瘤胃降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)估計(jì)

首先根據(jù)公式計(jì)算飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在不同時(shí)間點(diǎn)的實(shí)時(shí)瘤胃降解率：

某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不同時(shí)間點(diǎn)的實(shí)時(shí)瘤胃降解率(%)=
[(降解前袋內(nèi)該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量-降解后袋內(nèi)
該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量)/降解前袋內(nèi)該
營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量]×100。

飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的實(shí)時(shí)瘤胃降解率符合指數(shù)曲線：

dp=a+b(1-e-ct)。

式中：dp為t時(shí)刻某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的實(shí)時(shí)瘤胃降解率(%)；a為該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的快速降解部分(%)；b為該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的慢速降解部分(%)；c為該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)慢速降解部分的降解速率(%/h)；t為飼料在瘤胃內(nèi)停留的時(shí)間(h)。

利用各時(shí)間點(diǎn)的實(shí)時(shí)瘤胃降解率和時(shí)間，計(jì)算a、b和c值。

1.4.3 飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)瘤胃有效降解率的計(jì)算

采用下式計(jì)算飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的瘤胃有效降解率：

ED=a+b×c/(c+k)。

式中：ED為某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的有效降解率(%)；a為該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的快速降解部分(%)；b為該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的慢速降解部分(%)；c為該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)慢速降解部分的降解速率(%/h)；k為瘤胃外流速率(%/h)，本試驗(yàn)對(duì)干草類飼料的瘤胃外流速率取3.14%/h[12]，精料取5%/h[3]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用Excel 2010初步整理后，用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件中NLIN程序計(jì)算a、b、c值，降解率和降解參數(shù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 新尼龍袋使用前瘤胃浸泡處理對(duì)玉米DM和CP瘤胃降解特性的影響

由表3可知，試驗(yàn)組玉米DM 4、8和24 h的瘤胃降解率以及潛在降解部分顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其他各時(shí)間點(diǎn)的瘤胃降解率和降解參數(shù)與對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)組玉米CP僅36 h的瘤胃降解率和潛在降解部分顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，DM和CP其他各時(shí)間點(diǎn)的瘤胃降解率和降解參數(shù)與對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)組玉米DM和CP的有效降解率低于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)。

表3 新尼龍袋使用前瘤胃浸泡處理對(duì)玉米DM和CP瘤胃降解特性的影響

續(xù)表3項(xiàng)目Items干物質(zhì) DM對(duì)照組Control group試驗(yàn)組Test groupP值P-value粗蛋白質(zhì) CP對(duì)照組Control group試驗(yàn)組Test groupP值P-value24 h79.79±1.64a72.44±2.65b0.00949.82±1.6149.54±3.660.92636 h81.04±4.3578.05±3.940.05474.14±5.41a60.07±4.90b0.02948 h88.04±1.6586.20±1.140.11673.84±5.6667.88±4.200.093瘤胃降解參數(shù) Ruminal degradation parameters快速降解部分 a/%30.93±2.5627.82±1.620.08516.35±3.2218.56±2.080.078慢速降解部分 b/%61.75±1.6460.77±1.290.38272.75±6.0165.35±6.840.030慢速降解部分的降解速率 c/(%/h)5.07±1.235.87±1.150.9984.32±1.074.22±2.070.934潛在降解部分 a+b/%92.68±2.30a88.59±1.70b0.02889.10±1.20a83.91±1.36b0.012有效降解率 ED/%62.02±2.4060.63±2.140.06350.07±3.7948.47±2.700.338

2.2 新尼龍袋使用前瘤胃浸泡處理對(duì)豆粕DM和CP降解特性的影響

由表4可知，新尼龍袋使用前瘤胃浸泡處理與否對(duì)豆粕DM和CP的瘤胃降解特性無(wú)顯著影響(P>0.05)。DM和CP的瘤胃有效降解率均以試驗(yàn)組低于對(duì)照組。

表4 新尼龍袋使用前瘤胃浸泡處理對(duì)豆粕DM和CP瘤胃降解特性的影響

2.3 新尼龍袋使用前瘤胃浸泡處理對(duì)麥秸DM和CP瘤胃降解特性的影響

由表5可知，試驗(yàn)組麥秸DM 16 h的瘤胃降解率、CP 8 h的瘤胃降解率均與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，DM和CP其他時(shí)間點(diǎn)的瘤胃降解率與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)組麥秸DM的所有瘤胃降解參數(shù)以及CP的慢速降解部分和慢速降解部分的降解速率與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，但麥秸CP的快速降解部分、潛在降解部分與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。試驗(yàn)組麥秸DM的有效降解率與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，但CP的有效降解率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表5 新尼龍袋使用前瘤胃浸泡處理對(duì)麥秸DM和CP瘤胃降解特性的影響

2.4 新尼龍袋使用前瘤胃浸泡處理對(duì)黑麥干草DM和CP瘤胃降解特性的影響

由表6可知，試驗(yàn)組僅黑麥干草DM的慢速降解部分的降解速率、潛在降解部分與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，DM和CP其他各時(shí)間點(diǎn)的瘤胃降解率、降解參數(shù)和有效降解率均與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表6 新尼龍袋使用前瘤胃浸泡處理對(duì)黑麥干草DM和CP瘤胃降解特性的影響

續(xù)表6項(xiàng)目Items干物質(zhì) DM對(duì)照組Control group試驗(yàn)組Test groupP值P-value粗蛋白質(zhì) CP對(duì)照組Control group試驗(yàn)組Test groupP值P-value慢速降解部分 b/%56.29±2.1353.80±1.290.09245.01±1.9448.44±1.330.223慢速降解部分的降解速率 c/(%/h)3.50±0.31b4.51±0.34a0.0047.01±0.418.02±1.370.209潛在降解部分 a+b/%73.92±1.89a69.07±1.01b0.00480.54±1.4280.46±1.860.943有效降解率 ED/%47.30±0.5146.98±0.840.61966.62±0.7166.82±2.250.903

3 討 論

本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定玉米、豆粕、麥秸、黑麥干草4種飼料使用瘤胃預(yù)浸泡和未浸泡的新尼龍袋在瘤胃中的降解特性發(fā)現(xiàn)，玉米、豆粕、黑麥干草DM和CP的有效降解率在試驗(yàn)組和對(duì)照組之間均沒有出現(xiàn)顯著差異，試驗(yàn)組麥秸DM的有效降解率與對(duì)照組無(wú)顯著差異，但CP的有效降解率顯著高于對(duì)照組。另外，對(duì)于玉米、豆粕2種精料，試驗(yàn)組DM和CP的有效降解率均低于對(duì)照組；對(duì)于麥秸、黑麥干草2種粗飼料，試驗(yàn)組DM的有效降解率低于對(duì)照組，CP的有效降解率高于對(duì)照組。這說(shuō)明新尼龍袋使用前瘤胃浸泡與否對(duì)精、粗飼料的影響不同。

在瘤胃尼龍袋法程序中，新尼龍袋使用前有不同的處理方式，分別為用清水沖洗、用清水浸泡、在瘤胃中浸泡。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，?rskov[3]、Madsen等[5]、高新梅等[13]、李洪濤[14]、李海文等[15]在文章中沒有提到試驗(yàn)之前尼龍袋是怎么處理的；Wilkerson等[6]、馮仰廉[16]、孟春花等[17]、靳玲品等[18]、朱亞駿等[19]、汪水平等[20]是在新尼龍袋使用前在瘤胃中浸泡72 h，取出后洗凈、烘干、編號(hào)備用；王文奇等[21]、吳仙等[22]是在新尼龍袋使用前投入瘤胃中浸泡24 h，再取出洗凈、烘干、檢查有無(wú)破損、編號(hào)備用；李志威等[23]則是在新尼龍袋使用前用自來(lái)水浸泡沖洗、烘干恒重、編號(hào)備用?？梢钥闯?，關(guān)于新尼龍袋使用之前的預(yù)處理存在差異。新尼龍袋使用之前在瘤胃中預(yù)浸泡理論上可以增強(qiáng)微生物對(duì)待測(cè)飼料的及時(shí)接觸，尤其是對(duì)在瘤胃中培養(yǎng)時(shí)間短的樣品來(lái)說(shuō)[24]；但是，新尼龍袋使用前在瘤胃中浸泡之后，即使進(jìn)行了仔細(xì)的洗滌程序，一些瘤胃食糜和殘?jiān)匀粫?huì)吸附在尼龍袋表面，堵塞尼龍袋的孔徑，通過(guò)影響瘤胃微生物和待測(cè)底物的充分接觸，進(jìn)而影響飼料瘤胃降解率。這可能是試驗(yàn)組玉米、豆粕DM和CP以及麥秸和黑麥干草DM的有效降解率低于對(duì)照組的原因；至于試驗(yàn)組麥秸CP的有效降解率顯著高于對(duì)照組，可能與粗飼料本身DM的降解率低及飼料性質(zhì)有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

另外，Weakley[25]認(rèn)為，瘤胃尼龍袋中的樣品在瘤胃發(fā)酵過(guò)程中容易發(fā)生粘連現(xiàn)象，造成袋子孔隙的堵塞。我們推測(cè)重復(fù)利用會(huì)導(dǎo)致尼龍袋表面附著物的大量積累，孔徑堵塞增多并導(dǎo)致孔徑變小，影響飼料的瘤胃降解率。如果尼龍袋打算后續(xù)多次使用，那么新尼龍袋在第1次使用前浸泡，可以減小后續(xù)利用帶來(lái)的差異；如果新尼龍袋僅打算使用1次，那么使用前無(wú)需在瘤胃中浸泡處理。

4 結(jié) 論

利用瘤胃尼龍袋法測(cè)定羊常用飼料DM和CP的瘤胃降解特性時(shí)，新尼龍袋瘤胃預(yù)浸泡處理僅對(duì)麥秸CP的有效降解率產(chǎn)生顯著差異。由此建議，若新尼龍袋只使用1次，可以不在瘤胃中浸泡。