于曉航 朱晗 陳宏健 魏原芝 周楊 郝德君

(南京林業(yè)大學，南京，210037)

昆蟲作為動物界最為繁盛的類群，種類繁多，形態(tài)各異[1]。其中鱗翅目作為昆蟲綱第二大目，數(shù)量約占昆蟲總數(shù)的16%，包括多種危害嚴重的農(nóng)、林業(yè)害蟲[2]。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學技術在腸道微生態(tài)學上的應用，國內(nèi)外對鱗翅目昆蟲腸道菌群的研究也日益增加[3-4]。研究表明，鱗翅目昆蟲腸道菌群可以協(xié)助代謝，吸收利用營養(yǎng)物質(zhì)以增強宿主的環(huán)境適應性。在以甘蔗為食的小蔗桿草螟(Diatraeasaccharalis)的腸道中可以分離出能夠水解纖維素類化合物的細菌[5]。腸道菌還能降解殺蟲劑、植物有毒次生代謝物，如小菜蛾(Plutellaxylostella)腸道中的蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)能夠降解殺蟲劑茚蟲威[6]，舞毒蛾(Lymantriadispar)腸道中的不動桿菌屬(Acinetobacter)細菌能夠降解楊樹中的酚苷類化合物[7]。此外，腸道菌還能抵御外來病原的入侵和定殖，提高宿主免疫反應[8]，如?；页嵋苟?Spodopteralittoralis)腸道中定殖的蒙氏腸球菌能夠分泌細菌素，抑制腸球菌屬幾種潛在病原菌的定殖[9]。

由于昆蟲腸道的結(jié)構和理化環(huán)境獨特，導致腸道細菌群落復雜、功能多樣[10]。因此，研究昆蟲腸道細菌群落結(jié)構及其功能，為探究昆蟲與共生細菌相互適應、協(xié)同進化、物種分化，以及在宿主免疫及代謝機制等方面具有重要理論價值，同時也對闡明農(nóng)林重要害蟲的致病機理，探索應用腸道細菌的害蟲防治新技術有重要的指導意義[11-12]。

仁扇舟蛾(Closterarestitura)屬鱗翅目(Lepidoptera)舟蛾科(Notodontidae)扇舟蛾屬(Clostera)，為柳屬(Salix)、楊屬(Populus)植物的主要食葉害蟲。主要分布于我國長江流域以南地區(qū)，國外分布于印度、越南、馬來西亞、印度尼西亞等國家[13-14]。仁扇舟蛾具有取食量大、繁殖力強、幼蟲孵化率高、世代周期短等特點，危害嚴重時可迅速將整株葉片取食干凈，影響寄主植物的光合作用，進而導致樹木生長緩慢，甚至死亡[15]。仁扇舟蛾與寄主楊樹互作關系的研究表明，外源施用茉莉酸甲酯(MeJA)可以誘導寄主楊樹營養(yǎng)物質(zhì)及次生代謝物質(zhì)的變化，降低仁扇舟蛾生長速率，延長幼蟲和蛹的發(fā)育歷期。幼蟲取食MeJA處理的葉片后，誘導谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、羧酸酯酶(CarE)等解毒酶的產(chǎn)生[16]。在其他舟蛾科食葉害蟲與寄主植物互作研究中發(fā)現(xiàn)，昆蟲的取食危害能夠誘導寄主植物的防御反應[17-18]。然而，腸道細菌在取食楊樹的舟蛾類食葉害蟲與寄主植物相互關系中的調(diào)控作用尚未見研究報道。因此，本研究以仁扇舟蛾作為研究對象，通過高通量測序技術分析仁扇舟蛾幼蟲前、中、后腸細菌群落結(jié)構的多樣性，為后續(xù)研究共生細菌在調(diào)控仁扇舟蛾與寄主植物互作關系中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

仁扇舟蛾2～3齡幼蟲采自南京市浦口區(qū)烏江鎮(zhèn)(118°52′E，31°89′N)楊樹行道樹，帶回實驗室后置于晝夜光周期比為14∶10，溫度(25±2)℃，相對濕度為(65±5)%的條件下飼養(yǎng)，喂食新鮮的楊樹葉片，每日更換1次。以實驗室飼養(yǎng)的第2代5齡幼蟲作為供試昆蟲。

1.2 腸道解剖及細菌總DNA提取

選取50頭健康的5齡幼蟲，饑餓處理12 h后，用PBS緩沖液沖洗蟲體表面多次，置于體積分數(shù)為75%酒精中體表消毒3 min，并用無菌水漂洗3次。無菌條件下解剖腸道，將分離的前、中、后腸分別置于2 mL離心管中，5個重復。用細菌基因組DNA提取試劑盒(艾科瑞生物工程有限公司)分別提取前、中、后腸細菌總DNA，采用超微分光光度計(Nanodrop 2000C)測定DNA質(zhì)量濃度，然后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質(zhì)量。

1.3 腸道細菌16S rDNA高通量測序

以提取的細菌總DNA為模板，采用16S rDNA基因V4區(qū)引物(515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’，806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)擴增仁扇舟蛾腸道細菌序列。用Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer進行PCR擴增。PCR反應體系為30 μL：Phusion Master Mix(2×)15.0 μL，gDNA(1 ng·μL-1)10.0 μL，Primer 515F(2 μM)和Primer 806R(2 μM)各1.5 μL，ddH2O 2 μL。PCR反應條件為98 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s；50 ℃退火30 s；72 ℃復性30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，選擇主條帶大小在400～450 bp的序列進行切膠回收。利用GeneJET膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化。用NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒構建文庫，同時進行Qubit定量分析及文庫檢測，樣品檢測合格后，利用HiSeq測序平臺進行測序。

1.4 序列數(shù)據(jù)獲取

使用FLASH軟件對樣品的讀長片段進行拼接，即獲得原始標簽數(shù)據(jù)，過濾處理得到高質(zhì)量的標簽數(shù)據(jù)。參照Qiime的標簽質(zhì)控操作，過濾尾部質(zhì)量值20以下的堿基，進一步過濾長度小于75%的標簽數(shù)據(jù)，利用UCHIME算法及Gold數(shù)據(jù)庫進行比對，檢測標簽序列中的嵌合體序列，去除嵌合體序列，即可得到試驗所需的有效數(shù)據(jù)。利用Uparse軟件(Version 7.0.1090)對仁扇舟蛾幼蟲樣品的有效序列進行聚類分析，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，同時選出OTUs的代表性序列。

根據(jù)RDP Classifier(Version 2.11)及Green Gene數(shù)據(jù)庫對OTUs代表序列進行物種注釋(設定閾值為0.8～1.0)，并分別在門，綱，目，科，屬分類水平上統(tǒng)計各腸段的群落組成。

1.5 腸道細菌群落多樣性計算方法

α多樣性反映細菌群落的豐度、多樣性，通過Qiime軟件(Version 1.9.1)計算群落豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù)、Ace指數(shù))、群落多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))、群落覆蓋度指數(shù)(Coverage指數(shù))。使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線。β多樣性分析樣本間群落結(jié)構的相似性及差異性。根據(jù)樣品的物種注釋結(jié)果和OTUs豐度信息，將相同分類的OTUs信息合并處理得到物種豐度信息表，然后依據(jù)OTUs之間的系統(tǒng)發(fā)生關系，利用Qiime軟件計算Weighted Unifrac距離，構建UPGMA樣品聚類樹。使用R軟件進行PCoA分析及作圖。使用LEfSe找出不同樣本間具有顯著性差異的群落、物種，根據(jù)線性判別分析(LDA=4)估算每個物種豐度對差異效果影響的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 仁扇舟蛾腸道細菌16S rDNA序列拼接與組裝

從仁扇舟蛾5齡幼蟲前、中、后腸15個樣品中共獲得125494條高質(zhì)量的細菌16S rDNA序列，按97%的相似度進行OTU聚類(表1)，根據(jù)OTUs的注釋，結(jié)果顯示，共注釋到26個門，78個綱，142個目，267個科，392個屬。

表1 仁扇舟蛾腸道細菌16S rDNA序列分析

2.2 仁扇舟蛾幼蟲前、中、后腸細菌種類

仁扇舟蛾幼蟲腸道主要由變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、藍細菌門(Cyanobacteria)細菌構成。其中，前腸細菌的優(yōu)勢門為變形菌門、藍細菌門；中腸細菌的優(yōu)勢門為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門；后腸細菌的優(yōu)勢門為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門。

前、中、后腸細菌菌群在目水平的種類及豐度見圖1。可以看出前腸豐度較高的目為腸桿菌目(Enterobacteriales)、鏈形植物目(Streptophyta)、立克次氏體目(Rickettsiales)；中腸為芽孢桿菌目(Bacillales)、交替單胞菌目(Alteromonadales)、酸微菌目(Acidimicrobiales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、擬桿菌目(Bacteroidales)、梭菌目(Clostridiales)、紅桿菌目(Rhodobacterales)、螺菌目(Oceanospirillales)、Solirubrobacterales、乳酸桿菌目(Lactobacillales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、放線菌目(Actinomycetales)、脫硫弧菌目(Desulfovibrionales)、蓋勒氏菌目(Gaiellales)；后腸豐度較高的目為黃桿菌目(Flavobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、紅螺菌目(Rhodospirillales)、黏球菌目(Myxococcales)、黃單胞菌目(Xanthomonadales)、噬纖維菌目(Cytophagales)、硫發(fā)菌目(Thiotrichales)、脫硫桿菌目(Desulfobacterales)、硝化螺旋菌目(Nitrospirales)、嗜氫菌目(Hydrogenophilales)、著色菌目(Chromatiales)、除硫單胞菌目(Desulfuromonadales)。

圖中左側(cè)為物種聚類樹；上方為樣品組間聚類樹；下方為樣品信息；右側(cè)為物種注釋信息；右側(cè)圖例為門水平注釋信息，圖中顏色變化代表物種在不同樣本中的豐度變化情況，紅色表示高豐度；藍色表示低豐度。

由圖2可知，在屬水平上，前腸細菌的菌群主要有鏈形植物(Streptophyta，52.78%)、Mitochoncdria(9.98%)、腸桿菌屬(Enterobacter，9.88%)、鹽單胞菌屬(Halomonas，6.22%)、毛螺旋菌屬(Lachnospira，1.84%)、希瓦氏菌屬(Shewanella，1.52%)、擬桿菌屬(Bacteroides，1.20%)；中腸細菌的菌群主要有鹽單胞菌屬(18.34%)、Streptophyta(8.42%)、腸桿菌屬(6.44%)、希瓦氏菌屬(5.00%)、擬桿菌屬(4.80%)、毛螺旋菌屬(4.26%)、不動桿菌屬(Acinetobacter，4.00%)、芽孢桿菌屬(Bacillus，2.70%)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter，2.02%)、S24-7(1.82%)、羅斯氏菌屬(Roseburia，1.10%)、顫螺旋菌屬(Oscillospira，1.06%)、假單胞菌屬(pseudomonas，1.02%)；后腸細菌的主要的菌群為假單孢菌屬(10.88%)、Streptophyta(10.08%)、鹽單胞菌屬(5.72%)、腸桿菌屬(4.26%)、希瓦氏菌屬(1.96%)、芽孢桿菌屬(1.40%)、毛螺旋菌屬(1.26%)、Sphingopyxis(1.32%)。

圓圈中不同顏色表示不同的腸段，對應左側(cè)圖例；扇形大小表示在此分類水平該細菌在不同腸段的相對豐度大?。环诸惷Q下方的數(shù)字表示在該分類水平的平均相對豐度百分率，前者表示占所有物種的百分率，后者表示占所選取物種的百分率。

2.3 仁扇舟蛾幼蟲腸道細菌α多樣性

仁扇舟蛾前、中、后腸樣本的Shannon指數(shù)隨著測序深度的增加，數(shù)值皆趨于平緩(表2)，且各樣品的覆蓋度都在97%以上(表3)，表明測序數(shù)據(jù)足夠，可以反映群落多樣性。

表2 仁扇舟蛾腸道細菌Shannon指數(shù)

α多樣性反映樣本中細菌群落的物種多樣性及豐富度。Shannon指數(shù)反映群落的多樣性，Shannon指數(shù)數(shù)值越大，說明群落多樣性越高；Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)反映樣品中群落的豐富度，兩者數(shù)值越大，表明群落豐富度越高。由表3可知，中腸的Shannon指數(shù)最高，后腸次之，前腸最低，表明中腸細菌的物種多樣性最高，前腸最低。對于Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)，后腸最高，中腸次之，前腸最低，表明后腸的豐富度最高，中腸次之，前腸最低。

表3 仁扇舟蛾腸道細菌α多樣性指數(shù)

2.4 仁扇舟蛾腸道細菌β多樣性

β多樣性反映不同樣本間群落結(jié)構的相似性及差異性。通過樣本層級聚類分析研究不同樣本間細菌群落組成的相似性。運用Weighted Unifrac距離矩陣，對仁扇舟蛾幼蟲前、中、后腸樣本進行聚類分析，構建聚類樹。從圖3可以看出，仁扇舟蛾幼蟲不同腸段細菌群落結(jié)構物種組成相似，但豐度不同，其中中腸、后腸的細菌群落結(jié)構差異較小。

圖3 仁扇舟蛾腸道細菌Weighted Unifrac UPGMA聚類樹

通過PCoA主坐標分析樣品間群落結(jié)構的差異。根據(jù)Weighted Unifrac距離算法進行PCoA主坐標分析。由圖4可知，主坐標軸PC1、PC2的解釋度分別為57.3%、20.21%。從圖中各樣本的分布可以看出，仁扇舟蛾幼蟲前、中、后腸不同腸段間細菌群落結(jié)構存在差異，不同腸段樣本點聚在一起。后腸H1與其他4個樣品相似度偏低，前腸F4、F5與其他3個樣品相似度也偏低。

圖4 仁扇舟蛾腸道細菌Weighted Unifrac PCoA圖

2.5 仁扇舟蛾腸道細菌不同分類水平的差異菌群比較

為確定仁扇舟蛾前、中、后腸不同樣本中的特定細菌群落，使用LEfSe差異分析檢測具有顯著豐度差異的類群，采用線性判別分析(LDA=4)估算每個物種豐度對差異效果影響的大小。結(jié)果如圖5所示，中腸的差異菌群最多，有放線菌門、放線菌綱、放線菌目、微球菌科(Micrococcaceae)；擬桿菌綱(Bacteroidia)、擬桿菌目、擬桿菌科(Bacteroidaceae)；厚壁菌門、芽孢桿菌綱(Bacilli)、芽孢桿菌目、芽孢桿菌科(Bacillaceae)；梭菌綱(Clostridia)、梭菌目、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、疣微菌科(Ruminococcaceae)；交替單胞菌目、希瓦氏菌科(Shewanellaceae)；螺菌目、鹽單胞菌科(Halomonadaceae)；莫拉氏菌科(Moraxellaceae)。前腸差異菌群有藍細菌門、葉綠體、鏈形植物目(Streptophyta)；立克次氏體目。后腸差異菌群為δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)；假單胞菌目、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)。

圖中由內(nèi)至外的圓圈代表由門至種的分類級別，在不同分類級別的每一個小圓圈代表該水平下的1個分類；小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比，黃色表示無顯著差異的物種，紅色、藍色、綠色節(jié)點分別表示在前腸、中腸、后腸樣本中具有顯著差異的物種。

3 結(jié)論與討論

隨著分子生物學技術的發(fā)展，基因序列分析技術等方法被廣泛引入到腸道微生物學的研究中[19-20]，其中16S rDNA序列以及宏基因組測序技術的發(fā)展極大地促進共生微生物群落結(jié)構及其組成的測定、功能基因的篩選及共生微生物與宿主相互關系等方面的研究[21-22]。

本研究根據(jù)Illumina HiSeq技術對仁扇舟蛾5齡幼蟲前、中、后腸細菌進行高通量測序，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢菌門有變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門。在鱗翅目昆蟲腸道菌群的相關研究中，大多數(shù)細菌都屬于變形菌門、厚壁菌門、放線菌門[4]。夜蛾科腸道菌群以變形菌門、厚壁菌門、放線菌門為主[23]；舞毒蛾中腸菌群為γ-變形菌門、α-變形菌門、放線菌門、擬桿菌門細菌[24]；家蠶(Bombyxmori)腸道優(yōu)勢菌門主要是厚壁菌門、變形菌門[25]；同為舟蛾科的櫟黃掌舟蛾(Phaleraassimilis)腸道優(yōu)勢菌群也以變形菌門、厚壁菌門為主[26]。在門水平上，仁扇舟蛾前、中、后腸的優(yōu)勢菌群在組成上基本一致，但豐度具有一定的差異。在前腸中發(fā)現(xiàn)大量的藍細菌門、葉綠體的序列，推測原因是仁扇舟蛾腸道內(nèi)殘存了破碎的植物組織，而植物細胞內(nèi)的葉綠體核酸能夠被細菌16S rDNA基因通用引物擴增，形成大量藍細菌門微生物序列，此問題在植食性昆蟲腸道菌群研究中十分普遍[27]，故在分析仁扇舟蛾腸道細菌群落結(jié)構時，應排除藍細菌門的影響。在目水平上，中腸、后腸的優(yōu)勢菌目較為豐富，而前腸的優(yōu)勢菌目較少。在屬水平上，各腸段的優(yōu)勢屬組成、豐度有所差異。腸桿菌屬在前腸(9.88%)、中腸(6.44%)、后腸(4.26%)的豐度逐漸降低；鹽單胞菌屬在中腸的豐度最高，占18.34%，前腸(6.22%)、后腸(5.72%)的豐度較低；毛螺旋菌屬、希瓦氏菌屬在中腸的豐度最高，前腸、后腸的豐度較低；擬桿菌屬只在前腸及中腸中存在，豐度由前腸的1.20%增至中腸的4.80%；芽孢桿菌屬、假單胞菌屬只在中腸及后腸發(fā)現(xiàn)，其中，假單孢菌屬豐度從中腸的1.02%增至后腸的10.88%，為后腸的絕對優(yōu)勢屬；芽孢桿菌屬在中腸(2.70%)、后腸(1.40%)的豐度差異較小。中腸還注釋到不動桿菌屬、節(jié)桿菌屬、羅斯氏菌屬、顫螺旋菌屬細菌，其豐度分別為4.00%、2.02%、1.10%、1.06%。由此可知，各優(yōu)勢菌屬在不同腸段的豐度有所不同，其中，前腸的優(yōu)勢菌屬種類較少，而中腸優(yōu)勢菌屬的種類較為豐富。在鱗翅目海灰翅夜蛾腸道菌群研究中，各腸段的物種組成也不同，前腸以蒙氏腸球菌(Enterococcusmundtii)為主，中腸則為梭菌屬(Clostridium)為主，后腸的菌落組成較均勻，主要是蒙氏腸球菌、梭菌及酪黃腸球菌(Enterococcuscasseliflavus)[9]。這種差異推測是由于腸道不同部位的pH、氧分壓等條件不同造成的。

仁扇舟蛾中腸、后腸的細菌種類較為豐富且群落結(jié)構相似性較高，而前腸物種多樣性、豐富度均最低。LEfSe差異分析所示，中腸的差異菌群種類最多，主要為放線菌門、厚壁菌門的細菌。從仁扇舟蛾幼蟲腸道的形態(tài)學特征分析，前腸是食物進入腸腔的通道，作為食物臨時儲存的場所；中腸直徑較大，腸腔大，食物停留的時間較長，是消化、吸收的主要場所；后腸呈光滑均勻的細長管狀，主要用于排泄食物殘渣，同時也用于水分及營養(yǎng)的重吸收[10，28]。因此，中腸、后腸的菌群多樣性、豐富度高于前腸，而中腸作為食物消化及吸收的主要場所，菌群多樣性較高，差異菌群也較多。

植物基于自我保護的目的，能夠產(chǎn)生對植食性昆蟲有毒的次級代謝產(chǎn)物，然而以這些植物為食的昆蟲卻不受影響。最近有研究表明，腸道菌群可以協(xié)助宿主降解植物中有毒的次級代謝產(chǎn)物。節(jié)桿菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬細菌均可降解單寧[29]。不動桿菌屬細菌能夠降解楊樹分泌的酚苷類化合物[7]。腸道菌群還能降解食物中的難消化成分，研究表明腸桿菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸球菌屬細菌能夠水解纖維素[5，30-31]。楊樹葉片中含有豐富的單寧[32]，仁扇舟蛾作為楊樹重要的食葉害蟲，研究仁扇舟蛾腸道中的細菌可以在食物利用及克服植物次生代謝物質(zhì)等方面發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果初步探究了仁扇舟蛾幼蟲腸道細菌群落結(jié)構組成，發(fā)現(xiàn)仁扇舟蛾幼蟲的前、中、后腸多樣性存在差異，腸道細菌在提高宿主昆蟲對環(huán)境的適應性上發(fā)揮作用。本研究為進一步研究昆蟲與其共生菌群之間的復雜關系，探索新的害蟲防治方法提供了參考。