郭樹(shù)奇，焦子悅，費(fèi)強(qiáng)，2

（1 西安交通大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710049；2 陜西省能源化工過(guò)程強(qiáng)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安710049）

作為一種無(wú)色、無(wú)味、無(wú)毒的可燃性氣體，甲烷（CH4）是目前發(fā)現(xiàn)的最簡(jiǎn)單、能量密度最大的烷烴（熱值為55 MJ/kg）［1］，也是僅次于二氧化碳（CO2）的第二大溫室氣體源頭［2-3］。近期，F(xiàn)eldman等［4］通過(guò)實(shí)驗(yàn)和觀測(cè)首次證實(shí)了甲烷排放增長(zhǎng)與全球變暖加速之間的正向關(guān)系。當(dāng)前大部分甲烷排放來(lái)自于能源開(kāi)采（天然氣和石油）、牲畜飼養(yǎng)、垃圾填埋場(chǎng)等人類活動(dòng)［5-6］。隨著人口增長(zhǎng)導(dǎo)致的肉類食品和能源需求的不斷提高，甲烷的排放量還將持續(xù)上漲，這將對(duì)節(jié)能減排和“碳中和”等國(guó)家戰(zhàn)略造成一定沖擊。而作為天然氣和沼氣的主要組成部分，甲烷也具有儲(chǔ)量豐富、價(jià)格低廉、碳原子還原性強(qiáng)、微生物可利用等優(yōu)勢(shì)，是一種極具潛力的碳源［7］。嗜甲烷菌是一種能夠以甲烷作為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝的微生物，這類菌群在緩解大氣中甲烷排放方面發(fā)揮著重要作用［8］。近年來(lái)，圍繞嗜甲烷菌開(kāi)展甲烷生物轉(zhuǎn)化利用的研究得到了國(guó)內(nèi)外廣泛的關(guān)注［9-18］。

由于抗污染能力強(qiáng)，且可在溫和生長(zhǎng)條件下實(shí)現(xiàn)甲烷的快速氧化和同化代謝，嗜甲烷菌已成為理想的甲烷生物利用工程菌改造宿主，研究證實(shí)開(kāi)發(fā)和構(gòu)建嗜甲烷菌細(xì)胞工廠具有重要的科學(xué)價(jià)值和研究意義［1，13，19-21］。到目前為止，用于化學(xué)品和生物燃料合成的微生物多以糖類作為發(fā)酵底物，考慮到其原料價(jià)格不穩(wěn)定，開(kāi)發(fā)廉價(jià)、非食品的碳源已成為生物制造領(lǐng)域中亟待解決的重要課題之一［22］。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲烷被用作底物生產(chǎn)還原性化學(xué)品時(shí)，能夠提供更多的電子，可有效促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物得率和產(chǎn)量［23-24］。利用前沿合成生物技術(shù)對(duì)嗜甲烷菌的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)和改造，已實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化甲烷合成多種平臺(tái)化合物。由此可見(jiàn)，通過(guò)開(kāi)發(fā)甲烷生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，不但可以促進(jìn)甲烷有效利用和減少溫室氣體排放量，還能夠?yàn)榻⒀h(huán)經(jīng)濟(jì)模式提供一種全新的研發(fā)策略和實(shí)踐方向［13］。

本文主要介紹了嗜甲烷菌人工細(xì)胞構(gòu)建的相關(guān)研究進(jìn)展，重點(diǎn)分析了嗜甲烷菌代謝工程改造策略和化學(xué)品合成相關(guān)研究成果。最后結(jié)合在生物制造領(lǐng)域的應(yīng)用前景，探討了嗜甲烷菌人工細(xì)胞構(gòu)建和改造等方面所面臨的挑戰(zhàn)和機(jī)遇。

1 嗜甲烷菌及其改造策略

分離自富含甲烷環(huán)境中的嗜甲烷菌是一種天然的甲烷利用菌株。雖然研究發(fā)現(xiàn)嗜甲烷菌可在厭氧條件下利用甲烷生長(zhǎng)，但是絕大多數(shù)可人工培養(yǎng)的嗜甲烷菌均需在好氧環(huán)境中完成甲烷的氧化過(guò)程［25-26］。因此本文主要圍繞好氧性嗜甲烷菌的相關(guān)研究展開(kāi)一系列討論和分析。如圖1所示，嗜甲烷菌體內(nèi)獨(dú)有的甲烷單加氧酶（methane monooxygenases， MMO）可在胞內(nèi)將甲烷轉(zhuǎn)換為甲醇，隨后通過(guò)內(nèi)源代謝途徑完成碳同化［28］。目前，根據(jù)甲烷同化途徑的不同，好氧性嗜甲烷菌主要被分為 Group Ⅰ、Group Ⅱ和 Group Ⅲ［29］，其分別通過(guò)單磷酸核酮糖（ribulose monophosphate，RuMP）循環(huán)、絲氨酸循環(huán)（serine cycle）和卡爾文循環(huán)（Calvin-Benson-Bassham cycle， CBB）實(shí)現(xiàn)甲烷的生物轉(zhuǎn)化。上述3種同化過(guò)程已在前期文章中進(jìn)行了詳細(xì)的介紹［1，9，18，25，30］，本文不再贅述。

圖1 嗜甲烷菌中甲烷的代謝途徑［8，27］Fig.1 The pathways of methane metabolism in methanotrophs[8,27]

遺傳改造工具在嗜甲烷菌人工細(xì)胞構(gòu)建研究中發(fā)揮著重要作用。目前基于嗜甲烷菌報(bào)道的基因操作工具主要包括質(zhì)粒載體和基因轉(zhuǎn)移方法。質(zhì)粒載體主要用于基因復(fù)制、基因表達(dá)和基因敲除的相關(guān)工作，而基因轉(zhuǎn)移方法多用于將質(zhì)?；蛲庠椿蜣D(zhuǎn)入嗜甲烷菌體內(nèi)，包括接合轉(zhuǎn)移和電穿孔?，F(xiàn)階段通過(guò)優(yōu)化的接合轉(zhuǎn)移和電穿孔方法，研究人員在嗜甲烷菌體內(nèi)已成功實(shí)現(xiàn)了基因缺失、整合和位點(diǎn)特異性重組等多種遺傳操作［20］。此外，研究人員基于嗜甲烷菌體系還成功開(kāi)發(fā)了人工誘變技術(shù)［31］、適應(yīng)性進(jìn)化［32］、基因表達(dá)模塊和元件優(yōu)化（啟動(dòng)子和其他調(diào)節(jié)元件）［33］以及前沿基因編輯［10］等人工細(xì)胞構(gòu)建方法［34-35］。在探索鑭系元素開(kāi)關(guān)對(duì)甲醇脫氫酶mxaF 調(diào)節(jié)功能的研究中，Groom 等［31］通過(guò)化學(xué)誘變（亞硝基胍）方法，基于Methylotuvimicrobium buryatense5GB1C 菌株成功篩選出鑭元素?zé)o法抑制mxaF 啟動(dòng)子的突變體。Lee 等［32］基于Methylomonassp.DH-1 通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化篩選出一株耐乳酸菌株JHM80，用于提高工程菌株的乳酸耐受性和產(chǎn)量。Puri［34］等報(bào)道了M. buryatense5GB1S 中不同表達(dá)強(qiáng)度的啟動(dòng)子元件。Garg 等［33］通過(guò)模塊化組裝策略，進(jìn)一步優(yōu)化了利用甲烷合成乳酸的M.buryatense5GB1 人工細(xì)胞。表1列出了嗜甲烷菌遺傳改造工具。

表1 嗜甲烷菌遺傳改造工具Tab.1 The genetic tool used for metabolic engineering of methanotrophs

近期，CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)也被證實(shí)可在嗜甲烷菌體系中應(yīng)用。Tapscott 等［42］在M. capsulatusBath 體內(nèi) 利用 CRISPR/Cas9 實(shí) 現(xiàn) 了sMMO的敲除及GFP蛋白的修飾。此外，Liu等［10］利用苯丙氨酰tRNA 合酶編碼基因phzSAG，在M. buryatense5GB1C 體系中開(kāi)發(fā)了一種基因無(wú)痕敲除方法，有效提升了基因敲除效率。以上這些基因操作方法的建立進(jìn)一步拓寬了嗜甲烷菌在甲烷轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，使嗜甲烷菌成為具有工業(yè)應(yīng)用前景的模式菌株［14］，也為實(shí)現(xiàn)甲烷基化學(xué)品的高效生物合成打通了路徑（表2）。

表2 嗜甲烷菌人工細(xì)胞轉(zhuǎn)化甲烷合成化學(xué)品和生物燃料Tab.2 Biosynthesis of various chemicals and biofuels from methane by methanotrophic cell factories

當(dāng)前，基于化學(xué)品生物合成的嗜甲烷菌人工細(xì)胞的改造工作主要圍繞關(guān)鍵代謝節(jié)點(diǎn)（丙酮酸和乙酰輔酶A）累積和甲烷同化過(guò)程（RuMP 循環(huán)、絲氨酸循環(huán)）理性改造開(kāi)展，通過(guò)有效地調(diào)控甲烷碳通量走向，實(shí)現(xiàn)碳轉(zhuǎn)化效率的提高和目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成。如圖2 所示，RuMP 循環(huán)主要通過(guò)核酮糖-5-磷酸（ribulose-5-phosphate， Ru5P）利用甲醛以實(shí)現(xiàn)甲烷的同化［13］。其中，磷酸轉(zhuǎn)酮酶（phosphoketolase， PKT）途徑產(chǎn)生的赤蘚糖4-磷酸（E4P）或甘油-3-磷酸（GAP）重新排列，能夠?qū)崿F(xiàn)Ru5P的再生，從而促進(jìn)Ru5P對(duì)甲烷的同化效率［20，61］。通過(guò)磷酸轉(zhuǎn)酮途徑增加甲烷代謝的碳通量被認(rèn)為是一種十分有效的代謝工程改造方法，這一途徑的重構(gòu)已使得多種微生物人工細(xì)胞中的乙酰輔酶A 積累量顯著提高，為乙酰輔酶A衍生化學(xué)品的生物合成提供了可行的工程改造策略［62-65］。 以M. buryatense5G 為例 ， Henard 等［61］研究發(fā)現(xiàn)該菌株通過(guò)RuMP 途徑可將6 分子甲醛轉(zhuǎn)化為2 分子的乙酰輔酶A，而利用RuMP-PKT途徑可將6 分子甲醛轉(zhuǎn)化為3 分子的乙酰輔酶A。同時(shí)，RuMP-PKT 途徑能夠避免源于糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas， EMP）途徑中丙酮酸脫羧造成的ATP 消耗，從而在不損失碳和能量的情況下實(shí)現(xiàn)乙酰輔酶A 的合成［20］。此外，嗜甲烷菌中絲氨酸循環(huán)與乙基丙二酰輔酶（Ethylmalonyl-CoA，EMC）途徑及三羧酸循環(huán)緊密相連，絲氨酸循環(huán)產(chǎn)生的乙酰輔酶A 可被整合到乙基丙二酰輔酶通路中用于乙醛酸的再生和細(xì)胞產(chǎn)物PHB（poly-β-hydroxybutyrate）的生物合成［23］。作為關(guān)鍵中間代謝物和乙酰輔酶A 合成前體，丙酮酸合成效率也是甲烷基化學(xué)品合成的關(guān)鍵瓶頸。目前敲除其競(jìng)爭(zhēng)途徑是提高丙酮酸累積濃度的最有效、最簡(jiǎn)單的方式之一［20］。有研究發(fā)現(xiàn)，嗜甲烷菌中的丙酮酸和GAP 的產(chǎn)量分別是乙酰輔酶A 的150 倍和30 倍，而在大腸桿菌中乙酰輔酶 A 的產(chǎn)量遠(yuǎn)高于丙酮酸和 GAP［20，66-67］。這可能是由于嗜甲烷菌中內(nèi)源MEP 途徑代謝通量較強(qiáng)導(dǎo)致丙酮酸和GAP 傾向于縮合形成脫氧-D-木酮糖5-磷酸（deoxy-D-xylulose 5-phosphate， DXP），從而減少了丙酮酸向乙酰輔酶A 合成過(guò)程的碳流。

圖2 嗜甲烷菌轉(zhuǎn)化甲烷合成化學(xué)品和燃料的代謝途徑［27］Fig.2 Metabolic pathways for the production of chemicals and fuels by methanotrophs using methane[27]

2 基于化學(xué)品合成的嗜甲烷菌人工細(xì)胞的構(gòu)建

2.1 有機(jī)酸類化學(xué)品

有機(jī)酸類化學(xué)品作為天然產(chǎn)物，在食品、制藥和生物基材料工業(yè)中應(yīng)用廣泛［68-72］。研究人員基于丙酮酸、乙酰輔酶A 以及磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvic acid， PEP）等甲烷代謝中間產(chǎn)物構(gòu)建的嗜甲烷菌人工細(xì)胞已成功將甲烷轉(zhuǎn)化為C3～C18不同鏈長(zhǎng)的有機(jī)酸類化學(xué)品（表2）。乳酸（lactic acid）在嗜甲烷菌中的生物合成已在途徑構(gòu)建、模塊篩選以及培養(yǎng)優(yōu)化等方面均取得了重要進(jìn)展［33］，這主要是得益于應(yīng)用合成生物學(xué)模塊化思路完成了嗜甲烷菌合成乳酸模塊的代謝路徑和表達(dá)水平的優(yōu)化。近期，Lee 等［32］基于適應(yīng)性進(jìn)化策略獲得乳酸耐受菌株Methylomonassp.DH-1 JHM80，通過(guò)基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)該菌株啟動(dòng)子區(qū)域突變引發(fā)了弱酸耐受調(diào)節(jié)子（weak acid tolerance regulator，WatR）表達(dá)的上調(diào)。隨后，該研究通過(guò)定向精準(zhǔn)調(diào)控watR基因的表達(dá)水平，使乳酸產(chǎn)量提高到1.19 g/L。嗜甲烷菌M.trichosporiumOB3b 中具有獨(dú)特的乙基丙二酰輔酶途徑，能夠利用 3 分子乙酰輔酶 A 同化 1 分子 CO2和 1 分子HCO3-，從而積累 2 分子蘋(píng)果酸［73-74］。Nguyen等［15］基于該菌株中特有的絲氨酸循環(huán)，通過(guò)引入非產(chǎn)氧光合菌Chloroflexus aurantiacus中的還原酶（malonyl-CoA reductase，MCR），構(gòu)建了3-羥基丙酸（3-hydroxypropionic acid，3HP）合成模塊，并通過(guò)過(guò)表達(dá)蘋(píng)果酸酶（malic enzyme，ME）轉(zhuǎn)化蘋(píng)果酸實(shí)現(xiàn)了NADPH再生，為MCR催化過(guò)程提供了充足的還原力，進(jìn)而有效提高了3HP的產(chǎn)量。同時(shí)，為了避免乙酰輔酶A羧化成丙二酰輔酶A的限速步驟，該研究將來(lái)源于費(fèi)氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii） 中的甲基丙二酰羧基轉(zhuǎn)移酶（methylmalonyl-CoA carboxyltransferase，MMC）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxylase， PEPC）共表達(dá)用以構(gòu)建乙酰輔酶A羧化旁路［15，74-75］。此外，Garg 等［44］利用反向β-氧化途徑成功在M. buryatense5GB1C 內(nèi)構(gòu)建了異源丁烯酸（crotonic acid）合成途徑，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化了異源基因表達(dá)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和啟動(dòng)子、敲除磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因pta以及過(guò)表達(dá)乙酰輔酶A合成酶將乙酸再循環(huán)為乙酰輔酶A，這些改造策略使該嗜甲烷菌人工細(xì)胞可以同時(shí)積累丁烯酸（70 mg/L）和丁酸（40 mg/L）［44，76-77］，為甲烷基C4羧酸的合成提供了有效的策略。同樣，為了提高琥珀酸（succinic acid）產(chǎn)量，Nguyen等［56］通過(guò)引入異源異檸檬酸裂合酶（isocitrate lyase，Il）和蘋(píng)果酸合酶（malate synthase， Ms）用以分流乙醛酸并補(bǔ)充TCA循環(huán)中的蘋(píng)果酸鹽，從而成功將嗜甲烷菌絲氨酸代謝途徑中產(chǎn)生的草酸乙酸和乙酰輔酶A用于合成琥珀酸（圖2）。

近期，Henard 等［45］圍繞莽草酸途徑，利用13C代謝分析建立的基因尺度模型（genome-scale metabolic models， GSMs） 預(yù) 測(cè) 了M. alcaliphilum20Z 合成黏糠酸的競(jìng)爭(zhēng)途徑。雖然基于模型分析結(jié)果敲除了丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，Pdh）和莽草酸脫氫酶（shikimate dehydrogenase，Skd）編碼基因AroE，但黏糠酸的產(chǎn)量?jī)H1.5 mg/g DCW，為預(yù)測(cè)產(chǎn)量值的6.5%。這可能是由于M.alcaliphilum20Z 中存在莽草酸合成的替代途徑或Skd 的同工酶，敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑并未能充分地將碳流轉(zhuǎn)向黏糠酸。值得一提的是，基因測(cè)序技術(shù)及組學(xué)（基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組、代謝組）技術(shù)也為深入理解嗜甲烷菌的生理學(xué)基礎(chǔ)、細(xì)胞代謝和反應(yīng)過(guò)程提供了新的方法［46，51，67，77-83］。在嗜甲烷菌中，由于中心代謝途徑與細(xì)胞內(nèi)膜合成相關(guān)聯(lián)，因而能夠積累大量的長(zhǎng)鏈脂肪酸（fatty acids）。Demidenko 等［46］利用轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)M.buryatense5GB1 菌株中脂肪酸降解、乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A供給水平是提高脂肪酸產(chǎn)量的瓶頸，在敲除醋酸激酶和過(guò)表達(dá)乙酰輔酶A 羧化酶后，脂肪酸的積累量較原始菌株提高了20%。而Fei 等［84］則在上述研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步敲除糖原、蔗糖-6-磷酸等競(jìng)爭(zhēng)路徑基因，最終在高密度發(fā)酵條件下將長(zhǎng)鏈脂肪酸的產(chǎn)率提高了3倍。上述研究成果充分說(shuō)明利用組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)而確立代謝改造靶點(diǎn)，可在深入認(rèn)識(shí)嗜甲烷菌的代謝系統(tǒng)及生化反應(yīng)機(jī)制機(jī)理的同時(shí)，有效提高目標(biāo)產(chǎn)物和合成效率。

2.2 萜類化學(xué)品

雖然在嗜甲烷菌體內(nèi)有部分甲基赤蘚糖醇-4-磷酸（methylerythritol-4-phosphate， MEP）途徑或甲羥戊酸（mevalonate， MVA）途徑，但考慮到MEP 途徑擁有較高的IPP 的理論合成率，甲烷基萜類化學(xué)品主要通過(guò)改造和優(yōu)化MEP 途徑實(shí)現(xiàn)［11，20，67］。Leonard 等［52］為了 強(qiáng) 化 IspS 催 化 活性，將葛根（Pueraria montana）中的IspS 經(jīng)密碼子優(yōu)化后，利用MDH 強(qiáng)啟動(dòng)子在M. capsulatusBath 中表達(dá)并首次獲得了10 mg/L 異戊二烯。而Donaldson 等［85］試圖利用異源 IspS 以及異戊烯基焦 磷 酸 異 構(gòu) 酶 （isopentenyl diphosphate isomerase， IDI）雙基因提高異戊二烯合成效率，但遺憾的是異戊二烯的產(chǎn)量?jī)H為0.056 mg/L，這主要是由于雙基因表達(dá)效率及催化活性限制造成了該合成模塊較低的碳通量。整體來(lái)看，現(xiàn)階段嗜甲烷菌合成異戊二烯的研究主要集中于合成途徑構(gòu)建，節(jié)點(diǎn)累積和輔因子及能量供給平衡等代謝改造策略的研究相對(duì)較少。

除了異戊二烯，檸檬烯（limonene）和法尼烯（Farnesene）等萜類化合物也是重要的精細(xì)化學(xué)品、香料、藥品的合成前體［86］。DiCosimo 等［59］利用pR58 載體，將異源檸檬烯合成酶（limonene synthase）在Methylomonassp.16a 菌株中表達(dá)，首次實(shí)現(xiàn)在嗜甲烷菌中累積0.5 mg/L 檸檬烯。而Nguyen 等［48］則 基 于M. alcaliphilum20Z 菌 株 中MEP 途徑的中間代謝物法尼焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate， FPP），通過(guò)引入異源蛇麻烯合成酶（humulene synthase）Zssl［48，87］，成功實(shí)現(xiàn)了蛇麻烯的從頭合成。圍繞過(guò)表達(dá)合成關(guān)鍵酶（IspA、IspG 及 Dxs）、重新定向 EMP 途徑、NADPH 輔因子再生、電子供應(yīng)強(qiáng)化、基因尺度模型等策略，該研究首次對(duì)萜類化學(xué)品的合成途徑進(jìn)行了系統(tǒng)的理性代謝工程改造和優(yōu)化，最終將蛇麻烯產(chǎn)量提高到0.75 mg/g DCW，達(dá)到出發(fā)菌株的18.8 倍［67，81］（圖 2）。角黃素（canthaxanthin）、蝦青素（astaxanthin）和番茄紅素（lycopene）［88］等類胡蘿卜素產(chǎn)物也可在嗜甲烷菌中實(shí)現(xiàn)生物合成［88］，但產(chǎn)量仍有待進(jìn)一步提高。

2.3 其他化學(xué)品

隨著可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的提出，生物醇類物質(zhì)作為生物能源的前體，近年來(lái)備受工業(yè)界和科學(xué)界的關(guān)注［54，89-90］。研究人員結(jié)合基因尺度模型i20ZR-BDO的分析數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)了2，3-丁二醇（2，3-butanediol， BDO）合成過(guò)程的改造靶點(diǎn)，在累計(jì)敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑中的ldh、ack和mdh等基因后，將BDO 濃度提升到 86.2 mg/L［14］。為充分發(fā)揮基因尺度模型在嗜甲烷菌人工細(xì)胞設(shè)計(jì)、構(gòu)建及優(yōu)化中的重要作用，Nguyen 研究組又建立了基于尸胺（cadaverine）和腐胺（putrescine）生物合成的基因尺度模型，預(yù)測(cè)了關(guān)鍵代謝節(jié)點(diǎn)和終端產(chǎn)物的代謝工程改造靶點(diǎn)。通過(guò)過(guò)表達(dá)目的基因、敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑或強(qiáng)化產(chǎn)物分泌效率，有效地提高了碳通量，并最終分別將尸胺和腐胺的產(chǎn)量提高到283.64 mg/L［14］和 98.08 mg/L［49］。此外，與大腸桿菌及釀酒酵母相比，嗜甲烷菌在RuMP途徑代謝中更具優(yōu)勢(shì)。研究人員通過(guò)將異源2-脫甲基4-脫氧葡萄糖醇合酶（2-demethyl 4-deoxygadusol synthase，DDGS）、氧甲基轉(zhuǎn)移酶（O-methyltransferase，OMT）、ATP-連接酶（ATP-grasp ligase）和丙氨酸連接酶（D-Ala-D-Ala ligase）整合到M.alcaliphilum20Z 中，成功設(shè)計(jì)并合成了具有防曬功能的類菌胞素氨基酸 Shinorine［91，92］。與此同時(shí)，研究人員基于銅、鈣等微量元素對(duì)MMO 及MDH 活性的影響機(jī)理，在微生物培養(yǎng)過(guò)程添加上述微量元素并利用操縱子計(jì)算器（operon calculator） 進(jìn)一步優(yōu)化了Shinorine 合成模塊，將產(chǎn)量提高到31 mg/L［39，78，93］（圖 2）。上述基于系統(tǒng)生物學(xué)及合成生物學(xué)的代謝工程策略已廣泛應(yīng)用于嗜甲烷菌人工細(xì)胞的構(gòu)建和優(yōu)化。

3 總結(jié)與展望

隨著全球甲烷供應(yīng)量的增加，特別是天然氣和沼氣產(chǎn)量的提高［94-96］，人們對(duì)甲烷的生物轉(zhuǎn)化利用產(chǎn)生了更廣泛關(guān)注。近年來(lái)，由于具有相對(duì)高效的甲烷固定途徑以及能夠?qū)崿F(xiàn)高密度發(fā)酵，嗜甲烷菌作為甲烷轉(zhuǎn)化人工細(xì)胞在化學(xué)品合成中表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景［37，97］。利用其特有的甲烷氧化和同化系統(tǒng)，結(jié)合前沿的基因編輯工具及代謝途徑調(diào)控策略，目前已開(kāi)發(fā)了不同類型和功能的嗜甲烷工程菌用于生物合成化學(xué)品，并展現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［15，67，98-99］。雖然通過(guò)代謝工程改造已實(shí)現(xiàn)多種甲烷基化學(xué)品生物合成，但目前嗜甲烷菌人工細(xì)胞相關(guān)研究仍然處在關(guān)鍵共性基礎(chǔ)技術(shù)的研發(fā)階段，在設(shè)計(jì)、構(gòu)建和優(yōu)化等方面仍然面臨很多挑戰(zhàn)［67，82，98，100-101］。

盡管基于嗜甲烷菌工業(yè)菌株已開(kāi)發(fā)出多種基因操作工具，但相較于大腸桿菌和釀酒酵母等模式菌株，嗜甲烷菌中可用于人工細(xì)胞構(gòu)建的生物技術(shù)仍十分有限，而針對(duì)外源基因在嗜甲烷菌人工細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的基因轉(zhuǎn)化方法也亟需進(jìn)行拓展。此外，嗜甲烷菌中電子傳遞系統(tǒng)、生物固氮/固硫機(jī)制、磷酸鹽代謝調(diào)控等關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題的研究也有待探究。未來(lái)相關(guān)工作需進(jìn)一步提高嗜甲烷菌基因尺度模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，并基于對(duì)代謝機(jī)制機(jī)理的探索，有針對(duì)性地改造和優(yōu)化化學(xué)品合成路徑。同時(shí)，結(jié)合各類組學(xué)分析數(shù)據(jù)，從系統(tǒng)生物學(xué)角度加深對(duì)嗜甲烷菌細(xì)胞行為的認(rèn)識(shí)，明確嗜甲烷菌特異性基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制、甲烷代謝過(guò)程的酶活性以及代謝流分布，為高效關(guān)鍵基因元件挖掘和人工細(xì)胞構(gòu)建提供理論指導(dǎo)，為甲烷的高效生物利用和化學(xué)品合成提供全新的研究思路和工業(yè)應(yīng)用。

符號(hào)說(shuō)明