孫薇，丁冬芹，柏丹陽，朱亞如，解曉彤，3，張大偉

（1天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308；3大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116000）

芳香族氨基酸是指分子結(jié)構(gòu)式中含有苯環(huán)的氨基酸，包括色氨酸（L-Trp）、酪氨酸（L-Tyr）和苯丙氨酸（L-Phe），存在于絕大多數(shù)生命體中，也可從食物中獲得。此外，芳香族氨基酸的生物學(xué)功能對于改善人們生活具有重要的推動(dòng)作用，目前已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料和化工等多個(gè)行業(yè)。其中，L-Trp 具有提高睡眠質(zhì)量、抗興奮以及預(yù)防胃潰瘍和提高免疫力的生理功能［1］；L-Tyr 常被用作營養(yǎng)補(bǔ)充劑來治療脊髓炎、結(jié)核腦炎和甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)等疾?。?］；L-Phe 可用于生產(chǎn)新型甜味劑阿斯巴甜，也是復(fù)配氨基酸輸液的重要成分之一，還可作為抗癌藥物的中間體和良好載體［3］。

芳香族氨基酸衍生物是由芳香族氨基酸衍生出的一類具有高附加值的化合物，這些衍生物大多通過化學(xué)化工合成或從天然產(chǎn)物直接提?。?］。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，人們利用生物合成技術(shù)可將芳香族氨基酸直接轉(zhuǎn)變?yōu)槠溲苌铮缺Ｗo(hù)環(huán)境，又避免了天然產(chǎn)物提取困難的問題［5］。芳香族氨基酸是其衍生物的重要前體，由此可見，探究芳香族氨基酸生物合成的同時(shí)也促進(jìn)了其衍生物合成的發(fā)展，兩者在現(xiàn)代市場中都具有較大的商業(yè)價(jià)值，所以研究其生物合成必不可少。

1 芳香族氨基酸的合成途徑及生產(chǎn)方法

1.1 合成途徑

研究表明，芳香族氨基酸合成途徑主要分為三大模塊：中心碳代謝途徑（CCM）、莽草酸（SHIK）途徑和分支酸（CHA）途徑，如圖1 所示。芳香族氨基酸合成途徑，以葡萄糖（Glc）為起點(diǎn)，經(jīng)過CCM 途徑，相繼生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤蘚糖-4-磷酸（E4P），緊接著二者縮合生成3-脫氧-α-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（DAHP），DAHP 經(jīng)過 SHIK 途徑依次生成 SHIK 和 CHA，最終由CHA分別生成L-Trp、L-Tyr和L-Phe［6］。

圖1 芳香族氨基酸的合成途徑Fig.1 Synthesis of aromatic amino acids

1.2 合成方法

芳香族氨基酸的生產(chǎn)方法有天然蛋白質(zhì)水解法、化學(xué)合成法、轉(zhuǎn)化法（酶轉(zhuǎn)化法和微生物轉(zhuǎn)化法）和微生物發(fā)酵法等。每種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，見表1。目前微生物發(fā)酵法是最常用的芳香族氨基酸生產(chǎn)方法，由于芳香族氨基酸合成途徑相對較長且復(fù)雜，獲得工業(yè)化高產(chǎn)菌株是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)芳香族氨基酸的一大瓶頸［12-13］。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，利用代謝工程與合成生物學(xué)等相關(guān)知識(shí)對生產(chǎn)菌株進(jìn)行改造，是提高芳香族氨基酸產(chǎn)量的一種重要方式。

表1 芳香族氨基酸生產(chǎn)方法的比較Tab.1 Comparison of production methods of aromatic amino acids

2 芳香族氨基酸生物合成的影響因素及改造策略

2.1 芳香族氨基酸生物合成的影響因素

由于合成芳香族氨基酸的代謝途徑較長，中間產(chǎn)物繁多且復(fù)雜，所以影響芳香族氨基酸合成的因素也多種多樣，主要包括基于代謝途徑的影響因素，例如前體的供給水平、關(guān)鍵酶受到的反饋抑制、調(diào)控蛋白對合成途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)效率以及基于菌株個(gè)體的改造方法等。基于代謝途徑的常見影響因素見表2。

表2 芳香族氨基酸合成的影響因素Tab.2 Factors affecting synthesis of aromatic amino acids

2.2 芳香族氨基酸生物合成的改造策略

2.2.1 改造中心碳代謝途徑，增加前體供給水平

（1）增加PEP供給水平

PEP是芳香族氨基酸合成途徑中的重要前體之一，研究表明，流向PEP的碳通量要比流向E4P的碳通量高一個(gè)數(shù)量級(jí)［31］。PEP 在糖酵解（EMP）途徑中是一個(gè)多種酶共同競爭的底物，其生成量和消耗量會(huì)對SHIK 途徑的碳通量造成顯著影響。當(dāng)大腸桿菌以葡萄糖為唯一碳源生長時(shí)，負(fù)責(zé)葡萄糖攝取和磷酸化的PTS 系統(tǒng)消耗50%的PEP［18］，進(jìn)而導(dǎo)致進(jìn)入莽草酸的碳通量降低了一半。在此前提下，以葡萄糖為碳源生成DAHP 的最大理論產(chǎn)量為0.43 mol/mol 葡萄糖。如果單純?nèi)コ齈TS 系統(tǒng)，細(xì)胞內(nèi)的PEP的積累量會(huì)有相對的提高，但葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)速率卻隨之降低，甚至還會(huì)影響細(xì)胞的生長狀態(tài)［14］。所以，研究者多采用非PTS系統(tǒng)來降低PEP 的消耗。Patnaik 等［32］以木糖為碳源，發(fā)現(xiàn)DAHP 的最大理論產(chǎn)量可達(dá)到0.71 mol/mol 木糖。Carmona 等［33］與 Chen 等［34］的研究證明了使 PTS的胞質(zhì)成分失活（例如ptsHIcrr操縱子）已成為取消PTS 促進(jìn)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的代表策略。但是，PTS缺陷型菌株的生長能力通常嚴(yán)重受損。為了恢復(fù)PTS 缺陷菌株中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，激活其他潛在的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或載體，例如半乳糖通透酶（GalP）和葡萄糖激酶（Glk）途徑，可以作為一種有前途的策略［34-35］。Chen 等［36］提到 GalP/Glk 依賴菌株的最大理論產(chǎn)量經(jīng)計(jì)算為0.45 g/g，約為PTS 依賴菌株的2倍，這為增加PEP 供給水平提供了一個(gè)很好的研究方向。吳濤等［37］利用Red 同源重組系統(tǒng)構(gòu)建了一株P(guān)TS 突變菌株（敲除基因ptsHI、crr和glf，過表達(dá)glk），在50 L 發(fā)酵罐中進(jìn)行分批發(fā)酵，對照原菌株L-Trp產(chǎn)量提高了25.9%。

除此之外，與PEP 合成和消耗相關(guān)的基因主要有ppsA（編碼 PEP 合酶）、pckA、ppc、pykA和pykF（編碼丙酮酸激酶）［16］（圖2）。研究者多采用敲除或者過表達(dá)的基因改造方法來提高PEP 的積累量。例如，Berry 和 Gosset 等［38-39］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)敲除編碼丙酮酸激酶的基因pykA或pykF，對DAHP 的產(chǎn)量不會(huì)造成任何的影響，但如果同時(shí)敲除兩個(gè)基因（pykA和pykF），DAHP 的產(chǎn)量會(huì)增加到原來的3倍。近年來有學(xué)者結(jié)合前人的改造方法，同時(shí)替換相應(yīng)基因的啟動(dòng)子，如Du 等［40］選擇TRP1 為出發(fā)菌株，先是敲除基因tnaA和mtr，阻止L-Trp 的降解和運(yùn)輸，其次分別把Ptrc-trpE、Ptrc-aroG整合至trplE和tyrR的基因座中，提高了色氨酸操縱子活性并減輕了TyrR 蛋白對ANT 合酶的反饋抑制，接著過表達(dá)基因pps、pck和citT，增加了PEP 供應(yīng)和增強(qiáng)了檸檬酸的運(yùn)輸，最后使用基因大片段整合方法使PacnB啟動(dòng)串聯(lián)基因acnBA和icd的轉(zhuǎn)錄，以增強(qiáng)TCA 循環(huán)，并在5 L 生物反應(yīng)器中發(fā)酵36 h，L-Trp的濃度達(dá)到49 g/L。

圖2 PEP和E4P合成途徑的改造Fig.2 Modification of synthesis route of PEP and E4P

（2）增加E4P的供給水平

E4P是芳香族氨基酸合成途徑中另一個(gè)重要前體［41］，其是在磷酸戊糖途徑（PPP）中由轉(zhuǎn)酮酶和轉(zhuǎn)醛酶催化生成。轉(zhuǎn)醛酶是由基因talB編碼，轉(zhuǎn)酮酶是由基因tktA和tktB編碼，其中只有tktA對E4P的生成起主要的調(diào)節(jié)作用［19］。此外，通過弱化EMP途徑，可以增強(qiáng)PPP途徑的碳通量，這也是一種提高E4P積累量的有效策略。

Tyagi 等［42］通過在缺失aroB基因的大腸桿菌菌株中過表達(dá)tktA基因，發(fā)現(xiàn)DAHP的積累量有一定的提高，之后又同時(shí)過表達(dá)aroGfbr和tktA基因，發(fā)現(xiàn)從葡萄糖到芳香族氨基酸的碳通量額外增加兩倍；除此之外，Mascarenhas等［43］通過敲除編碼磷酸葡糖異構(gòu)酶基因pgi，發(fā)現(xiàn)EMP 途徑被阻斷，進(jìn)而造成碳通量轉(zhuǎn)移到PPP 途徑中，最終導(dǎo)致L-Trp 在發(fā)酵罐中的產(chǎn)量提高了2 倍，但是此種方法降低了菌株的生長率。Liu 等［18］與 Guo 等［44］通過在酵母中引入異源磷酸酮醇酶實(shí)現(xiàn)了前體E4P通量的提高，進(jìn)而增強(qiáng)芳香族氨基酸的生產(chǎn)，大腸桿菌中也可嘗試此方法進(jìn)行。

2.2.2 解除關(guān)鍵酶的反饋抑制作用和消除TrpR、TyrR蛋白的阻遏作用

為了提高芳香族氨基酸的產(chǎn)量，解除終端產(chǎn)物對關(guān)鍵酶的反饋抑制作用也是十分有效的方法。在芳香族氨基酸合成途徑中，最關(guān)鍵的酶是DAHP合酶、ANT 合酶以及CM-PDT。大多研究者都是通過誘變育種隨機(jī)篩選突變菌株或分析關(guān)鍵酶的蛋白三維結(jié)構(gòu)對其進(jìn)行定點(diǎn)突變，從而達(dá)到解除終端產(chǎn)物對其反饋抑制的目的［45］。如表3 所示，Dodge 等［55］將含有色氨酸操縱子的組成型質(zhì)粒（trpEfbr、trpDfbr）轉(zhuǎn)化到缺失trpR和tnaA基因的宿主菌中，經(jīng)過27 h 的發(fā)酵罐發(fā)酵，L-Trp 的產(chǎn)量達(dá)到6.2 g/L，之后，在該菌株的基礎(chǔ)上，對其進(jìn)行多次誘變育種，L-Trp的產(chǎn)量達(dá)到30 g/L，為了繼續(xù)提高L-Trp 的產(chǎn)量，又在發(fā)酵中期添加了一定量的表面活性劑L61，最終L-Trp 的產(chǎn)量達(dá)到54.5 g/L，這是現(xiàn)在為止報(bào)道的大腸桿菌產(chǎn)L-Trp 的最高產(chǎn)量。劉雙平等［56］先通過滅活ccr基因減少了PEP的損耗，其次通過設(shè)置基因開關(guān)控制phefbr、aroG15、ydiB、aroK和tyrB的表達(dá)，以增加前體的供應(yīng)，接著使用含有tyrA突變體的大腸桿菌菌株來減少碳的轉(zhuǎn)移，最后通過過表達(dá)yddG基因促進(jìn)L-Phe 的外排，在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，L-Phe 的積累量可達(dá)到47 g/L，此產(chǎn)量是在沒有優(yōu)化發(fā)酵條件的情況下的最高產(chǎn)量。Fernstrom 等［57］利用DNA 重組技術(shù)，構(gòu)建了一株含有基因trpEfbr、aroFBL和serAfbr的大腸桿菌生產(chǎn)菌株，同時(shí)敲除基因sdaB、tnaA、trpL和tnaA，并將多拷貝質(zhì)粒pF112-aroFBL-kan 轉(zhuǎn)化至菌體中，在15 L 全自動(dòng)攪拌釜式生物反應(yīng)器中發(fā)酵，L-Trp 濃度可達(dá)12.5 g/L。Zeng 等［36］通過純理性改造，將解除反饋抑制的serA基因插到DAHP 合酶的基因座中，通過分批補(bǔ)料方式在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，L-Trp 的產(chǎn)量可達(dá)34～40 g/L，而對于純理性改造L-Trp，其產(chǎn)量和生產(chǎn)力幾乎是以往研究的兩倍。

表3 芳香族氨基酸合成途徑中抗反饋抑制的關(guān)鍵酶Tab.3 Key enzymes in aromatic amino acid synthesis against feedback inhibition

消除阻遏蛋白的阻遏作用也是提高芳香族氨基酸產(chǎn)量的常用方法（圖3），古鵬飛［58］通過敲除trpR、tnaA，既解除了TrpR 蛋白的阻遏作用，又降低了L-Trp 胞內(nèi)的降解，最終提高了L-Trp 的產(chǎn)量。在此基礎(chǔ)上他使用5CPtacs啟動(dòng)子取代了色氨酸操縱子野生型啟動(dòng)子，進(jìn)一步增強(qiáng)啟動(dòng)子強(qiáng)度，接著采取一步法敲除了色氨酸衰減子，消除了其衰減作用，最后通過搖瓶發(fā)酵，L-Trp 的產(chǎn)量可達(dá)10.15 g/L。Mu?oz 等［59］在 PTS-大腸桿菌生產(chǎn)菌株中敲除了tyrR基因，不僅提高了前體PEP 的積累量，還解除了TyrR 蛋白的反饋?zhàn)瓒簦?jīng)過進(jìn)一步發(fā)酵，L-Tyr的產(chǎn)量相比原菌株提高了1.9 倍。Kim等［60］在大腸桿菌菌株中通過敲除編碼TyrP 通透酶的tyrP基因，并過表達(dá)aroGfbr、aroL和tyrC基因 ，在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，L-Tyr 的產(chǎn)量可達(dá)43.1 g/L。劉麗娜等［47］通過敲除fruR基因，使阻遏蛋白FruR失活，提高了大腸桿菌FB-04 中L-Trp 的產(chǎn)量。通過敲除關(guān)鍵酶以及限速酶，既解除了其對芳香族氨基酸合成途徑的反饋抑制，也增強(qiáng)了合成途徑的碳通量，是提高芳香族氨基酸產(chǎn)量的常用改造策略，同時(shí)，敲除TrpR 和TyrR 這兩個(gè)阻遏蛋白，消除了其對芳香族氨基酸合成途徑的阻遏作用，根據(jù)以上改造策略，生物合成芳香族氨基酸的研究取得了一定的進(jìn)展，見表4。

表4 芳香族氨基酸及其衍生物生產(chǎn)概況Tab.4 General profile of production of aromatic amino acids and their derivatives

2.2.3 改造轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)關(guān)系到終端產(chǎn)物向胞外分泌的程度，相關(guān)的在轉(zhuǎn)運(yùn)基因有mtr、tnaB和aroP，其中aroP可運(yùn)輸 L-Phe、L-Trp 和 L-Tyr，而mtr和tnaB只對L-Trp 的轉(zhuǎn)運(yùn)起作用［74-75］，有報(bào)道顯示 YddG 蛋白也參與了芳香族氨基酸的運(yùn)輸［76］。目前為止，對轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)改造的報(bào)道有很多，研究者大多采用基因敲除或者使相關(guān)酶失活的方法來阻止芳香族氨基酸向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，如Yanofsky 等［24］研究了在大腸桿菌中3 個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)基因mtr、tnaB、aroP的失活對L-Trp 產(chǎn)量的影響，首次得到當(dāng)大腸桿菌在酸水解酪蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，敲除基因tnaB對L-Trp的產(chǎn)量影響最大，接著是mtr，而敲除aroP對L-Trp 的產(chǎn)量幾乎沒有任何影響的重要結(jié)論，但當(dāng)培養(yǎng)基中沒有L-Phe 和L-Tyr 存在時(shí)，aroP的失活就會(huì)對L-Trp 的吸收產(chǎn)生重要影響的重要結(jié)論。趙志軍［13］通過敲除mtr轉(zhuǎn)運(yùn)基因，使得L-Trp的產(chǎn)量得到相應(yīng)提高。古鵬飛［58］對mtr、tnaB和aroP基因進(jìn)行全敲除，發(fā)現(xiàn)對L-Trp 的積累有明顯的促進(jìn)作用，并在搖瓶發(fā)酵中L-Trp 產(chǎn)量可達(dá)2.79 g/L。Liu 等［56］通過分別在大腸桿菌 L-Trp 生產(chǎn)菌株和L-Phe 生產(chǎn)菌株中過表達(dá)yddG基因，發(fā)現(xiàn)L-Trp 和L-Phe的積累量都有明顯的提高。

2.2.4 全局代謝網(wǎng)絡(luò)

人們在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)獨(dú)特的全局調(diào)節(jié)系統(tǒng)——Csr，它能通過全局代謝網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)CCM 途徑的碳通量，而這種調(diào)節(jié)主要是通過一種小RNA 結(jié)合蛋白CsrA 來實(shí)現(xiàn)的。CsrA 蛋白能正向調(diào)節(jié)丙酮酸激酶，負(fù)向調(diào)節(jié)PEP羧激酶和PEP合酶，且這3種酶都與前體PEP 的合成密切相關(guān)，直接影響芳香族氨基酸的產(chǎn)量，除此之外，破壞csrA基因能夠增強(qiáng)糖異生和糖原生物合成酶的活性，并減弱 EMP 途徑等［30］。其中，以 L-Phe 為典型代表，Tatarko 等［77］通過在大腸桿菌菌株中敲除csrA基因，并過量表達(dá)tktA基因，最終對比原菌株發(fā)現(xiàn)L-Phe的產(chǎn)量提高了3.4倍。Yakandawala等［78］分別檢測了csrA和csrD突變以及過表達(dá)csrB基因?qū)Υ竽c桿菌L-Phe 生產(chǎn)菌株的影響，結(jié)果表明，過表達(dá)csrB基因?qū)е碌腖-Phe 產(chǎn)量明顯高于csrA和csrD突變。

2.2.5 菌株生長與產(chǎn)品生產(chǎn)偶聯(lián)

微生物合成是一種很有前景的方法，可以持續(xù)生產(chǎn)工業(yè)上重要的產(chǎn)品，很大幅度地提高了產(chǎn)品產(chǎn)量。然而，代謝負(fù)擔(dān)和各種基因操作往往會(huì)給菌株帶來生產(chǎn)性能限制表型，這是現(xiàn)在生物制造的主要挑戰(zhàn)之一［79］。為了解決這個(gè)問題，一個(gè)優(yōu)越的策略是將產(chǎn)品合成與細(xì)胞生長耦合起來，這使得細(xì)胞生存必須生產(chǎn)產(chǎn)品，兩者相互依存，缺一不可［80］。Wang 等［81］在工程大腸桿菌中創(chuàng)建了一種丙酮酸驅(qū)動(dòng)的代謝方案，用于生長耦合產(chǎn)品生產(chǎn)，從而證明其在促進(jìn)鄰氨基苯甲酸酯及其衍生物生產(chǎn)方面的應(yīng)用，并促進(jìn)了兩種鄰氨基甲酸酯衍生的高價(jià)值產(chǎn)品的生產(chǎn)，包括L-Trp，這為提高L-Trp產(chǎn)量提供了很好的借鑒意義。

2.3 芳香族氨基酸高產(chǎn)菌株篩選方法

2.3.1 基于生物傳感器的高通量篩選

生物傳感器可感知自然界中的眾多信息，比如環(huán)境變化、危險(xiǎn)信號(hào)等，此功能在人類發(fā)展史上已經(jīng)得到應(yīng)用，比如人們會(huì)利用狗的嗅覺來幫助查案等?，F(xiàn)代生物傳感器應(yīng)用了類似的原理，它可響應(yīng)并感知被檢測對象，并按照一定的規(guī)律將感知信號(hào)轉(zhuǎn)換成與之對應(yīng)的易于觀察的輸出信號(hào)，已廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)和合成生物學(xué)中［82-83］。體內(nèi)生物傳感器作為傳感器的一種類型，能夠?qū)崟r(shí)感知并響應(yīng)體內(nèi)的目標(biāo)小分子，對代謝工程和代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控有重要作用。近些年，生物傳感器已廣泛應(yīng)用于菌株篩選方面，面對采用各式各樣基因手段改造出的菌株，生物傳感器可以對改造效果進(jìn)行高通量且快速的評價(jià)，并從中確定出優(yōu)質(zhì)菌種［84］。比如，在芳香族氨基酸菌株改造方面，F(xiàn)ang 等［85］通過建立L-Trp 生物傳感器，該傳感器調(diào)控由L-Trp 誘導(dǎo)的tnaCAB操縱子的轉(zhuǎn)錄，還可響應(yīng)代謝途徑中產(chǎn)生的L-Trp，為了增強(qiáng)L-Trp 代謝途徑，引入了InterSPPS 策略（以順序推拉的方式平衡L-Trp 代謝途徑上游和下游的碳通量），并結(jié)合流式篩選技術(shù)，篩選到了大腸桿菌性能優(yōu)質(zhì)的菌株B8，從而達(dá)到提高色氨酸產(chǎn)量的目的。Zhang 等［86-87］開發(fā)了一種基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TyrR的L-Phe 生物傳感器，該裝置能夠特異地感知胞內(nèi)的L-Phe，并將L-Phe 濃度轉(zhuǎn)化為易于觀察的黃色熒光，該熒光信號(hào)可利用多功能酶標(biāo)儀或流式分析儀進(jìn)行快速測定，從而實(shí)現(xiàn)對發(fā)酵過程中L-Phe的濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測；利用此元件，他們成功從一個(gè)核糖核苷酸結(jié)合位點(diǎn)庫和一個(gè)菌株隨機(jī)突變庫中篩選出了L-Phe 高產(chǎn)表型，達(dá)到了提高L-Phe產(chǎn)量的目的。Chen 等［88］則將 CRISPR/Cas9 促進(jìn)的靶基因工程與生長耦聯(lián)和傳感器引導(dǎo)的體內(nèi)篩選（CGSS）整合在一起，該方法已成功用于工程化一種關(guān)鍵酶——DAHP 合酶AroG。二者結(jié)合可以更快速地得到芳香族氨基酸的高產(chǎn)菌株。

2.3.2 優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基是微生物賴以生長繁殖的環(huán)境，主要包括碳源、氮源、無機(jī)鹽以及維生素、水等，見表5。研究者多采用優(yōu)化培養(yǎng)基的各組分的方法，使菌種的生長狀態(tài)達(dá)到最佳，進(jìn)而達(dá)到提高芳香族氨基酸產(chǎn)量的目的。

表5 培養(yǎng)基中各組分的優(yōu)化Tab.5 The components optimization in the medium

張婷婷［93］分別檢測了6 種不同碳源對菌體生長的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)以葡萄糖為唯一碳源時(shí)，且當(dāng)葡萄糖的初始濃度為30 g/L 時(shí)，L-Trp 產(chǎn)量可達(dá)到最大值。在此基礎(chǔ)上，她還檢測了多種氮源對菌體生長和色氨酸發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)以酵母粉為有機(jī)氮源，以NH4NO3為無機(jī)氮源時(shí)，菌體的生長量和色氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大。婁秀平［92］采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，探究了不同濃度的鹽離子對大腸桿菌L-Trp 生產(chǎn)菌株的影響，結(jié)果表明，6 g/L的KH2PO4和2 g/L的MgSO4為最佳組合。

流加式（fed-batch）培養(yǎng)已經(jīng)成為一種生產(chǎn)芳香族氨基酸的流行方法，并且還被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工程中［94］。在芳香族氨基酸生物合成途徑中，底物的抑制作用、終端產(chǎn)物的反饋抑制以及阻遏蛋白的阻遏效應(yīng)都無法避免，但是采用流加式培養(yǎng)，在一定程度上能夠減緩這些不利于芳香族氨基酸生產(chǎn)的負(fù)面反應(yīng)。同時(shí)，流加式培養(yǎng)能夠更好地控制反應(yīng)過程中溶氧，既解決了因一次性投放葡萄糖造成的細(xì)胞耗氧過多的問題，還能使菌種始終保持正常的生理狀態(tài)。Jing 等［95］通過構(gòu)建新型動(dòng)態(tài)控制策略，該策略將優(yōu)化的ANT 進(jìn)料納入溶解氧（DO-stat）葡萄糖進(jìn)料框架，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模生產(chǎn)過程中報(bào)道的最高的葡萄糖至L-Trp 產(chǎn)量（0.244 g/g），接近最大理論產(chǎn)量0.277 g/g。除此之外，接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的初始pH 以及補(bǔ)料方式等對生產(chǎn)芳香族氨基酸的生產(chǎn)也具有重要的影響。

3 芳香族氨基酸衍生物的生物合成

3.1 L-苯丙氨酸衍生物的生物合成

L-Phe 分支途徑中的苯丙酮酸和L-Phe 在相應(yīng)酶的催化下可衍生為不同化合物，如扁桃酸、D-苯甘氨酸、D-苯丙氨酸、苯乳酸、苯乙烯、肉桂酸、肉桂醛、肉桂醇等，這些衍生物都具有其獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。

扁桃酸主要應(yīng)用于制藥行業(yè)，是藥物合成的重要前體［96］。扁桃酸的合成主要是由4-羥基扁桃酸合酶（由hamS編碼）催化苯丙酮酸完成［圖4（a）］。Sun 等［62］構(gòu)建了以葡萄糖為碳源的大腸桿菌菌株，為了提高扁桃酸的生成量，引入了來自A.orientalis的HamS，同時(shí)還敲除了競爭途徑基因tyrA，經(jīng)過發(fā)酵，S-扁桃酸的產(chǎn)量可達(dá)0.74 g/L。接著他又在該菌株的基礎(chǔ)上，共表達(dá)了來自S.coelicolor對羥基扁桃酸氧化酶（由hmo編碼）和來自Rhodotorula graminis對羥基扁桃酸脫氫酶（由dmd編碼），得到了0.68 g/L的R-扁桃酸。

苯乳酸在一定程度上能夠抑制使食品發(fā)生腐敗變質(zhì)的細(xì)菌和使人類患病的致病菌的生長，所以其在食品和制藥行業(yè)中有很大的發(fā)展?jié)摿Γ?7］。在乳酸脫氫酶（由ldhA編碼）的催化作用下，苯丙酮酸可生成苯乳酸［圖 4（b）］。Fujita 等［63］在高產(chǎn)L-Phe 大腸桿菌菌株中表達(dá)來自Wickerhamia fluorescens的苯丙酮酸還原酶（由pprA編碼），結(jié)合發(fā)酵條件的優(yōu)化，最終D-苯乳酸的產(chǎn)量可達(dá)29 g/L。

3.2 L-色氨酸衍生物的生物合成

L-色氨酸在相關(guān)酶催化作用下可衍生成多種具有獨(dú)特功能的芳香性化合物，如生長素（吲哚-3-乙酸）、紫色桿菌素、脫氧紫色桿菌素［85］、靛紅、靛藍(lán)和血清素等。相比于L-Phe 和L-Tyr，L-Trp 分支途徑中前體較多，所以，提高L-色氨酸衍生物產(chǎn)量是現(xiàn)階段人們應(yīng)該關(guān)注的焦點(diǎn)。

血清素，又叫5-羥色胺，在動(dòng)物中可作為神經(jīng)遞質(zhì)，具有豐富的藥用價(jià)值［98］，其還可以在相應(yīng)酶催化下生成具有商業(yè)價(jià)值的褪黑素［57］。在動(dòng)物中，L-色氨酸先后由色氨酸5-羥化酶（TPH）和色氨酸脫羧酶（TDC）催化生成血清素［圖4（c）］。而在植物中，L-色氨酸先后由TDC 和色胺5-羥化酶（T-5H）催化生成血清素［99］。Park等［70］構(gòu)建了一種重組大腸桿菌菌株，即去除T-5H 的N 末端，將優(yōu)化后的T-5H 和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)簽進(jìn)行融合后共表達(dá)，并過表達(dá)來自Catharanthus roseus的TDC，結(jié)果表明，該菌株可生產(chǎn)24 mg/L的血清素。

圖4 幾種芳香族氨基酸衍生物的具體合成途徑Fig.4 Full synthetic routes of several aromatic amino acid derivatives

靛紅和靛藍(lán)被廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)中，靛紅被用于治療白血病、癌癥和阿爾茲海默癥等疾病，靛藍(lán)可被用作天然著色劑［100］。以L-色氨酸為起始物，先后經(jīng)過色氨酸酶、單加氧酶或雙加氧酶的催化，可生成互為同分異構(gòu)體的靛藍(lán)和靛紅［圖4（d）］。韓曉紅等［71］在能夠產(chǎn)2 g/L 的L-色氨酸的大腸桿菌菌株中，引入來自Methylophaga aminisulfidivorans的黃素單加氧酶（由fmo編碼），經(jīng)過分批培養(yǎng)，得到了920 mg/L 的靛藍(lán)和5.0 mg/L 的靛紅。接著，在該菌株的基礎(chǔ)上，加入0.36 g/L 半胱氨酸，由于半胱氨酸能夠影響Fmo 的區(qū)域選擇性，進(jìn)而增強(qiáng)了靛紅前體2-羥基吲哚的合成，最后通過發(fā)酵，靛紅產(chǎn)量可達(dá)223.6 mg/L［101］。

3.3 L-酪氨酸衍生物的生物合成

以L-酪氨酸和4-羥基苯丙酮酸為前體能夠衍生出多種具有重要商業(yè)價(jià)值的芳香性化合物，如4-羥基苯乳酸、4-羥基苯乙酸、4-羥基苯乙醇、4-羥基苯乙烯、4-羥基苯甲酸、L-多巴、對羥基肉桂酸、咖啡酸、丹參素和黑色素等。

對羥基肉桂酸，又叫對羥基香豆酸，被廣泛應(yīng)用于食品、化工和醫(yī)藥等領(lǐng)域。在苯丙氨酸解氨酶（TAL）的催化下，L-酪氨酸可轉(zhuǎn)化為對羥基肉桂酸［圖4（e）］［102］。Yu等［18］構(gòu)建了一個(gè)酵母菌菌株，通過引入一個(gè)基于磷酸轉(zhuǎn)酮酶的途徑，并替換EMP 和芳香族氨基酸合成途徑中幾個(gè)重要基因的啟動(dòng)子，如用SET3p、CDC24p和ALD5p替換PFK1、PFK2 和PYK1 天然啟動(dòng)子，經(jīng)過發(fā)酵，對羥基肉桂酸的產(chǎn)量可達(dá)12.5 g/L。

L-多巴是一種重要的生物活性物質(zhì)，還是生成兒茶酚和黑色素等的重要中間產(chǎn)物，多被用來治療帕金森癥［圖 4（f）］［103］。Mu?oz 等［59］通過在大腸桿菌中引入來自Zymomonas mobilis的環(huán)己二烯脫氫酶（由tyrC編碼），并同時(shí)過表達(dá)tktA、aroFfbr、tyrA和tyrC基因，得到了大腸桿菌高產(chǎn)L-酪氨酸菌株，又通過過表達(dá)hpaBC基因（編碼4-羥基苯乙酸3-羥化酶），實(shí)現(xiàn)L-酪氨酸向L-多巴胺的轉(zhuǎn)化，經(jīng)過發(fā)酵，L-多巴產(chǎn)量可達(dá)1.51 g/L。

4 結(jié)論與展望

隨著社會(huì)的快速發(fā)展，芳香族氨基酸及其衍生物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、化工、飼料、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)，極大提高了人民的生活水平。近年來，現(xiàn)代生物技術(shù)、生物信息學(xué)、合成生物學(xué)以及代謝工程等在提高芳香族氨基酸及其衍生物產(chǎn)量方面也做出了巨大貢獻(xiàn)。本文主要從增加前體供給水平、解除關(guān)鍵酶的反饋抑制、消除阻遏蛋白的阻遏作用、敲除或者過表達(dá)相應(yīng)酶基因、菌株生長與生產(chǎn)產(chǎn)品偶聯(lián)、基于生物傳感的高通量篩選、優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件以及引入外源相關(guān)酶等方面總結(jié)了提高芳香族氨基酸及其衍生物產(chǎn)量的常用方法，為芳香族氨基酸及其衍生物的進(jìn)一步發(fā)展提供了一定的理論依據(jù)。但是，由于各種改造策略涉及的反應(yīng)機(jī)制和代謝途徑較為廣泛，所以其面臨的問題也是多種多樣。前體供給中，PEP 與E4P 供給平衡是一個(gè)有待解決的難點(diǎn)，最大程度降低消耗PEP 相關(guān)酶的活性、在不影響菌株生長情況下去除PTS系統(tǒng)以及增加流向PPP途徑的碳通量是提高PEP和E4P供給的一個(gè)很好的解決策略；芳香族氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，則是對其向胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)难芯枯^為全面，向胞外運(yùn)輸?shù)难芯繀s少之甚少，因此更高效的外排芳香族氨基酸也是有待解決的問題，而通過轉(zhuǎn)錄組分析挖掘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以有效解決這一問題；高產(chǎn)菌株獲取困難，則是因?yàn)槿狈焖儆行У暮Y選方式，通過構(gòu)建特異性的生物傳感器并結(jié)合液滴微流控以及流式細(xì)胞儀可以得到很好的解決。

在過去的十幾年里，芳香族氨基酸及其衍生物的生物合成技術(shù)已經(jīng)逐漸趨于成熟，但是大幅度提高芳香族氨基酸產(chǎn)率仍然是研究的熱點(diǎn)。對于L-Trp，其生產(chǎn)途徑較長，導(dǎo)致其前體增多，因此，就算是現(xiàn)在一些商業(yè)化L-Trp 生產(chǎn)菌株的產(chǎn)率也很難滿足市場的需求；對于L-Tyr，其相關(guān)生產(chǎn)技術(shù)尚不成熟，導(dǎo)致L-Tyr 還沒有真正實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；對于L-Phe，由于其途徑的復(fù)雜程度較高，另外，乙酸等副產(chǎn)物積累和糖酸轉(zhuǎn)化率低的問題，都間接影響著L-Phe 的產(chǎn)率。對于芳香族氨基酸衍生物，芳香族氨基酸是其主要的前體，提高芳香族氨基酸的產(chǎn)量直接影響著其衍生物的產(chǎn)量。此外，引入外來菌種相關(guān)酶的活性低也是影響芳香族氨基酸衍生物產(chǎn)量的一個(gè)重要因素。隨著一些新技術(shù)在合成生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)大幅度提高芳香族氨基酸及其衍生物產(chǎn)量的目標(biāo)指日可待。近年來，有學(xué)者結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)的相關(guān)理論，采用計(jì)算機(jī)蛋白設(shè)計(jì)軟件分析酶、改造酶等方法來解除芳香族氨基酸途徑中關(guān)鍵酶的反饋抑制［104］。此外，雙功能酶的概念逐漸深入人心，它極大地提高了酶的催化效率，部分學(xué)者通過對大腸桿菌高產(chǎn)菌株的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)SHIK 途徑中相關(guān)酶（比如脫氫奎尼酸合酶、莽草酸脫氫酶）的代謝通量都比較低，嚴(yán)重降低了芳香族氨基酸的產(chǎn)率，Lee 等［105］通過在大腸桿菌中引入一種來自木本植物的雙功能酶脫氫奎寧酸脫水酶-莽草酸脫氫酶（DHQ-SDH）來提高SHIK 代謝通量，從而達(dá)到提高芳香族氨基酸的產(chǎn)量的目的。近年來，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的迅速發(fā)展，以計(jì)算機(jī)為輔助工具改造酶的方法也層出不窮，比如AlphaFold 算法精準(zhǔn)預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)的功能為酶改造提供了一個(gè)很好的平臺(tái)，其改造酶的方法有助于解決合成途徑中關(guān)鍵酶反饋抑制的問題，有望應(yīng)用到芳香族氨基酸的改造生產(chǎn)中。代謝工程的發(fā)展讓人們意識(shí)到其對芳香族氨基酸工業(yè)化生產(chǎn)的重要性，并且計(jì)算機(jī)從頭設(shè)計(jì)酶為其提供了一定的技術(shù)支撐［106］，為設(shè)計(jì)新途徑提供了一種很好的方法，如Yang 等［107］利用C1化合物生產(chǎn)化學(xué)品，通過對代謝反應(yīng)進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，并進(jìn)行動(dòng)力學(xué)評估，構(gòu)建出了一個(gè)新的C1同化途徑，最終獲得了88%的碳產(chǎn)率。在芳香族氨基酸合成途徑中，PEP 和E4P 合成DAHP 的這步反應(yīng)，主要前體PEP在生成的同時(shí)，也會(huì)被消耗一部分，可以仿照上述方法構(gòu)建一個(gè)新途徑來提高PEP 的供給，從而達(dá)到提高DAHP 的產(chǎn)量的目的。另外，利用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)分析代謝途徑和體外反應(yīng)也是一種新潮的技術(shù)。在芳香族氨基酸菌株構(gòu)建方面，理性改造雖然是芳香族氨基酸高產(chǎn)菌株構(gòu)建的研究熱點(diǎn)，但非理性篩選是高產(chǎn)菌株構(gòu)建的主流方式，例如定向進(jìn)化，d’Oelsnitz和Ellington［108］發(fā)現(xiàn)連續(xù)性定向性進(jìn)化可以將所有操作無縫集成到一個(gè)完整的進(jìn)化周期中，在精確控制培養(yǎng)參數(shù)的同時(shí)，還可以在線檢測和監(jiān)控相關(guān)參數(shù)細(xì)胞生長或生產(chǎn)力。至于突變菌株的產(chǎn)生，則可以通過易錯(cuò)PCR 和位點(diǎn)飽和誘變等方式在目的基因上進(jìn)行體外隨機(jī)誘變。此外，Bryson等［109］與Song等［110］構(gòu)建了體內(nèi)全基因組誘變的方法。Song 等［110］使用 DNA 聚合酶-復(fù)制子系統(tǒng)（OrthoRep）構(gòu)建了一種簡化的加速定向進(jìn)化的生物工程學(xué)方法。Badran 等［111］則使用質(zhì)粒突變體進(jìn)行定向進(jìn)化，可以分別在目的基因上和目的基因外發(fā)生突變，這對解決需要同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)基因的多種靶標(biāo)的問題有很大意義。隨著基因靶向技術(shù)（例如CRISPR/Cas9 技術(shù)）的出現(xiàn)，已開發(fā)出在特定基因座進(jìn)行基因工程改造的更 精 確 的 技 術(shù) ， 例 如 Jako?iūnas 等［112］開 發(fā) 了CasPER，Halperin等［113］則開發(fā)了EvolvR。這些前沿技術(shù)有望能應(yīng)用于芳香族氨基酸的生產(chǎn)，為提高其產(chǎn)量和改變其合成途徑提供借鑒意義。以L-Trp 合成為例，利用計(jì)算機(jī)分析設(shè)計(jì)新的高效合成途徑以減少碳損失；對合成途徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行定向改造，提高其催化效率；通過新型的多基因堿基編輯技術(shù)大幅縮短菌株構(gòu)建周期，即可在短期內(nèi)獲得轉(zhuǎn)化率與產(chǎn)量顯著提高的菌株。雖然只是一種設(shè)想，但在目前的技術(shù)條件下，具有很高的可行性。期待在不久的將來，隨著人們對五大組學(xué)研究的不斷深入，同時(shí)結(jié)合生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和合成生物學(xué)等的相關(guān)理論，可以真正實(shí)現(xiàn)芳香族氨基酸及其衍生物高產(chǎn)菌株的快速構(gòu)建。