陳久洲，王鈺，蒲偉，鄭平，孫際賓

（中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308）

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA）是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，在生命體中廣泛存在，是血紅素、葉綠素、維生素B12等四吡咯化合物生物合成的必需前體。由于在生物體內(nèi)所處的關(guān)鍵代謝節(jié)點(diǎn)及其下游代謝物的重要生理功能，5-ALA在醫(yī)藥、保健、動(dòng)物健康和植物營養(yǎng)等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景［1］。作為第二代光敏劑，5-ALA 從20 世紀(jì)90 年代就開始用于皮膚類疾病的光動(dòng)力學(xué)治療以及癌癥的光動(dòng)力學(xué)診斷和輔助切除［2-3］。基于血紅素和維生素B12在動(dòng)物能量和物質(zhì)代謝中的重要作用，外源補(bǔ)充5-ALA可以促進(jìn)人體和畜禽的新陳代謝，增強(qiáng)機(jī)體活力和免疫力［4］。由于具有生物可降解和無毒無殘留的特性，5-ALA 還被用作綠色安全的植物生長調(diào)節(jié)劑，用于促進(jìn)作物在逆境條件下的生長以及果實(shí)著色等［5］。廣闊的應(yīng)用前景也吸引了研究人員不斷嘗試開發(fā)并改進(jìn)5-ALA 的合成技術(shù)。目前，5-ALA 主要通過化學(xué)合成法生產(chǎn)，然而化學(xué)合成工藝的高復(fù)雜性和高污染限制了其工業(yè)化生產(chǎn)的規(guī)模，目前國內(nèi)甚至沒有企業(yè)能夠一次性提供百公斤規(guī)模的產(chǎn)品；多步催化反應(yīng)以及低產(chǎn)物收率也進(jìn)一步推高了產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，從而限制了其在各領(lǐng)域中的大規(guī)模應(yīng)用推廣［6］。

生物體內(nèi)有兩條5-ALA 生物合成途徑，即C4途徑和C5途徑，分別以琥珀酰輔酶A 和甘氨酸、谷氨酸為底物，通過一步或三步酶促反應(yīng)合成5-ALA，然后再經(jīng)過多步酶促反應(yīng)生產(chǎn)血紅素等終產(chǎn)物（圖1）［7］。血紅素是胞內(nèi)電子傳遞的載體以及多種酶的輔酶，對(duì)于細(xì)胞能量代謝至關(guān)重要，生物體進(jìn)化出多種調(diào)控方式，以維持胞內(nèi)血紅素的穩(wěn)態(tài)［8］。由于5-ALA 是血紅素生物合成的必需前體，其生物合成也受血紅素的嚴(yán)緊調(diào)控。因此，盡管5-ALA 生物合成技術(shù)的研究幾乎與化學(xué)合成技術(shù)同時(shí)開始，但早期生物合成技術(shù)的水平很低，無法滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求。伴隨著生物技術(shù)的多輪重大變革，5-ALA 生物合成技術(shù)也不斷發(fā)展，技術(shù)水平得到了顯著的提升［9-14］。5-ALA 生物合成技術(shù)替代傳統(tǒng)化學(xué)合成技術(shù)，降低生產(chǎn)成本，并在農(nóng)業(yè)和畜牧等領(lǐng)域大規(guī)模推廣應(yīng)用已經(jīng)是大勢所趨。本文以技術(shù)發(fā)展為主線，綜述了5-ALA 生物合成技術(shù)的發(fā)展歷程，詳細(xì)介紹了近年來系統(tǒng)代謝工程和合成生物技術(shù)對(duì)5-ALA 生物合成的重要推動(dòng)作用，并展望了在合成生物技術(shù)時(shí)代5-ALA 的生物合成策略的發(fā)展方向。

圖1 5-ALA及四吡咯化合物生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis of 5-ALA and tetrapyrrole compounds

1 天然菌株誘變篩選

從20 世紀(jì)70 年代開始，研究者從自然界中篩選能夠天然高產(chǎn)5-ALA 的微生物，單細(xì)胞的藻類和光合細(xì)菌是主要的菌株種類。1970 年，Beale等［15］篩選到一株小球藻（Chlorella），可以利用CO2積累ALA，開啟了5-ALA 生物合成研究的序幕。1987—1998 年，Sasaki 等［6，16-17］篩選到一株類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides），通過大量發(fā)酵條件優(yōu)化后，以琥珀酸和甘氨酸為底物合成5-ALA 的最高產(chǎn)量達(dá)到2.1 g/L。由于胞內(nèi)嚴(yán)緊調(diào)控和自身代謝能力的限制，自然選育獲得的菌種產(chǎn)量普遍較低，且一般培養(yǎng)過程需要光照，工藝過程復(fù)雜，對(duì)裝備要求較高，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)受限。

為了進(jìn)一步提升菌種合成能力，誘變育種技術(shù)逐步用于ALA 高產(chǎn)菌株的篩選。1999—2002 年，Nishikawa 等［18-19］對(duì)前期自然選育獲得的類球紅細(xì)菌進(jìn)行連續(xù)誘變育種，最終篩選得到一株高產(chǎn)ALA菌株CR-702，在好氧和無光條件下發(fā)酵74 h，5-ALA 產(chǎn)量達(dá)到了7.2 g/L。日本科斯莫石油公司利用上述菌種開發(fā)了工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)工藝，在5 t/a設(shè)施中5-ALA產(chǎn)量為10 g/L，并將生產(chǎn)成本降至化學(xué)合成法的1/10［20］。

盡管利用基于天然菌株誘變篩選的生物合成技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了5-ALA 的產(chǎn)業(yè)化，但是由于發(fā)酵周期較長，技術(shù)水平也相對(duì)較低，使得5-ALA 生產(chǎn)成本仍然較高，難以滿足農(nóng)業(yè)和畜牧等低附加值領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。此外，誘變育種技術(shù)的自身限制也使得5-ALA 產(chǎn)量繼續(xù)提升的難度較大，隨著基因工程技術(shù)的出現(xiàn)和快速發(fā)展，這種傳統(tǒng)的微生物育種技術(shù)也逐漸被新興技術(shù)所取代。

2 利用重組外源C4途徑的E.coli 催化合成5-ALA

20 世紀(jì)90 年代以來，隨著基因測序和克隆表達(dá)技術(shù)的快速發(fā)展，異源酶在模式微生物中的表達(dá)技術(shù)日漸成熟。1996 年，van der Werf 等［21］首次將來源于類球紅細(xì)菌的5-ALA 合成酶（5-aminolevulinic acid synthase，ALAS）編碼基因在大腸桿菌（Escherichia coli）DH1 中克隆表達(dá)，開創(chuàng)了5-ALA 異源生物轉(zhuǎn)化的先河。通過外源添加前體物質(zhì)琥珀酸和甘氨酸，利用表達(dá)異源ALAS的大腸桿菌合成5-ALA，也成為了這一時(shí)期5-ALA 生物合成的主要研究方向和常用技術(shù)手段。由于只涉及一步酶催化反應(yīng)，ALAS 的表達(dá)是這一技術(shù)策略的核心要素。因此，在之后的近20年間，大量不同來源的ALAS被挖掘以期獲得更高的生產(chǎn)水平［22-28］。其中，浙江大學(xué)林建平研究團(tuán)隊(duì)［26，29-33］通過不同來源ALAS 的篩選和表達(dá)優(yōu)化，結(jié)合下游代謝抑制劑的添加和溶氧控制等發(fā)酵工藝優(yōu)化，將基因工程菌株生產(chǎn)5-ALA 的最高產(chǎn)量提高到了9.4 g/L，而發(fā)酵周期只需要22 h。

利用重組外源C4途徑的菌株可以在更短的生產(chǎn)周期內(nèi)，將5-ALA 的產(chǎn)量積累到10 g/L 左右，與前一階段的光合細(xì)菌相比具有顯著的優(yōu)勢，展現(xiàn)了基因工程菌株的強(qiáng)大競爭力。然而，該技術(shù)策略前期只是關(guān)注天然酶源的挖掘和過表達(dá)，未能從調(diào)控層面解決酶受血紅素反饋抑制等問題，導(dǎo)致技術(shù)水平難以繼續(xù)提升。近年來，一些新的策略開始用于上述重組菌株的優(yōu)化提升。Yu 等［34］利用TrxA 融合標(biāo)簽，結(jié)合伴侶蛋白GroELS 的共表達(dá)，提高了可溶性蛋白的比例，5-ALA 產(chǎn)量從1.21 g/L 提高到了3.67 g/L，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝后5-ALA 產(chǎn)量達(dá)到了5.66 g/L。針對(duì)ALAS 的酶學(xué)性質(zhì)，本文作者團(tuán)隊(duì)首次關(guān)注并挖掘鑒定了新型抗血紅素反饋抑制的ALAS——沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）來源的HemO，在野生型大腸桿菌MG1655 中表達(dá)后5-ALA 產(chǎn)量達(dá)到了6.3 g/L，與其他ALAS 相比具有明顯的優(yōu)勢［35］；進(jìn)一步解除產(chǎn)物毒性的限制因素以后，5-ALA產(chǎn)量達(dá)到了11.5 g/L，突破了長期以來10 g/L左右的產(chǎn)量限制［36］。

盡管利用重組外源C4途徑的E. coli催化合成5-ALA 的技術(shù)已經(jīng)取得了一定的研究進(jìn)展，然而基于該技術(shù)的5-ALA 產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模還非常有限，原因主要在于其菌種水平仍然較低，底物琥珀酸和甘氨酸以及乙酰丙酸等下游代謝抑制劑的同時(shí)添加也使得該技術(shù)成本較高，工業(yè)放大穩(wěn)定性差，難以大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。未來基于蛋白結(jié)構(gòu)的ALAS 酶學(xué)性質(zhì)的改造提升或?qū)⒂兄谶M(jìn)一步突破現(xiàn)有技術(shù)屏障，實(shí)現(xiàn)技術(shù)指標(biāo)的繼續(xù)提升。

3 基于代謝工程的5-ALA 生物合成技術(shù)

1991 年，代謝工程概念的提出將基因工程技術(shù)的發(fā)展帶入了一個(gè)新階段，在此后的30 年間，系統(tǒng)代謝工程技術(shù)不斷完善，并實(shí)現(xiàn)了一大批生物能源和精細(xì)化學(xué)品的生物合成［37-38］。代謝工程技術(shù)在5-ALA 生物合成中的應(yīng)用起步相對(duì)較晚，主要使用的菌種是大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum），特別是大腸桿菌因?yàn)檫z傳背景相對(duì)清晰，分子操作手段和工具相對(duì)完善，成為該時(shí)期分子改造的主力菌種。2007 年，Shin 等［39］在引入異源 C4途徑的大腸桿菌中共表達(dá)蘋果酸酶，厭氧條件下通過TCA 還原臂以葡萄糖為底物提供琥珀酰輔酶A，5-ALA 的產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了50%，開創(chuàng)了基于代謝工程的5-ALA 生物合成新紀(jì)元。系統(tǒng)代謝工程技術(shù)強(qiáng)調(diào)途徑的整合構(gòu)建以及細(xì)胞生理的系統(tǒng)分析和迭代改造，從細(xì)胞整體層面解析產(chǎn)物高產(chǎn)的限制，提升菌種的發(fā)酵性能。具體到5-ALA 高產(chǎn)菌株的構(gòu)建，技術(shù)層面涵蓋了改造提升關(guān)鍵酶、重構(gòu)優(yōu)化合成途徑、強(qiáng)化前體供給、控制下游代謝、加速產(chǎn)物外排以及整體調(diào)控代謝通路等系統(tǒng)代謝工程的常用改造策略，構(gòu)建了一系列菌種（表1）。

表1 利用代謝工程改造的大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌合成5-ALATab.1 Bioproduction of 5-ALA by metabolically engineered E.coli and C.glutamicum

續(xù)表

3.1 5-ALA合成途徑關(guān)鍵酶的性能提升

合成途徑的關(guān)鍵酶具有良好的酶學(xué)性質(zhì)和胞內(nèi)活性，可以快速催化底物轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物，并將代謝流持續(xù)引入產(chǎn)物的合成途徑，這是高效細(xì)胞工廠構(gòu)建的關(guān)鍵。C4和C5途徑的關(guān)鍵酶ALAS和谷氨酰tRNA 還原酶（glutamyl-tRNA reductase，GluTR）不僅受到血紅素的反饋抑制，同時(shí)也存在蛋白不穩(wěn)定的問題［8］。因此，上述兩種酶催化性質(zhì)的提升和活性的維持也就成為5-ALA 細(xì)胞工廠構(gòu)建需要解決的第1個(gè)關(guān)鍵問題。

盡管ALAS的蛋白結(jié)構(gòu)很早就已經(jīng)被解析并報(bào)道［69］，但目前針對(duì)5-ALA 合成途徑關(guān)鍵酶改造的研究相對(duì)較少。作者團(tuán)隊(duì)［70］基于本實(shí)驗(yàn)室挖掘并解析的ALAS蛋白結(jié)構(gòu)，借助計(jì)算機(jī)輔助的蛋白理性設(shè)計(jì)，對(duì)氨基酸序列中所有可能與血紅素相互作用的組氨酸殘基進(jìn)行保守性分析和突變氨基酸預(yù)測，并通過定點(diǎn)突變和酶活檢測篩選獲得了熱穩(wěn)定性明顯提高，且抗血紅素反饋抑制的新型ALAS突變體，在工程菌株中應(yīng)用后5-ALA產(chǎn)量比對(duì)照菌株提高了22%。針對(duì)GluTR 受血紅素反饋調(diào)控的問題，前期研究發(fā)現(xiàn)N 末端結(jié)構(gòu)域?qū)ι抽T菌（Salmonella arizona）來源的GluTR 穩(wěn)定性具有重要的作用，而在第2位蘇氨酸殘基后引入兩個(gè)帶正電的賴氨酸殘基可以明顯提高蛋白的穩(wěn)定性，并表現(xiàn)出抗血紅素反饋調(diào)控的作用［71-72］。山東大學(xué)祁慶生團(tuán)隊(duì)［56］首次在大腸桿菌中利用上述突變體重構(gòu)了C5途徑，重組菌株5-ALA 產(chǎn)量是表達(dá)內(nèi)源GluTR菌株的4倍。Zhang等［73］進(jìn)一步研究了插入不同數(shù)量的陽離子氨基酸殘基（賴氨酸和精氨酸）對(duì)GluTR 蛋白穩(wěn)定性和活性的影響，發(fā)現(xiàn)插入兩個(gè)精氨酸殘基的突變酶效果最好，表達(dá)上述突變酶的菌株5-ALA產(chǎn)量比對(duì)照菌株提高了76.8%。

3.2 5-ALA下游代謝調(diào)控

5-ALA 脫水酶（ALAD）是ALA 下游代謝的第1個(gè)關(guān)鍵酶，控制著下游的整體代謝通量，因此其編碼基因hemB成為下游代謝控制的主要靶點(diǎn)。前期的基因工程技術(shù)中5-ALA 的下游代謝控制主要通過添加ALAD 的抑制劑，成本高且增加工藝控制復(fù)雜度。進(jìn)入代謝工程發(fā)展階段以后，通過調(diào)控hemB基因的表達(dá)或改變其酶活性降低5-ALA的下游代謝，逐漸成為主流技術(shù)手段。最直接的策略是完全阻斷5-ALA 的下游代謝，導(dǎo)致5-ALA積累。作者團(tuán)隊(duì)［74-75］利用無痕敲除技術(shù)獲得了大腸桿菌hemB敲除菌株，但也帶來了菌株生長變?nèi)醯膯栴}，研究人員對(duì)上述菌株進(jìn)行紫外誘變，獲得了可以利用外源血紅素正常生長的突變菌株，引入異源ALAS后，建立了一條血紅素依賴型的5-ALA 的生物合成路線。另一個(gè)策略是弱化ALAD的表達(dá)或降低酶活性，減少5-ALA 的下游代謝。作者團(tuán)隊(duì)［44］通過隨機(jī)突變和生長篩選獲得酶活下降的ALAD 突變體，將其回補(bǔ)hemB敲除后菌株生長基本恢復(fù)正常，5-ALA 產(chǎn)量也得到了明顯提升。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員進(jìn)一步通過在ALAD 的C 末端添加蛋白降解標(biāo)簽［65］、替換更弱的起始密碼子［46］或核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）［67］等方式，下調(diào)了ALAD 的表達(dá)量，提高了5-ALA產(chǎn)量。

此外，血紅素合成模塊的整體調(diào)控也被深入研究，以探尋提高5-ALA 產(chǎn)量的新靶點(diǎn)。Yu 等［76］利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)5-ALA 的過量合成會(huì)上調(diào)TCA 循環(huán)、磷酸戊糖途徑以及血紅素合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)，并啟動(dòng)內(nèi)源血紅素響應(yīng)和調(diào)控機(jī)制，以降低中間代謝物以及血紅素的過量積累，這預(yù)示著下游代謝對(duì)5-ALA 的合成存在更復(fù)雜的調(diào)控作用。Zhang 等［58］在大腸桿菌中系統(tǒng)研究了血紅素合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)5-ALA 合成的影響，發(fā)現(xiàn)尿卟啉原Ⅲ合成酶（hemD基因編碼）過表達(dá)可以上調(diào)5-ALA 及血紅素合成途徑多個(gè)基因的表達(dá)，而糞卟啉原Ⅲ氧化酶（hemF基因編碼）過表達(dá)產(chǎn)生的原卟啉原Ⅸ則反饋抑制ALAD 的酶活，hemD和hemF共表達(dá)后5-ALA 產(chǎn)量從1.82 g/L 提高到了3.25 g/L。在此基礎(chǔ)上，研究人員通過優(yōu)化外源鐵離子的添加量，組合調(diào)控了5-ALA 的合成及下游代謝，5-ALA 產(chǎn)量進(jìn)一步提高到了4.05 g/L［59］。

3.3 基于C5途徑的代謝工程改造

鑒于大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌通過內(nèi)源的C5途徑合成5-ALA，因此基于C5途徑的代謝工程改造首先被關(guān)注。2011 年，山東大學(xué)祁慶生團(tuán)隊(duì)［56］首次在大腸桿菌中對(duì)C5途徑進(jìn)行改造和優(yōu)化，通過共表達(dá)沙門菌（Salmonella arizona）來源的GluTR和內(nèi)源GSAM，強(qiáng)化谷氨酸到5-ALA合成的代謝流，實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖為碳源的5-ALA 生物合成，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)RhtA 可以促進(jìn)5-ALA外排，5-ALA 產(chǎn)量達(dá)到了4.13 g/L。2015 年，利用谷氨酸棒桿菌為宿主通過強(qiáng)化C5途徑合成5-ALA的技術(shù)也被成功開發(fā)，通過組合表達(dá)不同來源的GluTR和GSAM，構(gòu)建獲得的工程菌株最高產(chǎn)量達(dá)到了2.2 g/L［65-66］。

由于谷氨酸是C5途徑合成ALA 的直接前體，因此有研究者借鑒或者直接利用谷氨酸高產(chǎn)菌株和工藝控制，嘗試通過提高谷氨酸的積累量促進(jìn)5-ALA 的合成。Zhang 等［67］通過敲除谷氨酸高產(chǎn)菌株S914 中的谷氨酸外排蛋白NCgl1221、精氨酸外排蛋白LysE 和脯氨酸外排蛋白PutP，減少了胞內(nèi)谷氨酸的消耗，有效提高5-ALA 的產(chǎn)量。Ko等［77］將α-酮戊二酸脫氫酶抑制蛋白 OdhI 的第14 位和15 位蘇氨酸突變?yōu)楸彼?，通過阻止其磷酸化以保持對(duì)α-酮戊二酸脫氫酶的抑制作用，過表達(dá)后使碳流更多地從TCA 循環(huán)進(jìn)入谷氨酸合成途徑，提高了5-ALA 產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。此外，上述兩項(xiàng)研究也證明在培養(yǎng)基中添加青霉素G、吐溫40 或乙胺丁醇等提高谷氨酸合成的策略同樣可以提高5-ALA的產(chǎn)量。

提高中心代謝進(jìn)入谷氨酸合成途徑的代謝通量也是嘗試的策略之一。Li 等［57］發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中過表達(dá)一種鐵代謝調(diào)控相關(guān)的sRNA——ryhB，可以下調(diào)sdhCDAB（琥珀酸脫氫酶編碼基因）、hemB和hemH（亞鐵螯合酶編碼基因）的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)上調(diào)gltX（谷氨酰tRNA合成酶編碼基因）的轉(zhuǎn)錄，提高了5-ALA 的產(chǎn)量，并降低血紅素的積累。Noh 等［60］在過表達(dá) GluTR 和 GSAM 的大腸桿菌中敲除α-酮戊二酸脫氫酶編碼基因sucA，提高了碳流進(jìn)入谷氨酸合成途徑的通量，進(jìn)一步通過異檸檬酸裂解酶（aceA基因編碼）表達(dá)的精細(xì)調(diào)控強(qiáng)化乙醛酸循環(huán)，平衡了菌體生長和產(chǎn)物合成的代謝流，降低了乙酸的積累，5-ALA 產(chǎn)量達(dá)到了3.4 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到了0.28 g/g。

在上述策略的基礎(chǔ)上，江南大學(xué)康振團(tuán)隊(duì)［64］以大腸桿菌為宿主對(duì)C5途徑進(jìn)行系統(tǒng)代謝工程改造，組合GluTR 和GSAM 的精細(xì)表達(dá)調(diào)控策略、強(qiáng)化內(nèi)源PLP 合成途徑的輔因子工程策略、基于生長時(shí)期調(diào)控的5-ALA 下游代謝弱化策略以及基于recA和endA缺失菌株的質(zhì)粒穩(wěn)定性改造策略，獲得的工程菌株在3 L 發(fā)酵罐中5-ALA 產(chǎn)量達(dá)到了5.25 g/L。Zhang 等［68］以谷氨酸棒桿菌為宿主，通過C5途徑構(gòu)建和優(yōu)化、ATP、NADPH、PLP 等輔因子合成途徑強(qiáng)化、TCA 循環(huán)弱化以及表達(dá)RhtA，將利用谷氨酸棒桿菌C5途徑合成5-ALA 產(chǎn)量提高到了3.16 g/L。Zhao 等［63］在大腸桿菌中引入擬南芥（Arabidopsis thaliana）來源的GluTR 及其激活蛋白GBP，搭建了外源C5合成途徑；通過優(yōu)化宿主菌株，確定了補(bǔ)充6 個(gè)稀有密碼子tRNA的Transetta （DE3）菌株作為宿主5-ALA 產(chǎn)量最高，在培養(yǎng)基中添加前體谷氨酸后5-ALA 產(chǎn)量提高到了7.64 g/L。

3.4 基于C4途徑的代謝工程改造

雖然C4途徑合成5-ALA 的步驟簡單，然而由于涉及兩種底物的共同參與，因此基于C4途徑的代謝工程改造需要平衡多條代謝途徑，以確保琥珀酰CoA 和甘氨酸的有效供給。甘氨酸在生物體內(nèi)存在多條生物合成途徑，具備通過代謝改造實(shí)現(xiàn)甘氨酸內(nèi)源供給的可能性。2017 年，江南大學(xué)康振團(tuán)隊(duì)［46］和Zou等［54］分別在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中嘗試了通過強(qiáng)化常規(guī)的絲氨酸生物合成途徑以及絲氨酸到甘氨酸的轉(zhuǎn)化，希望達(dá)到部分或完全替代甘氨酸外源添加的目的。然而，上述改造獲得的菌株在不添加甘氨酸的條件下5-ALA整體產(chǎn)量較低（<3 g/L），也說明了利用內(nèi)源甘氨酸合成和代謝調(diào)控的復(fù)雜性。因此，目前基于C4途徑合成5-ALA 的技術(shù)主要還是以外源添加甘氨酸為主。

琥珀酰輔酶A 是TCA 循環(huán)的中間代謝物，處于TCA 循環(huán)和5-ALA 合成的分支節(jié)點(diǎn)，強(qiáng)化琥珀酰輔酶A的供給可以通過ALAS將更多的代謝流引入5-ALA 合成途徑，并實(shí)現(xiàn)葡萄糖對(duì)琥珀酸的底物替代，因此大量研究關(guān)注如何提高琥珀酰輔酶A的合成通量。Kang等［40］在一株好氧條件下高產(chǎn)琥珀酸的代謝工程菌株中引入外源ALAS，實(shí)現(xiàn)了5-ALA 的合成。作者團(tuán)隊(duì)［41］通過在大腸桿菌中敲除sucCD（琥珀酰輔酶A 合成酶編碼基因）或sdhAB，阻斷TCA 循環(huán)并增加琥珀酰-CoA 的供應(yīng)，在不添加琥珀酸的條件下將5-ALA 的產(chǎn)量提高到了6.38 g/L；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中強(qiáng)化輔酶A 生物合成或弱化乙醛酸循環(huán)途徑，同樣可以提高琥珀酰輔酶A 的供給能力，有利于5-ALA 的生物合成［43，48］。Miscevic 等［51］對(duì) ALAD 弱化菌株的TCA 循環(huán)進(jìn)行代謝改造，在好氧條件下敲除sdhA，厭氧條件下敲除sdhA和iclR（乙醛酸循環(huán)抑制蛋白），增加前體琥珀酰輔酶A 的積累以及進(jìn)入5-ALA 合成途徑的代謝通量，以甘油為底物在微氧和好氧條件下5-ALA 的產(chǎn)量分別達(dá)到了5.95 g/L 和6.93 g/L。山東大學(xué)祁慶生團(tuán)隊(duì)［53］在谷氨酸棒桿菌中通過敲除sucCD強(qiáng)化了琥珀酰輔酶A胞內(nèi)供給，補(bǔ)料分批發(fā)酵5-ALA產(chǎn)量達(dá)到了7.6 g/L；進(jìn)一步過表達(dá)RhtA 強(qiáng)化5-ALA 外排，并利用“生長-產(chǎn)酸”兩階段發(fā)酵工藝將5-ALA 的產(chǎn)量提高到了14.7 g/L。

增加碳流從EMP 途徑進(jìn)入TCA 循環(huán)的代謝通量，同時(shí)弱化乙酸等支路代謝途徑，對(duì)于提高以TCA 循環(huán)代謝物及其衍生物的產(chǎn)量至關(guān)重要［78-79］。作者團(tuán)隊(duì)［42］首先關(guān)注了四碳回補(bǔ)途徑在5-ALA 合成中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ppc或pyc可以大幅提高5-ALA 的產(chǎn)量。天津大學(xué)王智文團(tuán)隊(duì)［52］在谷氨酸棒桿菌中引入C4合成途徑，通過敲除乳酸和乙酸合成途徑，強(qiáng)化四碳回補(bǔ)途徑，提高了5-ALA 的合成能力；進(jìn)一步敲除與細(xì)胞壁合成相關(guān)的青霉素結(jié)合蛋白，同時(shí)過表達(dá)5-ALA 外排蛋白R(shí)htA，通過增加細(xì)胞壁的通透性，降低了產(chǎn)物在胞內(nèi)的消耗，5 L 發(fā)酵罐中補(bǔ)料分批發(fā)酵5-ALA 的產(chǎn)量達(dá)到了7.53 g/L。作者團(tuán)隊(duì)［80］對(duì)谷氨酸棒桿菌利用C4途徑合成5-ALA 的發(fā)酵工藝進(jìn)行了全面優(yōu)化，在5 L發(fā)酵罐中通過補(bǔ)料分批發(fā)酵將5-ALA 的產(chǎn)量提高到了10.1 g/L；進(jìn)一步對(duì)在谷氨酸棒桿菌中引入的外源ALAS以及內(nèi)源磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ppc基因編碼）的表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，實(shí)現(xiàn)了外源途徑與底盤代謝的“精準(zhǔn)匹配”以及前體供給樞紐節(jié)點(diǎn)代謝流的“精準(zhǔn)分配”，優(yōu)化后5-ALA 產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了45%，5 L 發(fā)酵罐中以葡萄糖為碳源5-ALA 產(chǎn)量達(dá)到了16.3 g/L；最后，研究人員進(jìn)一步測試了木薯渣水解液、糖蜜等廉價(jià)粗原料的應(yīng)用效果，發(fā)現(xiàn)木薯渣水解液的使用對(duì)5-ALA合成有明顯的促進(jìn)作用，產(chǎn)量提高到了18.5 g/L，為目前已報(bào)道的5-ALA生物合成的最高產(chǎn)量［55］。

3.5 5-ALA與其他化合物的聯(lián)產(chǎn)

通過代謝途徑搭建，利用單個(gè)細(xì)胞同時(shí)合成兩種化合物，是一種有效降低生產(chǎn)成本的生物合成策略［81］。Li 等［45］在大腸桿菌中引入釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）來源的ALAS，通過密碼子優(yōu)化、表達(dá)強(qiáng)化、最適宿主篩選以及自誘導(dǎo)系統(tǒng)和質(zhì)粒穩(wěn)定系統(tǒng)改造，提高了5-ALA 合成能力；在此基礎(chǔ)上，研究者過表達(dá)聚羥基丁酸酯（poly-3-hydroxybutyrate，PHB）合成途徑的基因，實(shí)現(xiàn)了胞外5-ALA（1.6 g/L）和胞內(nèi)PHB（43%）的聯(lián)產(chǎn)。Zhang 等［61］利用類似策略在大腸桿菌中組合C5途徑和聚羥基脂肪酸合成途徑，同樣實(shí)現(xiàn)了5-ALA（3.2 g/L）與PHB（38.2%）的協(xié)同生產(chǎn)。在上述體系中，PHB 途徑的引入可以降低5-ALA 合成的主要副產(chǎn)物乙酸的積累，并提高菌株的環(huán)境適應(yīng)能力，而5-ALA 積累引起的高血紅素濃度可以強(qiáng)化呼吸鏈，提高能量合成和中心碳代謝的流量，促進(jìn)PHB 的合成。5-ALA 與PHB 等胞內(nèi)代謝物的協(xié)同生產(chǎn)可以進(jìn)一步提高碳源利用率，降低產(chǎn)品綜合生產(chǎn)成本。

相對(duì)于基因工程技術(shù)中主要依賴于ALAS過表達(dá)的技術(shù)策略，基于系統(tǒng)代謝工程的多策略組合具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢，5-ALA 生物合成的障礙也逐步被發(fā)現(xiàn)和解除。經(jīng)過大量的研究和菌種改造，5-ALA 的產(chǎn)量指標(biāo)不僅提升到了近20 g/L 的水平［55］，發(fā)酵工藝和底物也大幅簡化，避免了琥珀酸和抑制劑的添加，部分高水平技術(shù)體系已經(jīng)具備了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的條件，為5-ALA 在農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的大規(guī)模應(yīng)用推廣奠定了重要的工作基礎(chǔ)。

4 合成生物元件和技術(shù)在5-ALA 生物合成中的應(yīng)用

近年來，合成生物技術(shù)與代謝工程的深度融合為生物合成提供了強(qiáng)大的工具支持。2017 年以來，大量新元件和新技術(shù)在5-ALA 生物合成中成功應(yīng)用，為5-ALA 生物合成技術(shù)的發(fā)展增加了新的動(dòng)力。

4.1 新途徑設(shè)計(jì)

目前基于C4途徑的5-ALA 生物合成的技術(shù)水平具有明顯優(yōu)勢，如果能夠避免甘氨酸的外源添加將進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，然而內(nèi)源供給甘氨酸的前期嘗試尚未能有效解決該問題［46，54］。人工途徑設(shè)計(jì)可以突破自然進(jìn)化的限制，規(guī)避內(nèi)源途徑的代謝調(diào)控，是合成生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域之一，并已經(jīng)在多種重要化合物的合成中成功應(yīng)用［82］。Ren 等［47］根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的分解和重排，設(shè)計(jì)了從乙醛酸到甘氨酸的新型合成途徑，由于不涉及碳原子的損失，新途徑相對(duì)于內(nèi)源甘氨酸合成途徑具有更高的原子經(jīng)濟(jì)性（100 vs 67）；研究者通過評(píng)價(jià)不同來源丙氨酸：乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶的效果，確定了最適酶源，將上述途徑引入表達(dá)異源ALAS的大腸桿菌，同時(shí)強(qiáng)化aceA基因的表達(dá)，搭建了以葡萄糖為唯一碳源的新型前體供給途徑，5-ALA產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了38%，達(dá)到521 mg/L。雖然現(xiàn)有研究中人工途徑的合成能力還相對(duì)有限，但未來更多新酶設(shè)計(jì)并組合多水平調(diào)控元件的應(yīng)用將會(huì)逐步展開，以更好地匹配5-ALA 的合成速度。

4.2 基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)在5-ALA合成中的應(yīng)用

關(guān)鍵基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控優(yōu)化需要強(qiáng)度適宜的啟動(dòng)子或RBS 等調(diào)控元件，或者借助CRISPRi（clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference）等新型調(diào)控工具實(shí)現(xiàn)。挖掘或設(shè)計(jì)改造元件庫、開發(fā)調(diào)控工具也是合成生物技術(shù)重要的研究內(nèi)容［83］。目前這些策略已經(jīng)在5-ALA的生產(chǎn)菌株改造中廣泛使用。

調(diào)控元件方面，Noh 等［60］利用不同強(qiáng)度啟動(dòng)子，在sucA敲除菌株中精細(xì)調(diào)控了aceA的表達(dá)，獲得了乙醛酸循環(huán)的最適強(qiáng)度，提高了菌體的生長及 5-ALA 的產(chǎn)量。江南大學(xué)康振團(tuán)隊(duì)［46，64］利用RBS 工程策略，分別對(duì)ALAS 以及C5途徑基因的RBS 進(jìn)行隨機(jī)突變和篩選，獲得了最優(yōu)表達(dá)元件，進(jìn)一步按照“高-中-低”的方式對(duì)不同基因的RBS元件進(jìn)行隨機(jī)組合，獲得了最適于5-ALA 合成的組合。Chen 等［55］利用不同強(qiáng)度的 RBS 元件對(duì)ALAS 和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表達(dá)進(jìn)行了精細(xì)調(diào)控，獲得了產(chǎn)物合成與中心代謝最優(yōu)平衡菌株。

調(diào)控工具方面， 基于 CRISPRi 和 sRNA（small RNA）的基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)的開發(fā)為基因表達(dá)調(diào)控提供了一種快速高效的操作工具，尤其是對(duì)生長必需基因的表達(dá)調(diào)控［84-85］。在5-ALA 的生物合成中，Su 等［86］首先利用CRISPRi 技術(shù)，通過靶基因內(nèi)部及調(diào)控區(qū)不同結(jié)合位點(diǎn)的gRNA的設(shè)計(jì)，梯度弱化了大腸桿菌hemB基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)為對(duì)照菌株的27%～82%，5-ALA 產(chǎn)量最高提高了5倍；該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步將血紅素響應(yīng)和調(diào)控元件與CRISPRi 工具組合，通過ALAD 表達(dá)的動(dòng)態(tài)調(diào)控平衡了 5-ALA 合成和菌體生長［87］。Miscevic 等［51］利用四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制的CRISPRi 系統(tǒng)，采用上述類似的策略，通過不同gRNA 設(shè)計(jì)調(diào)控了hemB的弱化程度，發(fā)現(xiàn)40%～67%的轉(zhuǎn)錄水平最利于5-ALA 合成，產(chǎn)量比對(duì)照菌株提高了4～5 倍?；谡{(diào)控工具的基因表達(dá)調(diào)控不涉及基因組操作，可以更便捷地進(jìn)行多水平的調(diào)控，并且更容易與其他調(diào)控元件組合，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因更精細(xì)的表達(dá)調(diào)控。未來基于CRISPR-dCpf1 的多基因表達(dá)調(diào)控工具［88］也可以更方便地對(duì)多個(gè)基因靶點(diǎn)同時(shí)調(diào)控，以快速優(yōu)化胞內(nèi)復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)。

4.3 動(dòng)態(tài)調(diào)控技術(shù)在5-ALA生物合成中的應(yīng)用

動(dòng)態(tài)調(diào)控可以根據(jù)菌體生長及代謝的需求對(duì)胞內(nèi)代謝流量進(jìn)行精確的重新分配［89］。基于代謝物響應(yīng)、群體感應(yīng)、環(huán)境因素響應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略已經(jīng)日趨成熟，并用于平衡菌體生長和5-ALA的合成（圖2）。

代謝物響應(yīng)元件通常包括響應(yīng)特定代謝物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子-啟動(dòng)子和核糖開關(guān)。目前，上述兩種元件在ALA 生物合成中均已經(jīng)被開發(fā)和使用。Zhou 等［49］在巴氏梭菌（Clostridium pasteurianum）中鑒定了一種甘氨酸激活型核糖開關(guān)，并通過配體結(jié)合區(qū)功能分析和改造篩選，將其改造成為一種高效的甘氨酸抑制型核糖開關(guān)；利用上述元件在整合異源甘氨酸和C4途徑的大腸桿菌中調(diào)控ALAD的表達(dá)，構(gòu)建了響應(yīng)前體甘氨酸的動(dòng)態(tài)調(diào)控回路，實(shí)現(xiàn)了5-ALA 產(chǎn)量11% 的提升。Zhang等［87］基于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）來源的血紅素響應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HrtR 及其操縱區(qū)序列hrtO，開發(fā)了特異性響應(yīng)胞內(nèi)血紅素的生物傳感器；通過HrtR 與血紅素親和力的半理性設(shè)計(jì)和改造，獲得了不同響應(yīng)范圍和靈敏度的元件；利用上述元件在C5途徑強(qiáng)化的大腸桿菌中通過CRISPRi 工具調(diào)控了ALAD 的表達(dá)（圖2），實(shí)現(xiàn)了胞內(nèi)血紅素的穩(wěn)態(tài)控制，5-ALA 產(chǎn)量最高達(dá)到了5.35 g/L，是組成型調(diào)控策略的2.2倍。

群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing，QS）主要通過感應(yīng)細(xì)胞密度變化來調(diào)控基因的表達(dá)。近年來，基于QS 系統(tǒng)的合成生物學(xué)基因調(diào)控回路的構(gòu)建和應(yīng)用研究已經(jīng)成為動(dòng)態(tài)調(diào)控領(lǐng)域的新熱點(diǎn)［90］。在5-ALA的生物合成方面，Gu等［50］利用同時(shí)具有激活和抑制雙重調(diào)控功能的Eas-QS 系統(tǒng)，通過控制小分子感應(yīng)物的合成速度并組合不同誘導(dǎo)啟動(dòng)子，構(gòu)建了一系列在不同生長時(shí)期啟動(dòng)的雙功能動(dòng)態(tài)調(diào)控開關(guān)，可以在不同時(shí)間和間隔同步調(diào)控不同基因的上調(diào)和下調(diào)；研究人員將上述調(diào)控開關(guān)用于ALAS 和ALAD 的動(dòng)態(tài)表達(dá)調(diào)控（圖2），確定了最優(yōu)元件組合，實(shí)現(xiàn)了前期菌體快速生長（上調(diào)ALAD，下調(diào)ALAS），而后期快速積累產(chǎn)物（上調(diào)ALAS，下調(diào)ALAD），ALA 產(chǎn)量比靜態(tài)調(diào)控的組合提高了12倍。

此外，生長時(shí)期調(diào)控型啟動(dòng)子作為一種動(dòng)態(tài)調(diào)控元件也已經(jīng)用于5-ALA 合成途徑的優(yōu)化。江南大學(xué)康振團(tuán)隊(duì)［64］在大腸桿菌中利用一種穩(wěn)定期下調(diào)的自誘導(dǎo)啟動(dòng)子PfliC，替換了hemB基因的原始啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)了ALAD 在菌體生長階段的高表達(dá)以及進(jìn)入穩(wěn)定期后的快速下調(diào)（圖2），降低了發(fā)酵中后期5-ALA 下游途徑的代謝通量，促進(jìn)了5-ALA 在發(fā)酵中后期的快速積累。Zhang 等［68］分別利用溫度敏感質(zhì)粒和生長時(shí)期調(diào)控型啟動(dòng)子PCP_2836調(diào)控了α-酮戊二酸脫氫酶的表達(dá)，通過溫度的變化或生長時(shí)期的自誘導(dǎo)作用，動(dòng)態(tài)調(diào)控了TCA 循環(huán)進(jìn)入谷氨酸合成的通量；同時(shí)借助谷氨酸棒桿菌內(nèi)源血紅素響應(yīng)和調(diào)控系統(tǒng)HrrSA，在高血紅素濃度條件下自動(dòng)上調(diào)RhtA 的表達(dá)（圖2），實(shí)現(xiàn)了5-ALA 外排速度的動(dòng)態(tài)調(diào)控，獲得了目前最優(yōu)的基于C5途徑的谷氨酸棒桿菌5-ALA 高產(chǎn)菌株。

動(dòng)態(tài)調(diào)控作為合成生物學(xué)的一項(xiàng)重要使能技術(shù)，比靜態(tài)調(diào)控和基于外源誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)型元件具有顯著的技術(shù)優(yōu)勢和細(xì)胞經(jīng)濟(jì)性。5-ALA 及其前體均處于菌體生長代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，因此高產(chǎn)菌株需要嚴(yán)格平衡菌體的生長和產(chǎn)物合成，未來動(dòng)態(tài)調(diào)控在多靶點(diǎn)多水平的綜合應(yīng)用將為5-ALA生物合成技術(shù)的發(fā)展提供強(qiáng)大的技術(shù)支持。

4.4 抗逆元件挖掘和應(yīng)用

穩(wěn)定高效的生物合成體系除了需要平衡高產(chǎn)菌株胞內(nèi)代謝以外，還需要關(guān)注發(fā)酵過程中產(chǎn)物或有毒中間代謝物積累對(duì)菌體生理活性的影響。5-ALA 化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，中性或堿性pH 條件下容易兩分子縮合，產(chǎn)生環(huán)狀化學(xué)物和活性氧分子［91-93］。同時(shí)，發(fā)酵過程中5-ALA 下游代謝產(chǎn)生的卟啉類物質(zhì)具有較強(qiáng)的光敏活性，過量積累也可能會(huì)對(duì)菌體造成嚴(yán)重的氧化損傷。作者團(tuán)隊(duì)［36］通過大腸桿菌對(duì)高濃度5-ALA 耐受的機(jī)制研究，明確了活性氧是高濃度5-ALA 細(xì)胞毒性的主要物質(zhì)；研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)在高濃度5-ALA 脅迫條件下明顯上調(diào)，是菌體耐受高濃度5-ALA 的主要防御系統(tǒng)；通過功能基因元件篩選和驗(yàn)證，確定了強(qiáng)化菌株的抗氧化系統(tǒng)可以有效提高工程菌5-ALA 的產(chǎn)量，其中組合表達(dá)過氧化氫酶KatE和超氧化物歧化酶SodB 的菌株5-ALA 產(chǎn)量提高了117%，為5-ALA 高效生物技術(shù)的開發(fā)提供了新策略和新元件。

4.5 非理性進(jìn)化和快速檢測技術(shù)的開發(fā)

基于合成生物學(xué)元件的非理性進(jìn)化和篩選技術(shù)可以在機(jī)制尚不清晰的情況下，快速提高產(chǎn)物產(chǎn)量，對(duì)新菌株的解析也有助于發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)新機(jī)制。目前非理性策略在5-ALA 生物合成中的研究和應(yīng)用還相對(duì)較少。

Cui 等［62］利用化學(xué)誘導(dǎo)的染色體進(jìn)化技術(shù)（chemically induced chromosomal evolution，CIChE），將GluTR 和GSAM 編碼基因在大腸桿菌基因組上隨機(jī)多拷貝整合，獲得了不依賴于質(zhì)粒的目標(biāo)基因多拷貝表達(dá)菌株，結(jié)合recA敲除和菌株適應(yīng)性進(jìn)化，獲得的菌株ALA 產(chǎn)量達(dá)到了4.55 g/L。Tan等［94］利用CRISPRi 技術(shù)弱化大腸桿菌碳酸酐酶編碼基因can，構(gòu)建了一種響應(yīng)1%～5%濃度CO2的生物傳感器，并以此為基礎(chǔ)開發(fā)了一種針對(duì)CO2代謝相關(guān)酶的進(jìn)化和檢測系統(tǒng)（direct enzymatic performance evaluation & determination system，DEPEND），利用上述系統(tǒng)可以快速識(shí)別具有更高ALAS 活性的菌株，為ALAS 的非理性進(jìn)化篩選提供了重要的檢測技術(shù)。此外，該研究團(tuán)隊(duì)還嘗試開發(fā)基于熒光蛋白的發(fā)酵過程5-ALA 快速定量檢測技術(shù)，研究人員利用相同啟動(dòng)子在兩個(gè)質(zhì)粒上分別表達(dá)ALAS 與綠色熒光蛋白GFP，通過檢測GFP 的熒光值確定體系中 5-ALA 的產(chǎn)量水平［95］。這也是首次利用活細(xì)胞生物傳感器原位在線檢測5-ALA 生物合成的嘗試，盡管該工具在使用過程中還受到pH 等因素的干擾，檢測時(shí)限也相對(duì)較短，但該研究為未來相關(guān)工具的開發(fā)和非理性進(jìn)化篩選策略的實(shí)施提供了重要的參考。

近年來，合成生物技術(shù)的快速發(fā)展為5-ALA生物合成技術(shù)的開發(fā)提供了大量的新策略和新工具，盡管目前多數(shù)技術(shù)尚處于概念驗(yàn)證及測試階段，但合成生物技術(shù)以其強(qiáng)大的顛覆性和創(chuàng)新性，未來必將有力地推動(dòng)5-ALA 生物合成水平的快速提升。

5 總結(jié)與展望

5-ALA 是一種極具開發(fā)價(jià)值的生物基化學(xué)品，在動(dòng)植物營養(yǎng)與健康等多方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，未來市場潛力巨大，產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景廣闊。然而，由于目前5-ALA 的工業(yè)化生產(chǎn)主要依賴于化學(xué)合成技術(shù)，成本高污染重，導(dǎo)致現(xiàn)有生產(chǎn)規(guī)模有限，產(chǎn)品價(jià)格昂貴，嚴(yán)重限制了其在各領(lǐng)域中的推廣應(yīng)用。經(jīng)過近50 年的發(fā)展，5-ALA 生物合成技術(shù)從最初利用自然篩選獲得的天然菌株，逐步過渡到了集成多種改造策略和合成生物學(xué)元件的高效人工細(xì)胞工廠，產(chǎn)量水平也從不足1 g/L 提高到了近20 g/L。部分高效菌種和成熟工藝已經(jīng)或即將進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)，國內(nèi)百公斤級(jí)規(guī)模的生產(chǎn)線也已經(jīng)初步建立，大大降低了產(chǎn)品的生產(chǎn)成本和工藝的復(fù)雜性，為其在農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用推廣奠定了重要基礎(chǔ)。然而，目前5-ALA 生物合成技術(shù)的產(chǎn)量水平與谷氨酸、琥珀酸等相關(guān)代謝物的生產(chǎn)水平相比還有較大的差距，未來5-ALA生物合成技術(shù)的發(fā)展仍將面臨較大的挑戰(zhàn)。

首先，5-ALA 合成水平的提升仍然需要持續(xù)解析諸多限制因素和復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，其中特別需要關(guān)注的是生物體內(nèi)血紅素的穩(wěn)態(tài)平衡和嚴(yán)緊調(diào)控，涉及關(guān)鍵酶的反饋調(diào)控、細(xì)胞基礎(chǔ)代謝的平衡以及底盤菌株的應(yīng)激響應(yīng)等多個(gè)方面，這也是限制5-ALA 合成的核心要素。未來綜合運(yùn)用多種代謝工程策略、系統(tǒng)生物學(xué)分析手段和合成生物學(xué)工具，從理性設(shè)計(jì)和非理性進(jìn)化篩選等不同維度突破5-ALA 合成和代謝的限制，才有可能實(shí)現(xiàn)5-ALA生產(chǎn)水平的跨越式提升。

其次，目前高水平的菌種和工藝都是基于C4途徑開發(fā)，且都依賴于甘氨酸的胞外添加，限制了產(chǎn)品成本的下降空間，甘氨酸高效胞內(nèi)供給途徑的設(shè)計(jì)和創(chuàng)建是C4途徑未來研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)；同時(shí)，盡管目前基于C5途徑技術(shù)水平仍然較低，但與C4途徑相比，C5途徑具有明顯的底物供給優(yōu)勢，如何突破谷氨酸到5-ALA 的催化限制是C5途徑后續(xù)關(guān)注的重點(diǎn)。

此外，近年來CRISPR 等基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展為基因組規(guī)模靶點(diǎn)的快速篩選和細(xì)胞工廠的快速構(gòu)建提供了新型高效的技術(shù)手段，利用上述技術(shù)構(gòu)建基因組規(guī)模菌株庫，結(jié)合菌株表型篩選技術(shù)的開發(fā)，也可以快速突破現(xiàn)有知識(shí)的認(rèn)知［96-98］，發(fā)現(xiàn)新的有利于5-ALA 生物合成的潛在靶點(diǎn)，助力菌種水平的進(jìn)一步提升。

最后，盡管目前大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌是用于5-ALA 合成的主流底盤菌株，具有不同生理特性的其他模式微生物或極端微生物，如釀酒酵母、鹽單胞菌（Halomonasspp.）等也已經(jīng)陸續(xù)用于 5-ALA 生物合成的研究［45，99-101］。同時(shí)，隨著體外合成生物技術(shù)的快速發(fā)展［102］，利用不依賴于細(xì)胞的體外多酶復(fù)合體系催化合成5-ALA 的研究也逐步開展［103-104］。

隨著系統(tǒng)生物學(xué)分析技術(shù)以及合成生物學(xué)使能技術(shù)的不斷發(fā)展，相信未來會(huì)有更多的新策略用于5-ALA 高產(chǎn)菌株的開發(fā)創(chuàng)建，低成本的綠色生物制造路線最終將助推5-ALA 在不同領(lǐng)域的大范圍推廣應(yīng)用。