高虎濤，王佳，孫新曉，申曉林，袁其朋

（北京化工大學(xué)，化工資源有效利用國家重點實驗室，北京 100029）

3-苯丙醇又名氫化肉桂醇、利膽醇，天然存在于草莓、茶葉等植物中，它是一種無色、略帶油性的液體，具有溫和、芳香的花香氣味和中等強度的甜味［1］。由于消費者對天然食品添加劑的偏好，因此市場對天然芳香化合物的需求不斷增加。長期以來，高等植物的精油是天然香料的唯一來源［2］。3-苯丙醇作為精細(xì)化的芳香氨基酸衍生物廣泛應(yīng)用于化妝品、食品等領(lǐng)域。此外3-苯丙醇是一種高效促膽汁分泌劑和溫和的解痙劑。臨床上用于治療膽囊炎、膽石癥、膽道術(shù)后綜合征等，且對肝細(xì)胞的保護具有重要作用。膽石癥是指膽道系統(tǒng)發(fā)生結(jié)石的疾病，在急腹癥中發(fā)病率高居第二，僅次于急性闌尾炎。Lü等［3］在2017年的一份報告指出，中國膽囊結(jié)石的發(fā)病率在5.7%，其中女性患者幾乎是男性患者的兩倍，因此利膽類藥物市場需求量巨大。

目前苯丙醇的生產(chǎn)主要由肉桂酸乙酯催化加氫制得［4］，貴金屬催化劑本身性質(zhì)的不同常導(dǎo)致副產(chǎn)物的產(chǎn)生［5］，反應(yīng)一般在高溫高壓及重金屬催化劑的條件下進(jìn)行。隨著國家碳達(dá)峰目標(biāo)的深入貫徹執(zhí)行，較低的生產(chǎn)效率、高污染的化工生產(chǎn)方式將會逐步被取代［6-7］，微生物生產(chǎn)因其溫和的生產(chǎn)條件、綠色清潔的生產(chǎn)周期在未來的可持續(xù)發(fā)展中極具競爭力［8］。在過去的幾十年中，利用微生物作為平臺菌生產(chǎn)高附加值化合物的綠色生產(chǎn)方式已逐漸替代利用石油基合成化合物的高風(fēng)險、高污染的方式。隨著科學(xué)工作者對各種微生物系統(tǒng)、深入且明晰的研究以及基因編輯方法［9-11］、高通量篩選方法的不斷成熟［12-13］，改造微生物使其利用廉價碳原料合成高附加值化學(xué)品的合成生物學(xué)已經(jīng)廣泛用于醫(yī)療［14-15］、食品［16］、化妝品［17-18］、化學(xué)品［19-20］、環(huán)境保護［21］等重要領(lǐng)域，中國“十三五”規(guī)劃中明確把合成生物學(xué)作為重點創(chuàng)新發(fā)展領(lǐng)域。到2030 年，將基本形成比較完整的合成生物技術(shù)創(chuàng)新體系，合成生物產(chǎn)業(yè)初具規(guī)模，國際競爭力大幅提升。本課題以合成生物學(xué)和代謝工程學(xué)的理論為基礎(chǔ)設(shè)計了兩種3-苯丙醇的合成方式，這兩種合成方式共享同樣的上游代謝途徑，即以甘油為基本碳源，經(jīng)糖異生途徑和磷酸戊糖途徑分別生成重要前體磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和D-赤蘚糖-4-磷酸（E4P），經(jīng)DAHP 合酶催化合成莽草酸途徑的第一個化合物3-脫氧-D-阿拉伯糖庚酸七磷酸酯。通過調(diào)控基因表達(dá)、削弱競爭途徑、調(diào)節(jié)碳流量分配等方式，不斷改善菌株的生產(chǎn)性能，最終實現(xiàn)3-苯丙醇的高產(chǎn)。

1 材料和方法

1.1 實驗原料和儀器

甘油、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），F(xiàn)isher Scientific；CaCl2、MgSO4，J.T.Baker；瓊脂糖，Omnipur Calbiochem；溴化乙錠、氨芐青霉素、卡那霉素，F(xiàn)isher BioReagents；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、基因組提取試劑盒，Zymo research；核酸連接酶、核酸內(nèi)切酶，New England Biolabs。

高速離心機，Eppendorf centrifuge 5424；冷凍離心機，Eppendorf centrifuge 5430R；凝膠成像儀，UVP Digidoc-It Darkroom；CTO-10AS高效液相色譜，島津；紫外可見分光光度計，Beckman DU650；電轉(zhuǎn)儀，Eppendorf Electroporator 2510。

1.2 基因及質(zhì)粒構(gòu)建

提取大腸桿菌（Escherichia coli）基因組，設(shè)計引物PCR 得到上游代謝途徑中的4 個基因：aroL，ppsA，tktA，aroGfbr；實驗室保存有來源于黏膠紅桿菌（Rhodobacter glutinis）的苯丙氨酸氨裂解酶基因tal、來源于擬南芥（Arabidopsis thaliana）的香豆酸輔酶A 連接酶基因4CL1、來源于銀合歡（Leucaena leucocephala）的肉桂酰輔酶A還原酶基因CCR；另外，通過NCBI查找得到的來源于丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）的烯酸還原酶基因er在生工生物工程（上海）股份有限公司合成；文獻(xiàn)中已報道催化效果較好的來源于海洋分枝桿菌（Mycobacterium marinum）的羧酸還原酶car編碼基因在華大基因公司合成；提取枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）基因組，設(shè)計引物PCR得到編碼4'-磷苯丙胺轉(zhuǎn)移酶基因sfp。

通過多克隆位點KpnI、BamHI 分別將aroL、ppsA、tktA、aroGfbr構(gòu)建到中拷貝質(zhì)粒載體pCS27上；通過多克隆位點KpnI、BamHI、XbaI 分別將4CL1和CCR、tal和er、car和sfp構(gòu)建到高拷貝質(zhì)粒載體 pZE12-luc 上；通過 KpnI、XbaI 分別將tal、er、car-sfp構(gòu)建到高拷貝質(zhì)粒載體pZE12-luc 上；通過 SacI、BcuI 將car-sfp構(gòu)建到 pZE-TAL-ER 的第2個閱讀框中。

1.3 搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵

挑取抗生素篩選培養(yǎng)皿上的單菌落到裝有4 mL LB 培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃，220 r/min 培養(yǎng)過夜，取1 mL 大腸桿菌懸液接種于盛有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，待菌體密度在600 nm 處的光密度（OD600）為0.6時加入終濃度為0.5 mmol/L 的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)，于37 ℃，220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每隔12 h取樣用于高效液相色譜分析。

LB培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨、10 g/L氯化鈉、5 g/L酵母粉，溶于去離子水，于115°C 下滅菌30 min，制備固體培養(yǎng)基時加入2%的瓊脂粉。

M9培養(yǎng)基：20 g/L 甘油，7 g/L 酵母粉，2 g/L MOPS，6 g/L Na2HPO4，0.5 g/L NaCl，3 g/L KH2PO4，2 g/L NH4Cl，1 g/L（NH4）2SO4，溶于去離子水，于115°C下滅菌30 min。

所有培養(yǎng)基在使用時加入所需的抗性，卡那霉素、氯霉素、氨芐青霉素終濃度均為0.5 mmol/L。M9 培養(yǎng)基在接種菌液時需額外添加終濃度為0.5 mmol/L的MgSO4和0.05 mmol/L的CaCl2。

1.4 HPLC檢測

將購買的苯丙氨酸、肉桂酸、肉桂醇、苯丙酸、3-苯丙醇標(biāo)準(zhǔn)品配制成呈梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品。標(biāo)準(zhǔn)樣品和發(fā)酵液樣品經(jīng)HPLC 檢測并定量。使用DIKMA C18反相柱以及自動進(jìn)樣島津高效液相色譜儀，色譜柱的規(guī)格為250 mm×4.6 mm，ID 5 μm，流動相為混合物甲醇∶乙腈∶水∶乙酸=30∶16∶54∶0.1。柱溫為40 ℃，總流速為0.8 mL/min，檢測時間為25 min，檢測波長為205 nm、254 nm。

1.5 實驗菌種和質(zhì)粒

本實驗用到的菌株、質(zhì)粒、引物等情況見表1～表3。

表1 本實驗所用到的菌株Tab.1 Strains used in this study

表2 本實驗所用到的基礎(chǔ)質(zhì)粒Tab.2 Plasmids used in this study

表3 本實驗所用到的引物Tab.3 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)化肉桂酸生產(chǎn)3-苯丙醇途徑的設(shè)計

通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，Chen 等［22］利用香豆酸輔酶A 連接酶（4CL1）和肉桂酰輔酶A 還原酶（CCR）催化底物4-香豆酸得到了501.8 mg/L 的4-香豆醇，肉桂酸與4-香豆酸的分子結(jié)構(gòu)相似（苯環(huán)對位少一個羥基）；我們推測4CL1和CCR也能夠催化肉桂酸生成肉桂醇。另外，Sun等［23］利用烯酸還原酶（ER）催化底物肉桂酸得到了366.77 mg/L的苯丙酸，而肉桂醇和肉桂酸結(jié)構(gòu)類似（側(cè)鏈2、3 位碳之間存在一個雙鍵）；我們推測ER 也能夠催化肉桂醇得到3-苯丙醇?；谶@些推測，設(shè)計了一條依賴于輔酶A還原酶的催化肉桂酸生產(chǎn)3-苯丙醇的生物途徑1。該途徑上，肉桂酸經(jīng)4CL1 和CCR 將羧基還原為肉桂醇，接著在ER 的催化下將雙鍵還原生成目標(biāo)產(chǎn)物3-苯丙醇。

另外，根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)報道，發(fā)現(xiàn)來源于M.marinum的羧酸還原酶Car能夠?qū)⒍替溁蚍枷阕弭人徇€原為對應(yīng)的醛類化合物［24-25］，而大腸桿菌天然存在的醇脫氫酶可以將醛類化合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇類化合物，鑒于Car的底物譜比較廣泛，推測它能夠?qū)⒈奖徂D(zhuǎn)化為苯丙醛；Sfp 是來源于枯草芽孢桿菌的磷酸泛肽基轉(zhuǎn)移酶，相關(guān)文獻(xiàn)報道其與Car共同表達(dá)時明顯增強后者活性［26］。由此，設(shè)計了另一條依賴于羧酸還原酶Car的生產(chǎn)3-苯丙醇的生物途徑2。該途徑上，肉桂酸經(jīng)ER 催化將雙鍵還原生成苯丙酸，接著在Carsfp的催化下將羧基還原為醇。我們通過分步添加實驗驗證這兩條途徑（圖1）是否能順利生成目標(biāo)產(chǎn)物。

圖1 3-苯丙醇合成途徑的設(shè)計RgTALFig.1 Design of synthetic routes of 3-phenylpropanol

2.2 篩選轉(zhuǎn)化肉桂酸生產(chǎn)3-苯丙醇的最佳途徑

2.2.1 輔酶A依賴的還原途徑1

為驗證途徑1是否可行，首先通過添加實驗來分別測試4CL1 和CCR 對肉桂酸的催化活性以及ER對肉桂醇的催化活性。由于4CL1催化肉桂酸所得到的中間產(chǎn)物肉桂酰輔酶A 標(biāo)準(zhǔn)品難以純化得到且價格昂貴，所以本實驗將4CL1和CCR聯(lián)用催化肉桂酸，得到產(chǎn)物肉桂醇，肉桂醇標(biāo)品易得到，也便于液相檢測。

將攜帶有pZE-CCR-4CL1的BW25113（F′）菌株G01 進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，為減弱較高濃度肉桂酸對工程菌的生長抑制（下述苯丙酸、肉桂醇同理），分3 次（分別為添加誘導(dǎo)劑時、添加誘導(dǎo)劑后3 h、添加誘導(dǎo)劑后6 h）添加終濃度為1.5 g/L 的肉桂酸，24 h 后得到 91 mg/L 的肉桂醇［圖 2（a）］，這表明4CL1 和CCR 能夠接受肉桂酸為催化底物，但催化活性較低。分析原因可能是肉桂酸與4-香豆酸相比4 位上少了羥基，活性基團缺失導(dǎo)致酶的催化活性大幅減弱；同樣，為驗證烯酸還原酶ER 對底物肉桂醇的催化活性，向攜帶有pCS-ER的G02 菌株的發(fā)酵搖瓶里分3 次添加終濃度為1.5 g/L 的肉桂醇，24 h 后得到 129 mg/L 的 3-苯丙醇［圖2（b）］，這表明ER 能夠接受肉桂醇為底物，同樣的對肉桂醇的催化活性也較低。有文獻(xiàn)報道，當(dāng)與雙鍵相連的碳原子上有羰基或者硝基等活性基團存在時，ER 的催化活性會更高［27］，我們推測烯酸還原酶ER 對苯丙酸的催化活性相對會更高。從上述這兩個添加實驗來看設(shè)計的途徑1 可行，但是由于酶對底物的催化活性較低所以產(chǎn)量不高。整體的轉(zhuǎn)化效率還待進(jìn)一步添加實驗驗證。

通過雙轉(zhuǎn)化得到同時攜帶pZE-CCR-4CL1 和pCS-ER 的G03 菌株進(jìn)行添加實驗，同樣分3 次添加終濃度為1.5 g/L 的肉桂酸，48 h 后檢測到16.6 mg/L 肉桂醇以及287.5 mg/L 苯丙酸，但沒有檢測到最終產(chǎn)物3-苯丙醇［圖2（c）］。分析造成這種情況的原因是ER 對肉桂酸的催化活性相對于肉桂醇較高，當(dāng)體系中同時存在肉桂酸和肉桂醇時，ER 會優(yōu)先將肉桂酸還原為苯丙酸，而實驗結(jié)果表明4CL1 和CCR 不能將苯丙酸轉(zhuǎn)化生成3-苯丙醇，導(dǎo)致產(chǎn)物主要積累在了苯丙酸。

為探究烯酸還原酶ER 對肉桂酸、肉桂醇轉(zhuǎn)化效率的差別，向攜帶有pCS-ER 的G02 菌株的發(fā)酵搖瓶里分3 次添加終濃度為1.5 g/L 的肉桂酸，24 h后得到578 mg/L 的苯丙酸［圖2（d）］，這表明ER對肉桂酸的催化活性更高，羰基等活性基團的存在確實提高了ER對底物的催化活性。

圖2 驗證輔酶A依賴的還原途徑1Fig.2 Validation of coenzyme A-dependent reduction pathway 1

2.2.2 羧酸還原酶途徑2

接著驗證途徑2 的可行性。由上述實驗可知，相對于催化肉桂醇生成3-苯丙醇，ER 催化肉桂酸生成苯丙酸的效率更高。途徑2中由肉桂酸生成苯丙酸的通路打通后，接著要通過添加實驗來測試Carsfp 對苯丙酸的催化活性。將攜帶有pCS-Carsfp的G05 菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，分3 次添加終濃度為1.5 g/L 的苯丙酸，24 h 后得到 1.51 g/L 的 3-苯丙醇［圖3（a）］，實驗結(jié)果表明羧酸還原酶Carsfp 實現(xiàn)了對苯丙酸的完全轉(zhuǎn)化。為了驗證當(dāng)ER 和Carsfp聯(lián)用時肉桂酸能否順利轉(zhuǎn)化為3-苯丙醇，將ER 構(gòu)建到了高拷貝質(zhì)粒上并進(jìn)行添加實驗，攜帶有pZE-ER 的 G04 菌株在 24 h 內(nèi)將 1.5 g/L 的肉桂酸轉(zhuǎn)化得到1.26 g/L 的苯丙酸［圖3（b）］，轉(zhuǎn)化率相比其在中拷貝質(zhì)粒上時提高了123%。接著，通過雙轉(zhuǎn)化得到同時攜帶有pZE-ER 和pCS-Carsfp 的G06菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，分3次添加終濃度為1.5 g/L的肉桂酸，在48 h 內(nèi)合成了429 mg/L 的3-苯丙醇，這表明依賴羧酸還原酶Carsfp 的途徑2 可行。同時也檢測到副產(chǎn)物肉桂醇和苯丙酸分別積累了319 mg/L和113 mg/L［圖3（c）］。

分析造成副產(chǎn)物肉桂醇積累的原因是羧酸還原酶Car 的雜泛性，導(dǎo)致Car 催化肉桂酸生成了大量肉桂醇。為驗證猜想，將攜帶有pCS-Carsfp 的G05菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，24 h后將1.5 g/L的肉桂酸轉(zhuǎn)化得到375 mg/L 的肉桂醇［圖3（d）］。這表明Car 能夠接受肉桂酸為底物，但相較于催化苯丙酸而言，催化肉桂酸的活性較低。上述實驗結(jié)果表明依賴羧酸還原酶Car的還原途徑能夠?qū)⑷夤鹚徂D(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物3-苯丙醇，為了達(dá)到利用廉價碳源生產(chǎn)高附加值化合物的目標(biāo)，將使用基本培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主菌實現(xiàn)對3-苯丙醇的從頭合成。

圖3 驗證羧酸還原酶依賴的途徑2Fig.3 Validation of carboxylic acid reductase-dependent pathway 2

2.3 從頭合成3-苯丙醇

大腸桿菌自身代謝通過莽草酸途徑能夠產(chǎn)生L-苯丙氨酸，而來源于Rhodobacter glutinis的苯丙氨酸氨裂解酶基因tal能夠催化L-苯丙氨酸脫氨基生成肉桂酸。根據(jù)現(xiàn)有的報道可以發(fā)現(xiàn)該酶的應(yīng)用已經(jīng)非常成熟，如Wang 等［28］利用來自紅車軸草（Trifolium pretense）的tal基因，在飼喂3 mmol/L苯丙氨酸的條件下，得到241.3 mg/L 的肉桂酸。將tal和烯酸還原酶基因er構(gòu)建到pZE12-luc 載體上得到pZE-RgTAL-ER，與pCS-carsfp 一起雙轉(zhuǎn)入大腸桿菌BW25113（F′）中得到生產(chǎn)菌株G07，以甘油為基本碳源從頭合成3-苯丙醇（圖4）。

圖4 在菌株G07和菌株G08中從頭合成3-苯丙醇Fig.4 De novo production of 3-phenylpropanol in strains G07 and G08

實驗結(jié)果表明，當(dāng)將3-苯丙醇的外源合成途徑轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，搖瓶培養(yǎng)48 h 從頭合成了91 mg/L 的3-苯丙醇，表明設(shè)計的3-苯丙醇的微生物合成途徑可行。然而該產(chǎn)量遠(yuǎn)低于向培養(yǎng)基中直接添加肉桂酸時得到的產(chǎn)量，這表明整個途徑中肉桂酸的供應(yīng)不足。為了實現(xiàn)3-苯丙醇的高產(chǎn)，需要通過基因調(diào)控使更多碳流量流向肉桂酸。為了方便接下來對上游基因的修飾，通過模塊優(yōu)化等行距將下游途徑中3個關(guān)鍵基因均整合到同一個高拷貝質(zhì)粒上，具體而言，即將羧酸還原酶Carsfp整合到pZE-RgTAL-ER 的第2 個閱讀框上；同時為了強化苯丙氨酸氨裂合酶TAL 及烯酸還原酶ER 的表達(dá)，將上述這兩個基因置于更強的tac 啟動子控制下，得到pZE-tac-RgTAL-ER-Carsfp。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到野生型大腸桿菌BW25113（F′）中得到菌株G08并進(jìn)行從頭合成實驗，發(fā)現(xiàn)48 h得到189 mg/L 3-苯丙醇的最高產(chǎn)量，相比基因整合前提高了1倍，但這一產(chǎn)量仍遠(yuǎn)低于向培養(yǎng)基中直接添加肉桂酸時得到的產(chǎn)量，進(jìn)一步說明充分?jǐn)U大上游代謝通路碳通量對提高3-苯丙醇的產(chǎn)量至關(guān)重要。

2.4 敲除競爭途徑對3-苯丙醇產(chǎn)量的影響

據(jù)報道，多種植物、藻類、真菌和細(xì)菌皆可以通過莽草酸途徑產(chǎn)生芳香化合物［29-30］。莽草酸酯途徑由來源于糖酵解途徑（EMP）中的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和來源于磷酸戊糖途徑（PPP）中的D-赤蘚糖-4-磷酸（E4P）縮合形成3-脫氧-D-阿拉伯糖庚酸七磷酸酯（DAHP）開始，如何增加這兩種關(guān)鍵前體的供應(yīng)成為亟待解決的問題。大腸桿菌的PTS轉(zhuǎn)運途徑需要消耗大量PEP作為磷?；w參與葡萄糖的跨膜運輸［31］，因此當(dāng)使用葡萄糖為碳源生產(chǎn)芳香化合物時，一般會構(gòu)建PTS缺陷型宿主菌以節(jié)省PEP供莽草酸途徑使用［32-34］，而甘油是葡萄糖的替代底物，更有利于通過莽草酸途徑實現(xiàn)高附加值的芳香化合物的生物合成［35-36］。本課題在從頭合成3-苯丙醇時均采用甘油為單一基本碳源，故不考慮PTS缺陷型的構(gòu)建。重要的是磷酸烯醇式丙酮酸作為莽草酸途徑的關(guān)鍵前體，它還參與由丙酮酸激PykA、PykF催化的反應(yīng)，這些酶催化PEP產(chǎn)生丙酮酸，同時生成ATP為細(xì)胞內(nèi)代謝活動供能。有文獻(xiàn)報道缺失丙酮酸激酶使PEP的可用性提高［37-38］，我們用了同樣的策略在宿主菌BW25113（F′）的基因組上敲除了pykA、pykF，得到了丙酮酸激酶缺失菌株BW25113（F′）ΔpykA ΔpykF 作為新的宿主菌［圖5（a）］。接著，將pZE-tac-RgTAL-ER-Carsfp 轉(zhuǎn) 入 BW25113 （F′） ΔpykA ΔpykF 中得到生產(chǎn)菌株G09，以基本培養(yǎng)基從頭合成3-苯丙醇。

圖5 pykA/F敲除對3-苯丙醇產(chǎn)量的影響Fig.5 Production of 3-phenylpropanol in pykA/F knockout strain

實驗結(jié)果如圖5（b）所示，48 h 內(nèi)產(chǎn)生了439 mg/L 的3-苯丙醇，相比敲除pykA、pykF前提高了130%［圖5（b）］，這充分說明PEP 競爭途徑的敲除顯著提高了PEP 的供應(yīng)。但敲除pykA、pykF大幅阻斷了大腸桿菌的糖酵解途徑，導(dǎo)致宿主菌的生長速度明顯降低，使發(fā)酵周期被延長。有文獻(xiàn)報道了一種既不影響宿主菌正常的糖酵解途徑又能有效增加PEP 供應(yīng)的策略——碳儲存調(diào)節(jié)系統(tǒng)（Csr）的調(diào)節(jié)。具體而言，CsrA 是一種調(diào)節(jié)碳代謝和能量代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)［39］，丙酮酸激酶（PykF）受到CsrA 的正調(diào)控，而由丙酮酸產(chǎn)生PEP 的PpsA 受到CsrA 的負(fù)調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)，CsrA 的缺失可增強糖異生代謝流量，促進(jìn)PEP 的積累。Yakandawala 等［42］敲除了csrA基因，并觀察到 PEP 濃度增加［40-41］，因此csrA的刪除導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)PEP 濃度在整個指數(shù)生長期和穩(wěn)定期升高。另外，csrB（編碼一種來自碳儲存調(diào)節(jié)器的小的未翻譯RNA）的過表達(dá)也能提高大腸桿菌內(nèi)PEP的供應(yīng)［42］。

除了PEP，另一個關(guān)鍵前體E4P 的供應(yīng)也同樣需要提高，否則兩種前體的供應(yīng)不平衡將導(dǎo)致無法充分利用碳源生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物。D-赤蘚糖-4-磷酸（E4P）是磷酸戊糖途徑（PPP）的中間產(chǎn)物，增加E4P 通量的最常見方法是過表達(dá)轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮酶基因，以促進(jìn)景天糖-7-磷酸（S7P）和甘油醛-3-磷酸（G3P）轉(zhuǎn)化為E4P 和果糖-6-磷酸（F6P）［43-44］。

2.5 關(guān)鍵基因的過表達(dá)對3-苯丙醇產(chǎn)量的影響

Knop 等［45］在大腸桿菌中過表達(dá)轉(zhuǎn)酮酶（TktA）后，觀察到莽草酸產(chǎn)量從38 g/L 增加到52 g/L；另外，Lu 和 Liao［46］在已經(jīng)過表達(dá)轉(zhuǎn)酮酶基因的菌株中，繼續(xù)過表達(dá)轉(zhuǎn)醛醇酶基因并沒有顯示芳香化合物產(chǎn)量的進(jìn)一步增加，這一結(jié)果可能與tktA過表達(dá)時E4P供應(yīng)飽和有關(guān)，得出結(jié)論轉(zhuǎn)酮酶比轉(zhuǎn)醛醇酶更有效地將碳通量引導(dǎo)到芳香途徑。因此我們設(shè)計引物擴增得到轉(zhuǎn)酮酶基因tktA。Chandran 等［47］在早前的報道中提到編碼 PEP 合成酶（催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為PEP）的基因ppsA的過表達(dá)提高了胞內(nèi)PEP的供應(yīng)，在阻斷PEP降解途徑的同時，增強它的合成途徑將進(jìn)一步提高PEP 水平。莽草酸途徑是將中心碳代謝與芳香族氨基酸（包括L-Trp、L-Tyr 和L-Phe）的生物合成聯(lián)系起來的代謝中樞。隨著莽草酸途徑中兩個關(guān)鍵前體可用性的提高，莽草酸途徑內(nèi)部的代謝步驟成為新的瓶頸，為使重要中間體芳香氨基酸L-苯丙氨酸大量積累，接下來工作的焦點將轉(zhuǎn)移到增加莽草酸途徑碳通量。莽草酸途徑的第1 步是由DAHP 合成酶催化PEP 和E4P 合成DAHP，而DAHP 合酶活性受莽草酸途徑下游產(chǎn)物芳香族氨基酸濃度的反饋調(diào)節(jié)，這是細(xì)胞為避免積累過量芳香化合物長期自然進(jìn)化形成的反饋調(diào)節(jié)機制。大腸桿菌有3種不同的DAHP 合酶同工酶（分別由aroF、aroG、aroH編碼，其中aroG對DAHP 合酶的活性貢獻(xiàn)達(dá)80%［48］），分別受到產(chǎn)物酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸不同程度的反饋抑制，0.1 mmol/L的L-苯丙氨酸或酪氨酸就可以完全抑制aroG或aroF［49］。為使更多的碳通量被引導(dǎo)至L-苯丙氨酸，編碼AroG 的抗反饋抗性（fbr）酶基因aroGfbr被克隆。另外，aroK編碼的莽草酸激酶Ⅰ的Km值（20 mmol/L）比AroL高 100 倍，AroL 是莽草酸途徑中的限速酶［50］。尤其是當(dāng)工程菌內(nèi)芳香氨基酸濃度較高的情況下AroL 的催化活性很可能受到限制，而其同工酶AroK 功能良好［51］。此外，aroG、aroF、aroH、aroL的轉(zhuǎn)錄被 TyrR 抑制［52-53］。為了增加 L-苯丙氨酸的積累，tyrR通常被滅活。以大腸桿菌基因組為模板克隆得到莽草酸激酶基因aroL，與上述提到的PEP合酶ppsA、轉(zhuǎn)酮酶tktA以及DAHP抗反饋合酶aroGfbr共同構(gòu)建到中拷貝質(zhì)粒pCS27上，得到質(zhì)粒pCS-AroGfbr-PpsA-TktA-AroL［圖 6（a）］，下面簡稱為pCS-APTA；同時，為強化上述關(guān)鍵基因的表達(dá)，將上述4 個基因置于強啟動子tac 控制下得到pCS-tac-APTA。

圖6 增強莽草酸途徑對3-苯丙醇產(chǎn)量的影響Fig.6 Strengthening of shikimate pathway on production of 3-phenylpropanol

為觀察不同強度啟動子控制莽草酸途徑關(guān)鍵基因?qū)Ρ奖籍a(chǎn)量的影響，將pCS-lac-APTA、pZE-tac-RgTAL-ER-Carsfp 及 pCS-tac-APTA、pZE-tac-RgTAL-ER-Carsfp 分別雙轉(zhuǎn)化到 BW25113（F′）菌株中得到G10 和G11 菌株并進(jìn)行從頭合成實驗，48 h后，G11菌株產(chǎn)生了474 mg/L的3-苯丙醇，而G10 菌株的產(chǎn)量僅為247 mg/L［圖6（b）］。結(jié)果表明在強啟動子tac 的控制下過表達(dá)的莽草酸途徑關(guān)鍵基因能夠有效加強莽草酸途徑的碳通量。于是將 pCS-tac-APTA、pZE-tac-RgTAL-ER-Carsfp 的組合轉(zhuǎn)化到雙敲除菌BW25113（F′）ΔpykA ΔpykF中得到G12，以從頭合成3-苯丙醇，48 h 后得到841 mg/L 的產(chǎn)量，與未過表達(dá)莽草酸途徑關(guān)鍵基因時相比產(chǎn)量提高了90%［圖6（c）］。

3 結(jié)果與討論

利用釀酒酵母作為底盤細(xì)胞，用來源于Photorhabdus luminescens的苯丙氨酸氨裂合酶（PAL）、來源于諾卡氏菌Nocardiasp.的芳基羧酸還原酶（Car）和大腸桿菌內(nèi)源的磷酸泛烯基轉(zhuǎn)移酶（PPTase）生產(chǎn)了212.9 mg/L 的3-苯丙醇已見報道［54］，雖然該報道中并沒有探究肉桂醇的雙鍵被何酶催化加成生成還原產(chǎn)物3-苯丙醇，但使得3-苯丙醇的微生物合成得以實現(xiàn)。隨著3-苯丙醇潛在價值的不斷挖掘和應(yīng)用的不斷發(fā)展，工業(yè)化生產(chǎn)成為被關(guān)注的焦點。大腸桿菌因其充分的研究背景和易于基因工程操作、繁殖迅速等優(yōu)勢，成為最常使用的基因工程底盤菌 株。2021 年 6 月 ，天 津 大 學(xué) 的 Liu 等［55］利 用反轉(zhuǎn)錄生物合成的分析策略，通過逆合成的思路搭建出目標(biāo)產(chǎn)物3-苯丙醇可能的代謝途徑，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件最終在工程大腸桿菌里得到847.97 mg/L 的3-苯丙醇。同期我們也致力于將大腸桿菌作為工程菌生產(chǎn)3-苯丙醇，根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)的報道，理性設(shè)計了兩條3-苯丙醇的合成途徑并對其分別進(jìn)行驗證。依賴于輔酶A 的途徑一未能將1.5 g/L 的肉桂酸轉(zhuǎn)化為3-苯丙醇，而依賴于芳基羧酸還原酶的途徑二在添加相同量的肉桂酸后成功檢測到3-苯丙醇，表明了途徑二的可行性。利用途徑二，以甘油為基本碳源從頭合成91 mg/L 的3-苯丙醇，經(jīng)過分析確定出瓶頸所在，通過模塊優(yōu)化整合、對競爭途徑的敲除以及對上游關(guān)鍵基因的過表達(dá)，最終在48 h 的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中得到841 mg/L 的目標(biāo)產(chǎn)物。3-苯丙醇的產(chǎn)量得到了大幅提升，但距離工業(yè)化仍有一定距離。我們嘗試從酶本身的性質(zhì)以及輔因子供給出發(fā)，探索進(jìn)一步提高3-苯丙醇產(chǎn)量的策略。因為肉桂酸經(jīng)過兩步連續(xù)的還原反應(yīng)被代謝生成3-苯丙醇，這需要額外的還原力。理論上為反應(yīng)體系提供更多的還原力對提高反應(yīng)產(chǎn)量有正向作用。據(jù)報道來源于Candida boidinii的甲酸脫氫酶（基因fdh）能夠催化甲酸根陰離子氧化為CO2，同時NAD+還原為NADH［56-57］，因此，將fdh引入質(zhì)粒表達(dá)體系來增加NADH 的供應(yīng)，為烯酸還原酶ER 的催化提供更多輔因子，甲酸根陰離子以甲酸鈉的形式外源添加，然而最終產(chǎn)量僅有引入前的一半，細(xì)胞密度也較引入前低，推測甲酸根陰離子對底盤細(xì)胞的生長呈抑制作用，應(yīng)分批次逐步添加以降低對細(xì)胞的影響。另外，莽草酸通路末端的分支酸除能轉(zhuǎn)化為L-苯丙氨酸外，還將生成L-酪氨酸等芳族化合物，將合成L-酪氨酸的基因tyrA敲除將使碳通量最大化流向L-苯丙氨酸，也就意味著更多目標(biāo)產(chǎn)物的生成。另外，本課題所進(jìn)行的研究均建立在質(zhì)粒載體表達(dá)的基礎(chǔ)上，眾多基因給宿主菌帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，一方面細(xì)菌傳代影響質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳，另一方面也導(dǎo)致菌本身生長活性的降低，隨著CRISPR基因編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展，將異源基因引入到宿主菌基因組上的整合方法變得高效，可以將途徑下游的3 個基因均整合到宿主菌基因組上，并由強啟動子控制，也可以通過增加拷貝數(shù)的方法來增強基因的表達(dá)以實現(xiàn)3-苯丙醇的高產(chǎn)，進(jìn)而實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的目標(biāo)。