基于SSR標(biāo)記的鳶尾雜交和誘變育種材料遺傳多樣性分析

周 琳 蔡友銘 張永春 楊柳燕

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所/上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201403)

鳶尾屬于鳶尾科(Iridaceae)鳶尾屬(IrisL．)多年生草本花卉，因其品種多、花色花型豐富、觀賞價(jià)值高、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)，大量用于地被覆蓋、草坪鑲邊、河道邊坡綠化等[1]。在鳶尾眾多類群中，路易斯安那鳶尾(Louisiana iris)作為一類雜種鳶尾，具有花色鮮艷豐富、適應(yīng)性強(qiáng)、抗寒性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是較好的觀花、觀葉類水體綠化材料，在濕地綠化、河塘湖邊造景、切花市場(chǎng)均具有較大的市場(chǎng)潛力[2-3]。路易斯安那鳶尾原產(chǎn)于美國(guó)，我國(guó)雖已開展了引種栽培、生長(zhǎng)習(xí)性調(diào)查、組培快繁體系構(gòu)建、抗性評(píng)價(jià)、育種等工作，但仍缺乏自主育成的新優(yōu)品系，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上大量使用國(guó)外品種[2]。近年來(lái)，路易斯安那鳶尾育種技術(shù)主要為雜交育種、自交育種和60Co-γ 輻射誘變育種，并開展了雜交和種子萌發(fā)體系的優(yōu)化、種間雜交不親和機(jī)理研究、自交及其后代觀賞性狀分離分析、種子最適60Co-γ 誘變劑量篩選等研究工作[2，4-6]。然而，上述已有的報(bào)道均主要通過(guò)表型鑒定自交、雜交或誘變育種的后代，鮮有利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(simple sequence repeats，SSR)等分子標(biāo)記對(duì)其遺傳多樣性分析的報(bào)道，這在一定程度上制約了路易斯安那鳶尾育種的進(jìn)程。

近年來(lái)，為提高路易斯安那鳶尾繁殖效率，已構(gòu)建出不同外植體的組織培養(yǎng)繁殖體系[3，7-8]，為輻射誘變育種的開展提供了較好的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)利用收集的5個(gè)路易斯安那鳶尾品種進(jìn)行雜交育種，并通過(guò)60Co-γ射線輻射莖尖誘導(dǎo)的組培苗無(wú)性系進(jìn)行誘變育種，最后通過(guò)14 對(duì)SSR 引物對(duì)40 份鳶尾材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期通過(guò)SSR 標(biāo)記加快雜交后代和誘變材料的鑒定，縮短育種周期，使鳶尾新優(yōu)品種能較快地進(jìn)入市場(chǎng)，并成為園林綠化、庭院美化和專類園建設(shè)的重要花卉。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及輻射處理

以上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院2016年引進(jìn)的5 個(gè)路易斯安那鳶尾品種(Colorific、Heather Stream、Her Highness、Pegaletta 和Spicy Cayun)為試驗(yàn)親本材料，種植于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院白鶴基地(31°14′16．56″N，121°05′44．88″E)雙層塑料大棚內(nèi)。參照李丹青等[4]的雜交方法進(jìn)行5 個(gè)路易斯安那鳶尾品種間雜交，雜交后代的種子按照沈云光等[9]的方法處理，獲得雜交后代幼苗，并種植于上述基地。參照祝劍峰等[10]的組培快繁方法，構(gòu)建5 個(gè)路易斯安那鳶尾品種的無(wú)性系，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致、株高為2～3 cm 的組培苗用于輻射誘變處理。利用上海束能輻照技術(shù)有限公司60Co-γ 射線進(jìn)行輻射誘變處理，設(shè)置2．5、5、10、20 和40 Gy 共5 個(gè)劑量，劑量率為1 Gy.min-1。輻射誘變處理后，每30 d 轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件(培養(yǎng)基配方、光照強(qiáng)度和周期、溫濕度)與祝劍峰等[10]的繼代培養(yǎng)條件一致。培養(yǎng)2 個(gè)月后，統(tǒng)計(jì)不同劑量輻射誘變成活率。以引進(jìn)的路易斯安那鳶尾種質(zhì)資源、品種間雜交后代和輻射誘變材料為試驗(yàn)材料(表1)，選取路易斯安那鳶尾種質(zhì)資源和雜交后代幼嫩且無(wú)病害葉片，以及輻射誘變材料繼代培養(yǎng)2 個(gè)月后的健康無(wú)病害葉片，稱重后，凍存于-80℃冰箱用于后續(xù)試驗(yàn)。

表1 供試路易斯安那鳶尾樣本信息Table 1 The sample information of Louisiana iris

1.2 引物序列

從Tang 等[11]基于短莖鳶尾(I.brevicaulis)和暗黃鳶尾(I.fulva)葉片和根系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)所開發(fā)的532對(duì)表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags， EST)-SSR標(biāo)記中選擇14 對(duì)SSR 標(biāo)記，引物名稱、正向和反向引物序列、重復(fù)基序、擴(kuò)增長(zhǎng)度和退火溫度具體信息見表2，引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。

表2 SSR 引物信息Table 2 SSR primer information

1.3 DNA 提取和檢測(cè)

使用植物基因組DNA 提取試劑盒(DP305，天根生化科技有限公司)提取5 個(gè)路易斯安那鳶尾品種、雜交后代及其誘變材料共40 份材料的葉片總DNA。通過(guò)1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 完整性，使用NanoDrop1000 分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))測(cè)定DNA 濃度及純度(A260/A280)后，將符合測(cè)試要求的各樣品DNA 均稀釋至10 ng.μL-1，凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SSR-PCR 擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測(cè)

多重PCR 擴(kuò)增體系15 μL，包括2×Tsingke Master mix(green)(TSE004， 北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)7．5 μL、DNA(濃度10 ng.μL-1)1 μL、正反向引物(濃度10 μmol.L-1)各1 μL、ddH2O 4．5 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60 ～64℃退火30 s(不同引物退火溫度見表2)，72℃延伸30 s，共30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，最后4℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。第一次擴(kuò)增后的產(chǎn)物(2 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物+5 μL 溴酚藍(lán))通過(guò)1．0%瓊脂糖凝膠電泳(電壓300 V，12 min)檢測(cè)和判斷對(duì)應(yīng)引物是否擴(kuò)增出目的DNA 片段；隨后進(jìn)行二次擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和PCR 反應(yīng)程序同第一次，第二輪退火溫度為53～57℃(不同引物退火溫度見表2)?；?4 對(duì)SSR 標(biāo)記的40 個(gè)路易斯安那鳶尾試驗(yàn)材料的毛細(xì)管電泳檢測(cè)委托北京擎科生物科技有限公司完成，具體步驟參照徐曉丹[12]的方法。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Gene mapper V4．1 軟件(美國(guó)Applied Biosystems 公司)分析毛細(xì)管電泳檢測(cè)的原始數(shù)據(jù)準(zhǔn)確位點(diǎn)。根據(jù)峰圖和位點(diǎn)信息判斷檢測(cè)引物是否具有位點(diǎn)多態(tài)性，選取特異性高，多態(tài)性好的位點(diǎn)作為后續(xù)分析重點(diǎn)。使用PopGen32 軟件計(jì)算SSR 位點(diǎn)遺傳多樣性指標(biāo)，并計(jì)算樣本間的標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離[13]；隨后，采用非加權(quán)平均數(shù)法(unweighted pair-group method with arithmetic means， UPGMA)進(jìn)行遺傳相似性聚類分析，并繪制遺傳親緣關(guān)系樹狀聚類圖。參照徐曉丹[12]的方法，通過(guò)STRUCTURE version 2．3．4 軟件[14]進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析；采用的馬爾科夫鏈蒙特卡洛法(markov chain monte carlo，MCMC)方法可預(yù)設(shè)群體分組(K)，同時(shí)根據(jù)等位基因頻率對(duì)個(gè)體進(jìn)行計(jì)算、抽樣分組，參數(shù)設(shè)置參照徐曉丹[12]的方法。隨后利用在線軟件STRUCTURE HARVESTER ( http：/ /taylor0． biology． ucla． edu/structureHarvester/)計(jì)算最適K 值[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交與誘變育種情況

5 個(gè)路易斯安那鳶尾品種花期均在5月中旬至下旬，但當(dāng)年開花量小且不同品種間花期最大間隔10 d，給雜交工作造成了極大的影響，最終導(dǎo)致品種間雜交收獲的種子數(shù)量較少。5 個(gè)品種獲得雜交后代種子的信息見表1，選擇其中長(zhǎng)勢(shì)較好的9 份種質(zhì)用于后續(xù)分析，9 份種質(zhì)(L3、L4、L5、L16、L17、L26、L34、L35 和L40)的親本信息見表1。

5 個(gè)品種經(jīng)不同劑量60Co-γ 射線處理后的組培苗成活率如表3 所示。5 個(gè)品種的成活率均隨著輻射劑量的成倍增加而顯著降低，即2．5 Gy 劑量處理時(shí)成活率最高，40 Gy 劑量處理時(shí)成活率最低。不同品種間2．5 和5 Gy 劑量處理下成活率較為接近，成活率范圍分別為20．77%～24．99%和13．33%～17．89%；10、20和40 Gy 劑量處理時(shí)，部分品種間成活率存在極顯著差異(P＜0．01)。參照黃桂丹[17]總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)，即半致死劑量或低于半致死劑量的60Co-γ 對(duì)植株傷害小，且易獲得優(yōu)良變異性狀。本試驗(yàn)中5 個(gè)品種在2．5 Gy劑量處理下，成活率均已低于25%，但高于其余4 個(gè)劑量處理，因此選擇2．5 Gy 劑量處理后長(zhǎng)勢(shì)較好的組培苗用于遺傳多樣性分析，誘變材料具體信息見表1。

表3 不同劑量60Co-γ 對(duì)鳶尾成活率的影響Table 3 Effect of different doses of 60Co-γ on the survival rate of iris /%

2.2 引物選擇和擴(kuò)增效果

由于路易斯安那鳶尾由短莖鳶尾、暗黃鳶尾、六角果鳶尾(I. hexagona)、高大鳶尾(I. giganticaerulea)和內(nèi)耳森鳶尾(I.nelsonii)5 個(gè)野生種雜交而來(lái)[2-3]，因此本試驗(yàn)從適用于短莖鳶尾和暗黃鳶尾的532 對(duì)ESTSSR 標(biāo)記中選擇了14 對(duì)用于遺傳多樣性分析，其中IB179、IB194、IB211、IB282、IB314 和IB318 均位于預(yù)測(cè)編碼蛋白框(coding DNA sequence， CDS)，與功能基因密切相關(guān)。14 對(duì)SSR 引物的檢測(cè)結(jié)果表明其中10對(duì)SSR 引物特異性高且多態(tài)性較好，適用于后續(xù)遺傳多樣性分析；而IB68、IB164、IB174 和IB282 在檢測(cè)中存在無(wú)多態(tài)性、條帶雜亂或多態(tài)性低等問(wèn)題，不能用于測(cè)試樣本的遺傳多樣性分析。

2.3 SSR 標(biāo)記多態(tài)性

10 對(duì)特異性高且多態(tài)性好的SSR 引物在40 個(gè)鳶尾材料中共檢測(cè)出60 個(gè)等位基因位點(diǎn)(表4)。其中，最小等位基因數(shù)目為4(IB127、IB175 和IB314)，最大等位基因數(shù)目為11(IB168)，平均等位基因數(shù)目為6。有效等位基因總數(shù)為33．087 4，數(shù)值變化范圍為2．091 7(IB175)～4．071 2(IF173)，平均每個(gè)位點(diǎn)有效等位基因數(shù)目為3．308 7。香農(nóng)指數(shù)的數(shù)值范圍為0．964 9(IB175) ～1．661 9(IB168)，平均值1．347 2。多態(tài)信息指數(shù)的數(shù)值范圍為0．472 7(IB175)～0．718 5(IF173)，平均值0．637 3，可見10 對(duì)SSR 引物具有較高的多態(tài)信息(PIC＞0．25)。觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)的數(shù)值范圍分別為0．297 3(IF194) ～0．571 4(IB318)和0．529 1(IB175)～0．763 9(IF173)，均值分別為0．451 5 和0．696 2。

2.4 聚類和遺傳結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)遺傳相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA 聚類分析，繪制聚類樹狀圖(圖1)。利用10 對(duì)SSR 標(biāo)記可將供試的40 份路易斯安那鳶尾材料相互區(qū)分，10 對(duì)SSR 標(biāo)記可用于鑒定和區(qū)分路易斯安那鳶尾雜交后代和誘變材料。聚類分析將供試材料分成4 類，第Ⅰ類包括9 份材料，為Colorific(L1)、Pegaletta(L27)、Pegaletta 誘變材料(L28～L33)以及♀Pegaletta×♂Heather Stream 雜交后代(L34)；第Ⅱ類包括16 份材料，為Heather Stream(L6)、Heather Stream 誘變材料(L7～L15)及其與其他品種的雜交后代(L3、L4、L5、L16、L17 和L26)；第Ⅲ類包括10 份材料，為Colorific 誘變材料(L2)、Her Highness(L18)、Her Highness 誘變材料(L19 ～L25)以及♀Her Highness×♂Spicy Cayun 雜交后代(L35)；第Ⅳ類包括5份材料，為Spicy Cayun(L36)、Spicy Cayun 誘變材料(L37 ～L39)以及♀Spicy Cayun×♂Colorific(L40)。由此可見，除了Colorific 以外，其余4 個(gè)品種的多數(shù)雜交后代(L5、L16、L17、L34、L35 和L40)與母本的遺傳距離較近。Colorific 作為親本時(shí)，其雜交后代(L3、L4、L5)均與親本Heather Stream 遺傳距離接近，由于該品種經(jīng)輻射誘變后獲得的誘變材料長(zhǎng)勢(shì)均較弱，因此僅選擇其中L2 作為測(cè)試材料，但L2 與Colorific(L1)遺傳距離較大，且更接近于♀Colorific×♂Heather Stream雜交后代(L3)，可見60Co-γ 射線處理耳促進(jìn)Colorfic產(chǎn)生變異。5 個(gè)路易斯安那鳶尾品種中，Heather Stream 品種獲得的誘變材料長(zhǎng)勢(shì)較好，選擇了其中9個(gè)材料(L7 ～L15)用于測(cè)試。由圖1 可知，L7、L13、L14 與親本(L6)遺傳背景較為一致，后續(xù)可不進(jìn)行繼代培養(yǎng)，而L8～L12 與親本遺傳差異大，值得進(jìn)一步擴(kuò)繁后觀測(cè)其表型性狀。Her Highness 品種有7 個(gè)誘變材料(L19～L25)長(zhǎng)勢(shì)較好，但僅L23、L24 和L25 存在差異。對(duì)于Pegaletta 品種的誘變材料，值得繼續(xù)關(guān)注L29 ～L33；對(duì)于Spicy Cayun 品種，誘變材料L38 和L39則較為相近。因此，篩選出的10 對(duì)SSR 標(biāo)記能較好地區(qū)分路易斯安那鳶尾親本、雜交后代和誘變材料，可用于路易斯安那鳶尾育種材料的早期篩選。

表4 10 對(duì)SSR 引物的多態(tài)性信息含量分析Table 4 The analysis of polymorphic information in 10 SSR primer

在 STRUCTURE HARVESTER 中根據(jù) Evanno等[16]的方法計(jì)算，得到的最適ΔK值為5，表明40 個(gè)樣品中有5 個(gè)基因庫(kù)的存在，不同基因庫(kù)由不同顏色表示(圖2、圖3)。由圖3 可見，STRUCTURE 結(jié)果將40 份路易斯安那鳶尾材料分為5 個(gè)組，且5 個(gè)組基本與5 個(gè)品種相對(duì)應(yīng)，不同品種的主要基因庫(kù)不同，可見基于篩選的10 對(duì)SSR 標(biāo)記分析結(jié)果，5 個(gè)路易斯安那鳶尾材料的遺傳結(jié)構(gòu)并不相似。

3 討論

鳶尾屬作為重要園林綠化花卉，國(guó)內(nèi)外已通過(guò)多種方法開展育種工作，以加快育種進(jìn)程。雜交育種技術(shù)作為常用育種技術(shù)之一，已用于鳶尾屬種間和品種間育種，主要研究集中于有髯鳶尾類中的德國(guó)鳶尾類群和無(wú)髯鳶尾類的西伯利亞鳶尾類群、花菖蒲類群等[1，18-19]。我國(guó)已開展路易斯安那鳶尾雜交育種相關(guān)研究，如報(bào)道了黃玉[20]、藍(lán)紋白蝶[21]和紫霞等[22]3 個(gè)新品種。本試驗(yàn)利用已收集的5 個(gè)路易斯安那鳶尾品種進(jìn)行雜交育種，對(duì)其雜交后代進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)多數(shù)雜交后代與母本的遺傳距離更接近。因此，后續(xù)將開展5 個(gè)路易斯安那鳶尾品種的性狀調(diào)查、抗性評(píng)價(jià)、雜交育種等工作，從中篩選符合育種目標(biāo)的母本，可提高雜交育種效率，縮短育種周期。

圖1 基于SSR 標(biāo)記的40 個(gè)鳶尾材料聚類分析Fig.1 Cluster analysis of 40 iris samples based on SSR markers

60Co-γ 射線輻射已用于百合、紅掌、玉蘭、菊花等花卉的誘變育種[17]，然而不同物種、不同組織的最佳輻射劑量存在顯著差異，篩選合適的輻射誘變劑量是誘變育種的關(guān)鍵步驟之一。鳶尾誘變育種工作相對(duì)較少，且主要以種子[2]、種球[23]為誘變材料，篩選出的最佳誘變劑量因材料不同而差異較大。本試驗(yàn)以不同路易斯安那鳶尾品種的無(wú)性系組培苗為試驗(yàn)材料，不同劑量60Co-γ 誘變處理下，劑量越高其成活率越低，在2．5 Gy 劑量處理下不同路易斯安那品種的成活率均已低于25%。此外，在低劑量輻射劑量(2．5、5 和10 Gy)下，不同路易斯安那品種間成活率差異并不明顯；但隨著劑量增加(20、40 Gy)，Her Highness 和Spicy Cayun 成活率高于另外3 個(gè)品種。2．5 Gy 劑量處理下，5 個(gè)路易斯安那鳶尾品種間成活率較為接近(范圍為20．77%～24．99%)，但品種間后期長(zhǎng)勢(shì)存在差異；Colorific、Heather Stream、 Her Highness、 Pegaletta 和Spicy Cayun 分別獲得了1、9、7、6 和3 個(gè)長(zhǎng)勢(shì)健壯的誘變材料，結(jié)合不同60Co-γ 誘變劑量的結(jié)果，可見路易斯安那鳶尾品種間對(duì)60Co-γ 射線的耐受能力存在差異，且Heather Stream 品種耐受能力強(qiáng)于其余4 個(gè)品種。與鳶尾種子或種球相比[2，23]，鳶尾組培苗適宜的60Co-γ 輻射劑量相對(duì)較低，但基于組培快繁體系可獲得大量用于誘變處理的不同品種組培苗，且可對(duì)與親本有差異的誘變株系快速擴(kuò)繁，可加快路易斯安那鳶尾誘變育種進(jìn)程。

本試驗(yàn)選擇2．5 Gy 劑量獲得的誘變材料，采用10對(duì)SSR 標(biāo)記分析其遺傳多樣性，其中Heather Stream、Her Highness、Pegaletta 和Spicy Cayun 的誘變材料雖均與其母本遺傳距離較近，但也篩選出多份與親本存在遺傳差異的誘變材料，且發(fā)現(xiàn)5 個(gè)路易斯安那鳶尾材料的遺傳結(jié)構(gòu)并不相似，表明路易斯安那鳶尾誘變材料具有豐富的多樣性。值得關(guān)注的是， 雖然Colorific(L1)誘變材料中長(zhǎng)勢(shì)較好的僅為L(zhǎng)2，但其與L1 的遺傳距離較大，更接近于Heather Stream，這可能是變異具有不定向性，也可能是由組培的去分化和再分化過(guò)程中發(fā)生基因突變等因素引起。雖然，利用10對(duì)SSR 標(biāo)記對(duì)獲得的路易斯安那鳶尾材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，但本研究并未對(duì)其后期表型，尤其是花期性狀(可否開花、花色等)、株高、株型等進(jìn)行觀測(cè)，后期將開展表型觀測(cè)，篩選與育種目標(biāo)相符的材料。

圖2 基于STRUCTURE 分析K 值與△K 和LnP(D)值折線圖Fig.2 Lines chart of Kvalue with ΔK value and LnP (D) value based on STRUCTURE analysis

圖3 40 個(gè)路易斯安那鳶尾種質(zhì)資源基于模型的遺傳結(jié)構(gòu)(K＝5)Fig.3 Model-based structure of Louisiana iris germplasm resources(K＝5)

近年來(lái)，SSR 標(biāo)記除了用于雜交和自交后代的遺傳多樣性分析和新種質(zhì)鑒定外[24-25]，還成功應(yīng)用于狼尾草屬牧草[26]、高羊茅[27]、紫花苜蓿[28]等不同物種的誘變材料鑒定。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展，除了傳統(tǒng)SSR 標(biāo)記開發(fā)方法，基于轉(zhuǎn)錄組或基因組可更高效和大規(guī)模地開發(fā)SSR 標(biāo)記。例如，在狼尾草屬牧草誘變系鑒定中[26]，Wang 等[29]使用的70 對(duì)SSR 引物是基于象草Survey 測(cè)序開發(fā)的；蔡璐等[27]從高羊茅基因組SSR 引物庫(kù)中隨機(jī)選擇了140 對(duì)引物用于航天誘變株系的鑒定。與模式植物相比，花卉基因組測(cè)序工作相對(duì)滯后，且花卉品種(品系)豐富，部分品種(品系)可能尚未有相關(guān)轉(zhuǎn)錄組報(bào)道。因此，本試驗(yàn)基于短莖鳶尾和暗黃鳶尾轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的532 對(duì)EST-SSR標(biāo)記，選擇其中14 對(duì)相對(duì)多態(tài)性較高的SSR 引物用于遺傳多樣性分析，其中10 對(duì)具有多態(tài)性且穩(wěn)定表達(dá)，由此可見這部分標(biāo)記適用于路易斯安那鳶尾，且可用于雜交后代和誘變材料的鑒定。進(jìn)一步基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選和驗(yàn)證多態(tài)性高且穩(wěn)定的SSR 標(biāo)記，可為路易斯安那鳶尾的遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種奠定一定的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究以引進(jìn)的5 個(gè)路易斯安那鳶尾品種為試驗(yàn)材料，開展了雜交育種和60Co-γ 射線誘變育種，并選擇長(zhǎng)勢(shì)健壯的幼苗進(jìn)行遺傳多樣性分析。從短莖鳶尾和暗黃鳶尾的EST-SSR 標(biāo)記中選擇14 對(duì)SSR 標(biāo)記用于路易斯安那鳶尾品種、雜交后代和誘變材料的遺傳多樣性分析，通過(guò)毛細(xì)管電泳法篩選出10 對(duì)適用于路易斯安那鳶尾的SSR 標(biāo)記。經(jīng)遺傳多樣性分析，路易斯安那鳶尾雜交后代與母本的遺傳差異??；5 個(gè)路易斯安那鳶尾品種經(jīng)不同劑量的60Co-γ 射線輻射后，劑量越高成活率越低；雖然2．5 ～40 Gy 劑量處理下誘變材料成活率均低于25%，但通過(guò)EST-SSR 標(biāo)記分析均獲得了與親本遺傳差異大的誘變材料，可進(jìn)一步擴(kuò)繁后對(duì)其性狀進(jìn)行測(cè)評(píng)。