蔗糖浸種緩解玉米幼苗銅脅迫及其生理指標的灰色關(guān)聯(lián)分析

趙 奇 郭運宏 楊玉珍 陳麗培 羅 青

(1鄭州師范學院，生命科學學院，河南 鄭州 450052；2鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學院，建筑工程系，河南 鄭州 450044)

隨著城鎮(zhèn)工業(yè)化的發(fā)展，重金屬污染帶來的環(huán)境問題日益突出[1-2]。廢棄礦地的開發(fā)利用、金屬冶煉廢液排放、工業(yè)污水灌溉、城市的建設(shè)、化肥農(nóng)藥的使用等途徑均會造成土壤重金屬污染[3-6]。銅是一種被廣泛關(guān)注的重金屬污染成分，也是植物必需的微量營養(yǎng)元素，過量會對植物產(chǎn)生毒害從而抑制植物生長[7-9]。部分研究顯示蔗糖浸種玉米和小麥能提高其對鹽脅迫和干旱脅迫逆境的抗性[10-12]，減輕種子萌發(fā)的抑制作用。同時，有研究表明，無脅迫情況下，葡萄糖浸種能提高玉米種子早期發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)[13]。糖對活性氧代謝及其響應基因的表達亦有重要的調(diào)控作用[14]。有關(guān)外源糖作為信號分子，對植物萌發(fā)過程影響的研究已有較多報道[15-17]。有關(guān)蔗糖對植物影響的研究多集中在鹽分脅迫、水分脅迫以及低溫等抗逆性研究方面，而蔗糖緩解植物重金屬脅迫的報道較少。因此，本研究采用蔗糖浸種處理玉米，探究玉米幼苗在銅脅迫下的生理特性，旨在探明銅脅迫對玉米的毒害作用，進一步了解蔗糖浸種對玉米銅脅迫的緩解作用，為農(nóng)作物抗重金屬污染研究提供思路，也為重金屬污染治理提供可借鑒的數(shù)據(jù)。同時，在此基礎(chǔ)上，進行蔗糖浸種玉米重金屬抗性與各生理生化指標的灰色關(guān)聯(lián)分析，量化各因素與抗性的主次關(guān)系，優(yōu)化篩選可用的生理指標，亦對玉米抗性育種具有一定指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用玉米(Zea maysL．)品種為鄭單958，購于河南秋樂種業(yè)科技股份有限公司。蔗糖浸種和銅脅迫試驗所用蔗糖和硫酸銅(分析純)試劑均購于鄭州萬田生物公司。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗采用兩因素試驗設(shè)計。根據(jù)前期預試驗及相關(guān)的研究結(jié)果[10]，蔗糖浸種處理質(zhì)量濃度為342．3 mg.L-1，設(shè)置4 個硫酸銅濃度水平，分別為0、100、200、400 mg.L-1，試驗設(shè)3 次重復。首先用10%次氯酸鈉浸泡玉米種子10 min，再用蒸餾水沖洗5～6 次，采用342．3 mg.L-1(1 mmol.L-1)蔗糖浸種，并以蒸餾水浸種作為對照，放置暗處25℃至萌動，之后放置RQX-400H智能型人工氣候箱(常州金壇精達儀器制造有限公司)中培養(yǎng)，光照時間為12 h，晝溫25℃，夜溫18℃。選取株高3 cm 左右整齊一致的幼苗，每天上午8：00 和下午16：00 定時加入硫酸銅處理液2 次，每次18 mL。處理12 d 后，取樣測定株高、根長、葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD) 活 性、 過 氧 化 物 酶(peroxidase，POD)活性、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性。

1.3 測試指標與方法

1．3．1 玉米生長狀況指標測定 處理12 d 后，取玉米幼苗，測量記錄株高、根長等指標，并計算相對根長、相對株高。相對根長＝蔗糖浸種根長/對照根長，相對株高＝蔗糖浸種株高/對照株高。

1．3．2 生理指標測定 葉綠素含量采用乙醇浸提分光光度法測定[18]；SOD 活性采用氮藍四唑還原法測定[19]；POD 活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[20]；可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍法測定[21]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[22]；CAT 活性采用紫外吸收法測定[21]；脯氨酸含量采用茚三酮法測定[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2016 和SPSS 25．0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理、繪圖和相關(guān)性分析。

采用灰色關(guān)聯(lián)分析方法進行多因素關(guān)聯(lián)程度的定量化比較分析[23-25]，參照王士強等[26]和胡江龍等[27]的研究，重金屬抗性系數(shù)＝Xd/XCK，其中Xd為脅迫下指標測定值，XCK為對照組指標測定值。將重金屬抗性系數(shù)和所測全部生理生化指標作為一個灰色系統(tǒng)，依據(jù)具體生理指標與抗性的關(guān)系，以每個指標所對應的最優(yōu)值構(gòu)成的數(shù)列作為參考數(shù)列X0，脅迫生理生化指標作為比較數(shù)列Xi(i＝1，2，3……)，參照公式(1)進行參考數(shù)列和比較數(shù)列的無量綱化處理，參照公式(2)和(3)完成關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度的計算：

式中，X′i(k)為原始數(shù)據(jù)無量綱化結(jié)果，Xi(k)為指標值，X為平均值，Si為標準差。

式中，ξoi(k)是第k個參考數(shù)據(jù)列與比較數(shù)據(jù)列的關(guān)聯(lián)系數(shù)，表示為Χ0序列與Χi序列在k 點的絕對差，為Χ0序列與Χi序列的最小差值，為Χ0序列與Χi序列的最大差值。δ為灰數(shù)白化值，δ∈(0，1)，一般取0．5，本研究取值0．5。

式中，n為關(guān)聯(lián)系數(shù)的數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖浸種對銅脅迫下玉米幼苗生長的影響

由圖1 可知，不同濃度銅脅迫下，蔗糖浸種均能提高玉米幼苗的株高。在0、100、200、400 mg.L-1硫酸銅水平下，蔗糖浸種組的株高相比蒸餾水浸種分別增加了11．39%、32．48%、32．37%、19．35%。在100、200、400 mg.L-1硫酸銅水平下，蔗糖浸種組的相對株高相比蒸餾水浸種組分別增加18．92%、19．67%、7．14%。兩因素方差分析結(jié)果顯示，蔗糖浸種對玉米株高和相對株高的影響極顯著(F＝379．31??，F(xiàn)＝36．57??)；銅脅迫對玉米株高和相對株高的影響均達到了極顯著水平(F＝955．55??，F(xiàn)＝394．01??)；蔗糖浸種與銅脅迫互作對玉米株高和相對株高的影響達極顯著水平(F＝20．45??，F(xiàn)＝8．04??)。綜上可知，銅脅迫抑制了玉米幼苗地上部的生長，試驗使用的蔗糖浸種濃度能極顯著減輕銅脅迫對玉米幼苗生長的抑制作用。

由圖2 可知，蔗糖浸種提高了銅脅迫下玉米幼苗的根長。在0、100、200、400 mg.L-1硫酸銅水平下，蔗糖浸種組的根長分別較蒸餾水浸種組增加了3．74%、18．46%、11．76%、24．32%。100～400 mg.L-1硫酸銅水平，蔗糖浸種組的相對根長與相同銅脅迫下蒸餾水浸種組相比增幅為13．11%、6．25%、20．00%，其中以400 mg.L-1硫酸銅水平時增幅最高。銅脅迫濃度為100、400 mg.L-1時，蔗糖浸種組玉米幼苗根長與蒸餾水浸種組相比差異極顯著(P＜0．01)。兩因素方差分析表明，蔗糖浸種對玉米根長和相對根長的影響達到極顯著水平(F＝48．87??，F(xiàn)＝14．73??)；蔗糖浸種與銅脅迫互作對根長和相對根長的影響不顯著。

綜上，銅脅迫對玉米幼苗根部的抑制作用明顯高于地上部，且蔗糖浸種能有效緩解銅脅迫對玉米幼苗地上部和地下部的生長抑制作用，有利于玉米的正常生長

圖1 蔗糖浸種對硫酸銅處理下玉米幼苗株高的影響Fig.1 Effect of seed soaking with sucrose on plant height of maize treated with copper sulfate

圖2 蔗糖浸種對硫酸銅處理下玉米幼苗根長的影響Fig.2 Effect of seed soaking with sucrose on root length of maize treated with copper sulfate

2.2 蔗糖浸種對銅脅迫下玉米幼苗葉綠素含量的影響

玉米幼苗葉綠素含量變化如圖3 所示，蔗糖浸種后，玉米幼苗葉綠素含量變化無明顯規(guī)律， 除200 mg.L-1銅脅迫，其他銅脅迫處理玉米幼苗葉綠素含量較蒸餾水浸種均略提高。隨著硫酸銅濃度升高，蔗糖浸種組葉綠素先升后降，其中100 mg.L-1銅脅迫處理的葉綠素含量最高方差分析結(jié)果表明，蔗糖浸種對玉米幼苗葉綠素含量無顯著影響(F＝0．51)。

2.3 蔗糖浸種對銅脅迫下玉米幼苗抗氧化酶活性的影響

圖3 蔗糖浸種對硫酸銅處理下玉米幼苗葉綠素含量的影響Fig.3 Effect of seed soaking with sucrose on chlorophyll content of maize treated with copper sulfate

由圖4-A 可知，蔗糖浸種提高了銅脅迫下玉米幼苗的SOD 活性。在0、100 mg.L-1硫酸銅水平下，蔗糖浸種組SOD 活性分別較蒸餾水浸種組提高1．86%和4．43%；在200、400 mg.L-1硫酸銅水平下，SOD 活性提升幅度高達28．04%和21．53%，且差異達極顯著水平(P＜0．01)，因此，硫酸銅濃度高于100 mg.L-1時，蔗糖浸種能極顯著提高SOD 活性。兩因素方差分析表明，蔗糖浸種及其與銅脅迫互作對玉米幼苗SOD 活性均達極顯著影響(F＝306．95??、F＝76．70??)。

由圖4-B 可知，與蒸餾水浸種相比，蔗糖浸種后玉米幼苗POD 活性升高，在100 mg.L-1硫酸銅水平下，蔗糖浸種POD 活性提升幅度最大(14．06%)，隨著銅脅迫濃度繼續(xù)增加，提升幅度有所降低，硫酸銅濃度為400 mg.L-1時增幅降至4．73%。100～400 mg.L-1硫酸銅水平范圍內(nèi)，除400 mg.L-1硫酸銅水平下蔗糖浸種組POD 活性顯著高于蒸餾水浸種組外(P＜0．05)，其他濃度銅脅迫時，蔗糖浸種組POD 活性均極顯著高于蒸餾水浸種組(P＜0．01)，表明蔗糖浸種能顯著提高銅脅迫處理玉米幼苗的POD 活性。且兩因素方差分析表明，蔗糖浸種與銅脅迫互作對玉米幼苗POD 活性具有極顯著影響(F＝5．62??)。

由圖4-C 可知，與蒸餾水浸種相比，蔗糖浸種處理后，除200 mg.L-1硫酸銅水平外，玉米幼苗CAT 活性均有所提高。蔗糖浸種后玉米幼苗響應銅脅迫的CAT 增幅變化較為復雜，增幅由高到低對應的銅脅迫濃度依次為100、400、0 mg.L-1。兩因素方差分析表明，蔗糖浸種以及蔗糖浸種與銅脅迫互作均對CAT 活性有極顯著影響(F＝85．46??和F＝29．5??)。

綜上可知，與蒸餾水浸種相比，除200 mg.L-1硫酸銅水平下，蔗糖浸種組CAT 活性略微下降外，蔗糖浸種處理均提高了玉米幼苗的SOD、POD、CAT 活性，表明蔗糖浸種提升了玉米幼苗抗氧化酶活性，在一定程度上減緩了銅脅迫傷害。

圖4 蔗糖浸種對硫酸銅處理下玉米幼苗SOD、POD、CAT 活性的影響Fig.4 Effect of seed soaking with sucrose on SOD、POD、CAT of maize treated with copper sulfate

2.4 蔗糖浸種對銅脅迫下玉米幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖5 可知，與蒸餾水浸種相比，蔗糖浸種后玉米幼苗的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量變化較復雜，無明顯一致性，僅在100 mg.L-1硫酸銅水平下，3個指標均提高，分別為14．89%、10．74%、19．23%，脯氨酸含量的提升幅度高于其他2 個指標。蔗糖浸種對銅脅迫下玉米幼苗可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的影響均未達到顯著水平(F值分別為0．48、0．005 和0．07)。綜上，蔗糖浸種對銅脅迫下玉米幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)無顯著影響，而銅脅迫極顯著增高了玉米幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(P＜0．01)。

2.5 灰色關(guān)聯(lián)度的分析結(jié)果

圖5 蔗糖浸種對硫酸銅處理下玉米幼苗可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸的影響Fig.5 Effect of seed soaking with sucrose on soluble sugar、soluble protein and proline of maize treated with copper sulfate

依據(jù)灰色系統(tǒng)理論，將蔗糖處理對銅脅迫恢復指數(shù)與其他生理生化指標作為一個灰色系統(tǒng)，蔗糖處理對銅脅迫恢復指數(shù)做參考序列，生理生化指標作為比較序列，計算比較序列與參考序列的關(guān)聯(lián)度，關(guān)聯(lián)度數(shù)值越高，比較系列與參考系列的變化態(tài)勢越接近，表明該指標與蔗糖浸種處理對玉米幼苗銅脅迫恢復能力關(guān)系越密切。通過計算求出各指標與抗逆系數(shù)的關(guān)聯(lián)度并進行排序，結(jié)果如表1 所示。各生理指標與蔗糖浸種處理對銅脅迫恢復指數(shù)的灰色關(guān)聯(lián)度從大到小依次為：相對根長、相對株高、根長、脯氨酸含量、POD 活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、CAT 活性、葉綠素含量、SOD 活性、株高。

在11 個指標中，相對根長為根部相關(guān)指標，與蔗糖處理對銅脅迫恢復指數(shù)關(guān)系最為密切(0．799)，此外，根長指標排名第三(0．767)，根部相關(guān)指標排位較靠前。地上部指標中，相對株高位居比較序列第二(0．775)，但株高關(guān)聯(lián)度排序靠后(0．579)。在顯著性差異分析中表明，蔗糖處理組與對照處理組間株高有極顯著差異(P＜0．01)，而株高指標與脅迫恢復指數(shù)間的關(guān)聯(lián)度卻較低，說明直接用株高來檢測蔗糖處理對銅脅迫緩解能力不太合適，選擇相對株高更準確，這為蔗糖浸種緩解玉米銅脅迫的抗逆研究中指標的選用提供了重要參考。

表1 各指標與恢復指數(shù)的灰色灰色關(guān)聯(lián)度及關(guān)聯(lián)序Table 1 Grey correlation degree and rank of trains and recovery index

3 討論

重金屬對農(nóng)作物種子萌發(fā)和生長發(fā)育的影響是研究者關(guān)注的焦點[28]，較多學者在提高植物重金屬脅迫的耐受性和抗逆性的研究中，使用多效唑[29]、甜菜堿[30]、硫元素[31]、拮抗金屬離子[32]等多種處理方法，而有關(guān)蔗糖浸種緩解重金屬脅迫的相關(guān)報道較少。本研究采用蔗糖浸種方式，進行銅脅迫下的玉米萌發(fā)生理研究，發(fā)現(xiàn)玉米幼苗的萌發(fā)形態(tài)學指標、生理生化指標等發(fā)生了一定的變化。研究結(jié)果表明，玉米幼苗在銅脅迫下對地下部生長的抑制作用高于地上部，這與前人的研究結(jié)果一致[28]；且蔗糖浸種處理能有效緩解重金屬銅對玉米幼苗的生長抑制，這與趙瑩等[10]有關(guān)外源糖可以緩解玉米鹽逆境時的生長抑制研究結(jié)果類似。本試驗結(jié)果表明，外源蔗糖對銅脅迫玉米的萌發(fā)有重要影響，但其是否具有類似植物激素信號分子性質(zhì)，以及如何調(diào)控玉米生長發(fā)育和響應銅脅迫尚需進一步研究。

大量研究表明，重金屬脅迫下植物抗氧化酶SOD、POD、CAT 活性的表現(xiàn)不盡相同，徐成斌等[33]研究鉻脅迫玉米種子萌發(fā)時，發(fā)現(xiàn)SOD 活性、POD 活性、MDA 含量隨處理濃度的升高而升高。陳順鈺等[34]關(guān)于鉛鎘重金屬的研究結(jié)果表明，SOD、POD 和CAT 活性變化趨勢不完全一致，隨著處理濃度的增加，SOD活性降低，POD 和CAT 活性則呈先升高后降低再升高的趨勢。本研究中銅脅迫下SOD 活性逐步升高，POD和CAT 活性則先升后降，這與前人的成果不完全一致[35-38]，推測可能與不同物種抗氧化酶體系對重金屬響應差異以及不同生育時期、脅迫程度不同等有關(guān)。本研究中，與蒸餾水浸種相比，在一定濃度的銅脅迫下，蔗糖浸種能顯著提高玉米幼苗的抗氧化酶活性，推測可能是蔗糖通過影響還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶和磷酸戊糖代謝途徑調(diào)控了活性氧水平[10]。后續(xù)可開展磷酸戊糖代謝途徑的限速酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫基因調(diào)控谷胱甘肽含量等方面的研究，探明蔗糖提高銅脅迫下玉米幼苗抗氧化酶能力的作用機制。

此外，逆境脅迫下生物細胞膜會受到一定程度的損傷，生物體可通過積累有機物質(zhì)調(diào)節(jié)細胞滲透勢來減緩傷害[39-40]。本研究通過測定可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的結(jié)果表明，銅脅迫對玉米幼苗3 個指標均有顯著的影響(F值分別為97．41??、6．93??、112．30??)，體現(xiàn)了植物自身對逆境的抵抗，這與前人的研究結(jié)果類似[27，29]。而本研究中，僅在100 mg.L-1硫酸銅水平下，蔗糖浸種組3 個滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量升高。蔗糖處理對銅脅迫下3 個指標含量無顯著影響，而銅脅迫處理對3 個滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均有顯著影響，表明植物對銅脅迫有較明顯的抵抗響應。因此，蔗糖浸種處理與植物自身對重金屬的抵抗響應作用相比影響微弱，引起差異的作用機制尚需進一步研究證實。

逆境抗性生理指標的優(yōu)化篩選是抗性生理研究的一項內(nèi)容[41-42]。本研究與多品種的抗性聚類劃分、主成分分析歸類，研究的出發(fā)點不同，不宜進行橫向優(yōu)劣比較。本研究借助灰色系統(tǒng)理論進行蔗糖緩解玉米幼苗銅脅迫的能力與生理指標關(guān)聯(lián)程度的研究，結(jié)果表明，優(yōu)選指標建議重點考慮相對根長、相對株高、根長、脯氨酸含量、POD 活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、CAT 活性等中高關(guān)聯(lián)指標。從生理學角度考慮，以上亦是植物緩解銅脅迫的重要抗逆指標，例外的是SOD 活性指標關(guān)聯(lián)度較低，需要進一步從關(guān)聯(lián)度、變異系數(shù)以及脅迫濃度范圍與抗性生理指標間的穩(wěn)定性方面深入分析原因。

4 結(jié)論

通過蔗糖浸種對銅脅迫下玉米幼苗的生理研究發(fā)現(xiàn)，本試驗所用濃度為342．3 mg.L-1的蔗糖浸種能有效緩解400 mg.L-1以下銅脅迫對玉米幼苗生長的抑制作用，有效提高抗氧化酶活性；能提高200 mg.L-1以下硫酸銅處理的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，但整體影響效果不顯著。蔗糖浸種緩解玉米幼苗銅脅迫的優(yōu)選指標可重點考慮相對根長、相對株高、根長、脯氨酸、POD 活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、CAT 活性等。本研究為玉米重金屬抗性研究提供了理論數(shù)據(jù)，為揭示蔗糖緩解植物重金屬脅迫的分子機制提供了參考，同時為抗逆指標篩選方面提供了借鑒。但本研究設(shè)置的蔗糖浸種濃度尚需進一步細化，蔗糖浸種緩解玉米幼苗銅脅迫的生化代謝途徑及分子作用機理方面仍需要深入研究。