蘇 偉，鄧山鴻，陳 鋼*

（1.江西科技師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

臍橙營(yíng)養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。隨著我國臍橙資源進(jìn)一步豐盛，將臍橙加工成為豐富多樣的食品，是解決資源過剩的關(guān)鍵[1]。臍橙果酒是兼具臍橙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和酒精的風(fēng)味飲品，是臍橙資源深加工的重要方向之一[2]。低溫發(fā)酵是指微生物在相對(duì)較低的溫度環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，而發(fā)酵制品風(fēng)味更佳[3]。果酒中，白葡萄酒是主要的低溫發(fā)酵產(chǎn)品，低溫發(fā)酵溫度一般為10～12 ℃，具有獨(dú)特的風(fēng)味口感[4]。果酒采用低溫發(fā)酵有如下優(yōu)點(diǎn)[5]：①降低雜菌微生物對(duì)果酒的影響。②較好的保留小分子香氣物質(zhì)。③優(yōu)化酵母代謝積累產(chǎn)物。研究表明，低溫發(fā)酵可促進(jìn)酯類物質(zhì)生產(chǎn)，并保持果酒中較高含量的萜烯類物質(zhì)[6]。目前，果酒釀造大多以酒精含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在最適合酒精發(fā)酵的條件下發(fā)酵。而對(duì)果酒的開發(fā)研究，越來越注重果酒的香氣成分[7]。因此，采用低溫發(fā)酵工藝釀造臍橙果酒，提高果酒中的香氣成分含量，對(duì)改善臍橙果酒品質(zhì)具有重要的意義。

該研究以臍橙為原料，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化臍橙果酒低溫發(fā)酵工藝，并采用頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，進(jìn)一步分析臍橙果酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，為低溫發(fā)酵臍橙果酒的實(shí)際生產(chǎn)與應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臍橙：江西省信豐縣；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：中國微生物菌種保藏中心；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；果膠酶（酶活5萬U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；白砂糖（食品級(jí)）：鄭州瑞之祥生物科技有限公司；偏重亞硫酸鉀（分析純）：河南華興生物科技公司；3-辛醇（色譜純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N-5975B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；頂空進(jìn)樣器：美國Supelco公司；50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭：美國Supelco公司；MP2002電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HR1882型榨汁機(jī)：飛利浦（中國）投資有限公司；WYT-J型手持糖度計(jì)：成都光學(xué)廠；pH S22型數(shù)顯酸度計(jì)：德國Sartorius公司；MJX-100B-Z霉菌培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；VS-1300型超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 臍橙果酒發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

臍橙→分選→清洗→去皮→破碎（加果膠酶）→壓榨→果汁（加果膠酶、SO2）→加熱→靜置→調(diào)整成分（接種酵母菌，加白砂糖、SO2）→控溫發(fā)酵→倒罐→陳釀→臍橙酒

酵母活化：將保藏的菌種接種至YPD液體培養(yǎng)基中活化，于28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，放入4 ℃冰箱備用。

臍橙果酒母液的制備：挑選果體偏黃色、色澤均勻、無明顯色差、表皮光滑、果形端正的臍橙，剔除霉?fàn)€果及雜質(zhì)。用清水洗滌除去表面污物，以減少原料的帶菌量；將臍橙去皮切成小塊置于打漿機(jī)中破壁。在破壁后的果漿中加入果膠酶100 mg/kg，SO250 mg/kg（按偏重亞硫酸鉀質(zhì)量50%計(jì)，下同），均勻靜置2.5 h后進(jìn)行榨汁。果汁榨出后再加入果膠酶15 mg/kg，水浴加熱至45 ℃，靜置澄清4 h，使得果膠充分水解。

臍橙果酒的發(fā)酵：將澄清后的果汁分裝至250 mL錐形瓶中，添加白砂糖使發(fā)酵初始可溶性固形物至一定值，同時(shí)加入SO230 mg/kg。按體積比接種一定量活化釀酒酵母至含180 mL臍橙果汁的250 mL錐形瓶中。控溫發(fā)酵，至酒精度穩(wěn)定不變，視為主發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程中定期排出發(fā)酵產(chǎn)生的CO2，主發(fā)酵結(jié)束后倒罐，轉(zhuǎn)入陳釀階段。將主發(fā)酵完成后的酒樣置于12 ℃恒溫箱陳釀30 d，得臍橙酒。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

（1）發(fā)酵溫度對(duì)臍橙果酒低溫發(fā)酵的影響：初始糖度調(diào)整至22%，接種量為果汁體積3%，分別于8 ℃、10 ℃、12 ℃、14 ℃、16 ℃、18 ℃發(fā)酵，至可溶性固形物含量不變，測(cè)定臍橙果酒的酒精度和總酯含量。

（2）初始糖度對(duì)臍橙果酒低溫發(fā)酵的影響：酵母接種量為3%，于14 ℃發(fā)酵，分別添加白砂糖使發(fā)酵母液的初始糖含量為19%、20%、21%、22%、23%、24%，至可溶性固形物含量不變，測(cè)定臍橙果酒的酒精度和總酯含量。

（3）酵母接種量對(duì)臍橙果酒低溫發(fā)酵的影響：初始糖度為22%，于14 ℃發(fā)酵。酵母接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%，至可溶性固形物含量不變，測(cè)定臍橙果酒的酒精度和總酯含量。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵溫度（A）、初始糖度（B）、酵母接種量（C）3個(gè)因素，以總酯含量（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)[8]，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 臍橙果酒低溫發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis for navel orange wine low temperature fermentation conditions optimization

1.3.4 測(cè)定方法

（1）酒精度、總糖、總酸等基礎(chǔ)理化指標(biāo)的檢測(cè)參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[9]；可溶性固形物含量：手持糖度計(jì)測(cè)定；總酯含量測(cè)定：回流皂化法[10]。

（2）感官評(píng)定[11]：陳釀階段完成后進(jìn)行感官評(píng)定。由15名食品專業(yè)人員組建感官評(píng)定小組，依據(jù)感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（見表2）對(duì)果酒進(jìn)行感官評(píng)分，取平均分，滿分100分。

表2 臍橙果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of navel orange wine

1.3.5 香氣成分檢測(cè)

頂空-固相微萃?。℉S-SPME）[12]：取8 mL臍橙酒樣品、3.0 g NaCl于20 mL樣品瓶中，密封，將樣品瓶于40 ℃攪拌平衡15 min后，將老化的萃取頭插入密封的樣品瓶中，頂空萃取40 min，然后在氣相色譜進(jìn)樣口230 ℃解吸3 min，采用GC-MS分析其揮發(fā)性成分。

GC條件：石英毛細(xì)管色譜柱HP-5MS（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；起始溫度40 ℃，保留時(shí)間2 min，以5 ℃/min升至230℃，保留時(shí)間15min；不分流進(jìn)樣，載氣He，流速：1.2mL/min。

MS條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃，質(zhì)量范圍33～400 amu。

定性與定量分析：與Wiley7.0/美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）05檢索數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，并結(jié)合保留指數(shù)進(jìn)行定性分析。采用峰面積歸一化法計(jì)算各物質(zhì)的相對(duì)含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Design-Expert V8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，Origin2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)臍橙果酒發(fā)酵的影響

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)臍橙果酒酒精度和總酯含量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on alcohol content and total ester content of navel orange wine

由圖1可知，隨發(fā)酵溫度的增加，酒精度呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，而總酯含量呈現(xiàn)先增加后緩慢下降的趨勢(shì)。當(dāng)臍橙果酒發(fā)酵溫度為14 ℃，總酯含量達(dá)到最大值（1.081 g/L）。發(fā)酵溫度過低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵遲滯或停止[13]，嚴(yán)重影響發(fā)酵效果，酒精度和總酯含量偏低。發(fā)酵溫度偏高則不利于小分子的保留，使果酒總酯含量略低。綜合考慮，發(fā)酵溫度為14 ℃較合適。

2.1.2 初始糖度對(duì)臍橙果酒發(fā)酵的影響

圖2 初始糖度對(duì)臍橙果酒酒精度和總酯含量的影響Fig.2 Effect of initial sugar content on alcohol content and total ester content of navel orange wine

由圖2可知，隨初始糖度的增加，酒精度和總酯含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在初始糖度為22%時(shí)達(dá)到最大值（1.128 g/L）。發(fā)酵母液中的糖是酵母代謝產(chǎn)生酒精和風(fēng)味物質(zhì)的主要消耗物，母液中的糖含量過低，則果酒無法達(dá)到預(yù)期的酒精度，口味寡淡。發(fā)酵母液中的糖含量過高，則會(huì)使酵母處于高滲環(huán)境中，抑制酵母的發(fā)酵效率，果酒口感也會(huì)變差[14]。綜合考慮，初始糖度為22%較合適。

2.1.3 接種量對(duì)臍橙果酒發(fā)酵的影響

圖3 酵母接種量對(duì)臍橙果酒酒精度和總酯含量的影響Fig.3 Effect of yeast inoculum on alcohol content and total ester content of navel orange wine

由圖3可知，臍橙果酒的酒精度與總酯含量隨酵母接種量的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在接種量為3%時(shí)達(dá)到最大值（1.080 g/L），果酒的發(fā)酵接種量的大小受到菌種和發(fā)酵母液的環(huán)境的限制，直接影響到果酒的發(fā)酵效率[15]。低溫發(fā)酵時(shí)接種量過小，則啟動(dòng)發(fā)酵較慢，發(fā)酵效率低。接種量過高則會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗量過大，不利于酒精和酯類物質(zhì)的生產(chǎn)。綜合考慮，選擇接種量為3%較合適。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定發(fā)酵溫度（A）、初始糖度（B）、酵母接種量（C）為考察因素，以總酯含量（Y）為響應(yīng)值，由Design-Expert V8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件設(shè)計(jì)3因素3水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面分析結(jié)果見表3，方差分析見表4。通過軟件分析擬合，得到臍橙低溫發(fā)酵果酒總酯含量對(duì)發(fā)酵溫度（A）、初始糖度（B）、酵母接種量（C）的回歸方程為：Y=1.074+0.020A+0.052B+0.024C-0.03AB-0.049AC+0.03BC-0.11A2-0.09B2-0.07C2。

表3 臍橙果酒低溫發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for navel orangewinelowtemperaturefermentationconditionsoptimization

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），回歸模型的決定系數(shù)R2=0.985 4，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.966 6，說明該回歸模型與試驗(yàn)擬合較好，可以用于對(duì)低溫發(fā)酵臍橙酒總酯含量的預(yù)測(cè)。其中B、C、AC、A2、B2、C2對(duì)果酒總酯含量影響極顯著（P＜0.01）；A、AB、BC對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。由方差分析說明試驗(yàn)所選因素的影響強(qiáng)弱次序?yàn)槌跏继嵌龋窘湍附臃N量＞發(fā)酵溫度。

由響應(yīng)面分析得到低溫發(fā)酵臍橙酒的最佳條件為發(fā)酵溫度13.98 ℃，初始糖度22.33%，酵母接種量3.24%，理論預(yù)測(cè)總酯含量為1.086 g/L。考慮實(shí)際因素及操作條件，將低溫發(fā)酵臍橙酒的工藝參數(shù)調(diào)整為發(fā)酵溫度14 ℃、初始糖度22.3%、酵母接種量3.2%，據(jù)此工藝條件的低溫發(fā)酵試驗(yàn)，經(jīng)3次驗(yàn)證試驗(yàn)得到果酒的平均總酯含量實(shí)際值為1.084 g/L，與預(yù)測(cè)值接近，說明模型可行性較高，可作為實(shí)際生產(chǎn)的依據(jù)。

圖4 初始糖度、發(fā)酵溫度、酵母接種量交互作用對(duì)總酯含量影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between initial sugar content,fermentation temperature and yeast inoculum on total ester content

2.3 臍橙低溫發(fā)酵酒理化指標(biāo)及香氣成分分析

表5 低溫發(fā)酵臍橙果酒基本理化指標(biāo)Table 5 Basic physicochemical indexes of low temperature fermented navel orange wine

由表5可知，臍橙果酒各項(xiàng)理化指標(biāo)符合國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)低溫發(fā)酵臍橙果酒的香氣成分進(jìn)行的定性與定量分析結(jié)果（見表6）可知，臍橙果酒共鑒定出33種香氣化合物，含量占總成分的97.91%，其中醇類物質(zhì)6種（17.09%），萜烯類物質(zhì)10種（27.65%），酸類物質(zhì)2種（8.03%），酯類物質(zhì)10種（43.24%），醛酮類物質(zhì)5種（1.91%）。香氣成分分析結(jié)果表明，酸類和醛酮類物質(zhì)整體較少，萜烯類、酯類和醇類物質(zhì)相對(duì)含量較高。低溫發(fā)酵的相關(guān)研究表明，低溫環(huán)境為萜烯類和酯類物質(zhì)提供了較好保留環(huán)境[16]。與此同時(shí)，酵母處于低溫脅迫狀態(tài)時(shí)，也會(huì)減少高級(jí)醇含量，并使酯類物質(zhì)產(chǎn)量增加[17]。

在萜烯類物質(zhì)中含量相對(duì)較高的有D-檸檬烯（14.70%）、β-水芹烯（5.38%）、4-萜烯醇（3.52%），這些物質(zhì)主要是臍橙的原果香氣，賦予果酒獨(dú)特的臍橙風(fēng)味與口感[18]。尤其是D-檸檬烯，在果酒中含量高，香氣閾值低，對(duì)果酒香氣貢獻(xiàn)較大，此外，研究還發(fā)現(xiàn)其具有獨(dú)特的保健功能[19]；酯類物質(zhì)含量相對(duì)較高的有辛酸乙酯（10.68%）、癸酸乙酯（8.87%）、庚酸乙酯（7.77%），這些物質(zhì)對(duì)于果酒的花香、果香具有較大的貢獻(xiàn)[20]，在低溫發(fā)酵時(shí)產(chǎn)量較高。

醇類物質(zhì)與酸類物質(zhì)含量均與酵母低溫發(fā)酵代謝有關(guān)，低溫發(fā)酵會(huì)使高級(jí)醇含量減少，而癸酸和辛酸是酵母低溫發(fā)酵典型的代謝產(chǎn)物，與酵母的低溫適應(yīng)性有關(guān)。醛酮類物質(zhì)整體含量較低，對(duì)果酒的影響較小。

表6 低溫發(fā)酵臍橙果酒香氣成分分析Table 6 Analysis of aroma components in low temperature fermented navel orange wine

3 結(jié)論

本研究通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化臍橙果酒低溫發(fā)酵工藝，最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度14 ℃、初始糖度22.3%、酵母接種量3.2%。在此最佳發(fā)酵條件下，釀造的臍橙果酒總酯含量為1.084 g/L。此工藝釀制的臍橙果酒外觀澄清、透明，果香酒香濃郁協(xié)調(diào)，具有獨(dú)特的風(fēng)味。通過頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)臍橙酒風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，在低溫發(fā)酵臍橙酒中共檢出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)32種，其中含量較高的為萜烯類物質(zhì)（28%）和酯類物質(zhì)（43%），兩類物質(zhì)對(duì)于果酒的香氣具有重要貢獻(xiàn)。試驗(yàn)對(duì)豐富臍橙果酒香氣成分，改善臍橙果酒品質(zhì)具有重要意義。