李政 麻華膽 鄭愛甜 劉賢彬 王琳 曾娜 吳標良

【摘要】?目的?體外觀察濕潤燒傷膏（moist exposed burn ointment，MEBO）對糖尿病大鼠慢性創(chuàng)面纖維細胞生長的影響，探討MEBO促進糖尿病慢性創(chuàng)面愈合的機制。方法?首先建立糖尿病創(chuàng)面大鼠模型，待第11天后分離、培養(yǎng)創(chuàng)面成纖維細胞，經(jīng)消化、傳代至第3代后，隨機將細胞分成對照組、MEBO組（1 g/L），采用CCK-8法檢測12、24、48、72、96 h細胞增殖情況，采用細胞劃痕來觀察MEBO對成纖維細胞遷移的影響。結果?48 h起MEBO組各個時間點的OD值均高于對照組（P<0.05或0.001），細胞增殖率在72 h達到高峰;劃痕實驗檢測顯示，MEBO組促進成纖維細胞遷移能力比對照組強，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結論?MEBO可促進糖尿病大鼠慢性創(chuàng)面成纖維細胞增殖與遷移能力。

【關鍵詞】?MEBO;糖尿病;慢性創(chuàng)面;成纖維細胞;增殖

中圖分類號：R587.2?文獻標志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.01.003

【Abstract】?Objective?To observe the effect of moist exposed burn ointment （MEBO） on the growth of fibroblasts in chronic wounds of diabetic rats， and to explore the mechanism of MEBO in promoting the healing of diabetic chronic wounds. Methods?Firstly， the diabetic wound model was established in rats， after 11 days， the wound fibroblasts were separated and cultured. After digestion and passage to the third generation， the cells were randomly divided into control group and MEBO group （1 g/L）. And then， the CCK-8 method was used to detect cell proliferation at 12 h， 24 h， 48 h， 72 h， 96 h， and cell scratches were used to observe the effect of MEBO on fibroblast migration. Results?The OD value of the MEBO group at each time point was higher than that of the control group from 48 h （P < 0.05 or 0.001）， and the cell proliferation rate reached the peak at 72 h; scratch test showed that the ability of MEBO group to promote fibroblast migration was stronger than that of the control group， and difference was statistically significant （P < 0.01）.Conclusion?MEBO can promote the proliferation and migration of fibroblasts from chronic wounds of diabetic rats.

【Key words】?MEBO; diabetes; chronic wound; fibroblasts; proliferation

隨著人口老齡化以及生活方式的改善，糖尿病的患病人數(shù)在逐年增加，而糖尿病慢性創(chuàng)面愈合困難已成為糖尿病患者致殘、致死的主要問題之一，創(chuàng)面愈合往往要經(jīng)歷凝血期、炎癥期、增殖期、重塑期四個階段，成纖維細胞生長在創(chuàng)面愈合中具有重要意義。濕潤燒傷膏（moist exposed burn ointment，MEBO）是一種在慢性創(chuàng)面領域應用超過30年的傳統(tǒng)中醫(yī)藥，臨床應用效果良好，但具體機制尚未闡明。本研究擬通過體外觀察MEBO對成纖維細胞生長的影響，探討MEBO促進糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的機制。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物

取自SPF級Wistar雄性大鼠的創(chuàng)面成纖維細胞，大鼠由長沙市天勤生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2014-0011。該實驗經(jīng)右江民族醫(yī)學院動物倫理委員會批準。

1.1.2?主要試劑

鏈脲佐菌素（STZ）：北京華越洋生物科技有限公司生產(chǎn);水合氯醛：成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn);胰蛋白酶、PBS液、二甲基亞砜（DMSO）：北京索萊寶公司生產(chǎn);ExCELL南美胎牛血清：烏拉圭ExCELL公司生產(chǎn);DMEM培養(yǎng)基：美國Gibco公司生產(chǎn);CCK8：日本同仁公司生產(chǎn);MEBO：汕頭市美寶制藥有限公司生產(chǎn)。

1.2?實驗方法

1.2.1?造模

大鼠先給予高糖高脂飲食1月余，禁食16 h后采用腹腔注射STZ 40 mg/kg，1周后大鼠若出現(xiàn)多飲、多尿、體重減輕等一系列糖尿病癥狀且空腹血糖≥16.7 mmol/L，為糖尿病大鼠模型建立成功[1]，需隔日復測血糖，至少2次以上達標方為造模成功，糖尿病大鼠造模成功后，采用腹腔注射7%水合氯醛0.5 mL/100 g麻醉，大鼠麻醉成功后于背部備皮處理行約2.5 cm×2.5 cm大小的類圓形全層皮膚切除，即可完成糖尿病創(chuàng)面大鼠模型的建立，期間注意大鼠血糖情況，需每日定時皮下注射胰島素控制血糖。

1.2.2?成纖維細胞分離、培養(yǎng)及分組

取糖尿病創(chuàng)面大鼠模型的第11天肉芽組織（糖尿病潰瘍修復期），經(jīng)鹽水、PBS液清洗后進行胰酶消化，將消化分離出組織的原代成纖維細胞放置到37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，需隔天進行換液，當培養(yǎng)瓶中細胞鋪滿整個瓶底的80%時再進行傳代，第一次消化傳代后的細胞視為P1代，待細胞傳代至P3代時，胰酶消化細胞后平均分為2組（每組5個樣本）：常規(guī)培養(yǎng)組（對照組）、MEBO組，MEBO為膏狀藥物，需先將其溶解到二甲基亞砜（DMSO）配成原液，再按一定比例加入到培養(yǎng)基中，濃度配成1 g/L使用。

1.2.3?CCK-8法檢測細胞增殖

取對數(shù)期生長的成纖維細胞，以2×104/孔的密度接種于96孔板中，將其放置37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)24 h后，分為對照組、MEBO組，每組設5個復孔。分別培養(yǎng)12、24、48、72、96 h，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，放回細胞孵箱孵育1.5 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長檢測各個孔吸光值（OD），并計算其各時間點增殖率：（A給藥/A對照-1）×100%，實驗重復3次。

1.2.4?觀察MEBO對成纖維細胞遷移的影響

將成纖維細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，分為對照組、MEBO組，使用200 μL移液槍槍頭直接在中部劃直線，并做好標記以確定相對位置。然后于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，分別于0、24 h時測量并記錄空白區(qū)，采用Image Pro Plus 6.0軟件按以下公式計算細胞遷移率：（0 h空白區(qū)-24 h空白區(qū)）/0 h空白區(qū)×100%。

1.3?統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示;兩組比較采用兩樣本t檢驗;各時點間比較采用單因素方差分析（ANOVA）進行檢驗。檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2?結?果

2.1?MEBO對成纖維細胞增殖的影響

與對照組比較，MEBO組12 h、24 h的OD值雖高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而48 h、72 h、96 h均高于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或0.001）;各時間點比較中，對照組、MEBO組的12 h與24 h間無統(tǒng)計學意義（P>0.05），MEBO組中的48 h與96 h間無統(tǒng)計學意義（P>0.05），MEBO組72 h與96 h間有統(tǒng)計學意義（P<0.001），72 h的增殖率為最高值。見表1。

2.2?MEBO對成纖維細胞遷移的影響

細胞遷移24 h時，對照組與MEBO組細胞遷移率分別為（19.27%±1.95%）、（33.91%±3.68%），MEBO組的遷移率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.860，P<0.01）。見圖1。

3?討?論

2型糖尿病是由胰島素抵抗引起的高血糖代謝紊亂疾病，其患病率、復發(fā)率及死亡率在我國仍逐漸上升[2～3]，但隨著醫(yī)療條件及科技進步，糖尿病慢性創(chuàng)面導致的截肢率有所下降[4]，糖尿病慢性創(chuàng)面為糖尿病的常見并發(fā)癥。因此，提高糖尿病慢性創(chuàng)面愈合率極為重要，但是目前我們對糖尿病慢性創(chuàng)面的病理和傷口的血管生成反應的了解并不全面，除了加強血糖控制以外，促進創(chuàng)面周圍血管生成、改善血管微循環(huán)、高壓氧療、手術介入等治療手段均有助于慢性創(chuàng)面的愈合[5]，因此，多學科治療糖尿病慢性創(chuàng)面是目前中國現(xiàn)有醫(yī)療條件最理想的治療模式。糖尿病足為糖尿病慢性創(chuàng)面最常見的一種疾病，有研究指出，在治療難治性糖尿病足過程中，多模式循環(huán)加壓局部傷口供氧家庭護理療法優(yōu)于一般標準護理療法[6]。

纖維細胞為結締組織中的一種細胞，在創(chuàng)面愈合的過程中，特別是增殖期，纖維細胞可轉化為活躍的成纖維細胞。創(chuàng)面修復是一個復雜而又精細的過程，大致可分為凝血期、炎癥期、增殖期和重塑期四個時期，其中包含了血小板、單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、內皮細胞、成纖維細胞、角質細胞等[7]，而成纖維細胞的增殖和遷移能促進新生細胞外基質以及肉芽組織來達到創(chuàng)面修復[8～9]。TEPLICKI等人[10]發(fā)現(xiàn)民間常用于治療皮膚輕微燒傷或者傷口的植物蘆薈，可通過刺激成纖維細胞和角質細胞的增殖、遷移，從而達到加速創(chuàng)面愈合。

MEBO為目前燒傷或慢性創(chuàng)面治療的一種常用藥物，該藥物通過濕潤暴露、祛腐生肌、活血化瘀等傳統(tǒng)的中醫(yī)理念來使上皮組織、肌肉、神經(jīng)組織快速修復達到治療目的，縮短創(chuàng)面愈合時間。前期課題組已證明通過外用MEBO可使糖尿病大鼠創(chuàng)面中的成纖維細胞增殖，加速創(chuàng)面愈合。因此，本研究通過體外培養(yǎng)糖尿病大鼠成纖維細胞，在培養(yǎng)基中加入MEBO，觀察細胞生長情況。從CCK-8實驗可知，在不同的時間點加入MEBO的成纖維細胞數(shù)量增多，其增殖率也升高，特別是在48 h以后差異有統(tǒng)計學意義，在72 h達到最高，之后降低。在劃痕實驗中，含有MEBO的成纖維細胞的遷移能力比對照組強。

本實驗的研究結果顯示，MEBO可促進糖尿病大鼠慢性創(chuàng)面成纖維細胞增殖，且使細胞遷移能力增強，對加速糖尿病大鼠慢性創(chuàng)面的愈合起到重要作用，但目前影響成纖維細胞增殖的機制未能完全闡明，需進行下一步分子實驗研究。

參?考?文?獻

[1]?劉亞洋. Apelin-13對糖尿病心肌缺血/再灌注損傷保護作用及相關機制的實驗研究[D]. 北京：北京協(xié)和醫(yī)學院，2019.

[2]?WANG L M， GAO P， ZHANG M， et al. Prevalence and ethnic pattern of diabetes and prediabetes in China in 2013[J]. JAMA， 2017， 317（24）： 2515-2523.

[3]?JIANG Y， WANG X， XIA L， et al. A cohort study of diabetic patients and diabetic foot ulceration patients in China[J]. Wound Repair Regen， 2015， 23（2）： 222-230.

[4]?XU Z R， RAN X W. Diabetic foot care in China：challenges and strategy[J]. Lancet Diabetes Endocrinol， 2016， 4（4）： 297-298.

[5]?OKONKWO U， DIPIETRO L. Diabetes and wound angiogenesis[J]. Int J Mol Sci， 2017， 18（7）： 1419.

[6]?FRYKBERG R G， FRANKS P J， EDMONDS M， et al. A Multinational， Multicenter， Randomized， Double-Blinded， Placebo-Controlled Trial to Evaluate the Efficacy of Cyclical Topical Wound Oxygen （TWO2） Therapy in the Treatment of Chronic Diabetic Foot Ulcers： The TWO2 Study[J]. Diabetes care， 2020， 43（3）： 616-624.

[7]?EMING S A， WYNN T A， MARTIN P. Inflammation and metabolism in tissue repair and regeneration[J]. Science，2017， 356（6342）：1026-1030.

[8]?DRISKELL R R， LICHTENBERGER B M， HOSTE E， et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair[J]. Nature， 2013， 504（7479）： 277-281.

[9]?LYNCH M D， WATT F M. Fibroblast heterogeneity：implications for human disease[J]. J Clin Invest， 2018，128（1）：26-35.

[10]?TEPLICKI E， MA Q L， CASTILLO D E， et al. The Effects of Aloe vera on Wound Healing in Cell Proliferation， Migration， and Viability[J]. Wounds， 2018， 30（9）： 263-268.

（收稿日期：2020-08-20?修回日期：2020-10-26）

（編輯：潘明志）