常 亮，徐 璐，賈 妍，劉素云，李擁軍

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院心內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

心肌細胞肥大所致心肌肥厚是冠心病、瓣膜癥和高血壓等心臟疾病患者心臟結構不可逆性改變和心臟功能向失代償期演變的關鍵階段，是心力衰竭的主要病理基礎[1,2]。心肌肥厚的分子病理機制極為復雜，對于引起心肌肥厚發(fā)生的信號轉導通路仍然缺乏了解。內(nèi)脂素屬于脂肪細胞因子家族成員，在內(nèi)臟脂肪細胞中高表達，具有煙酰胺磷酸核糖轉移酶活性，在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的合成過程中發(fā)揮重要作用[3,4]。前期研究結果顯示內(nèi)脂素能夠誘導心肌細胞肥大的發(fā)生[5]。但是對于內(nèi)脂素誘導產(chǎn)生心肌細胞肥大的分子機制仍然缺乏了解，需要進一步深入探究。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)信號通路的下游靶蛋白包括絲氨酸-蘇氨酸激酶(serine-threonine kinase,AKT)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2 (extracellular signal regulated kinase1/2 ,ERK1/2)和信號轉導與轉錄激活因子3(signal transduction and transcriptional activator 3, STAT3)，EGFR通路參與細胞增殖、分裂和周期調(diào)控等過程[6]，與心肌病和心血管損傷等心血管疾病的發(fā)生密切相關[7,8]。本研究觀察內(nèi)脂素對大鼠心肌細胞肥大的影響，并對EGFR信號通路在其中的作用進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 動物

60只無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級Wistar雄性大鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物科技有限公司，鼠齡均為6周，體重(158.27±13.64)g。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25℃，相對濕度51%～54%。所有大鼠需在SPF動物中心飼養(yǎng)1周，使大鼠適應SPF動物中心的飼養(yǎng)條件以及環(huán)境。隨機分為對照組、內(nèi)脂素組和內(nèi)脂素+AG1478組，20只/組。對照組：按照3 mL·kg-1·d-1腹腔注射生理鹽水，周期為7 d。內(nèi)脂素組：按照3 mL·kg-1·d-1腹腔注射0.5 g/mL內(nèi)脂素，周期為7 d。內(nèi)脂素+AG1478組：按照3 mL·kg-1·d-1腹腔注射0.5 mg/mL內(nèi)脂素與10 ng/mLAG1478混合液，周期為7 d。大鼠處理過程經(jīng)過動物倫理委員會審核。

1.2 試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號：SH30022.01B)和胎牛血清(貨號：30070.03)均購自美國Hyclone生物科技有限公司。心鈉素(atriopeptin,ANP)(貨號：ab5993)、磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(貨號：ab181602)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)(貨號ab243440)、EGFR(貨號：ab52894)、磷酸化-絲氨酸-蘇氨酸激酶(phosphorylated-serine-threonine kinase,p-AKT)(貨號：ab38449)、磷酸化-細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(phosphorylated-extracellular signal regulated kinase1/2,p-ERK1/2)(貨號：ab176640)和磷酸化-信號轉導與轉錄激活因子3(phosphorylated-signal transduction and transcriptional activator 3,p-STAT3)(貨號：ab76315)抗體均購自美國Abcam生物科技有限公司。EGFR抑制劑AG1478(貨號：153436-53-4)購自美國Sigma生物科技有限公司。

1.3 儀器

化學發(fā)光凝膠成像儀(型號：ImageQuant Las4000)購自美國GE科技有限公司。垂直電泳槽(型號：Protean 165-8001)購自美國伯樂科技有限公司。高速冷凍離心機(型號：JIDI-16R)購自廣州吉迪儀器有限公司。

1.4 指標檢測

大鼠藥物處理完成后立即處死，分離心臟后稱重，分離左心室后稱重，心臟重量指數(shù)=心臟重量/大鼠體重，左心室重量指數(shù)=左心室重量/大鼠體重[9]。使用PBS緩沖液沖洗心臟，切除心尖，用眼科剪將組織剪碎至0.5 mm3左右大小并置于10 cm培養(yǎng)皿中，加入5 mL的0.25%胰酶并置于37℃中消化10 min，將上清液收集至50 mL離心管中，此操作重復3次。30 mL上清液中加入20 mL的DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)終止消化，5 000 r/min離心5 min，離心半徑12 cm，棄去上清液，使用10 mL的DMEM高糖培養(yǎng)基(含20%胎牛血清)重懸沉淀并轉移至T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)2 h。差速貼壁法分離心肌細胞，接種于另一TT25培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后心肌細胞貼壁完全，將培養(yǎng)基吸盡，加入PBS緩沖液沖洗細胞2次，加入0.25%胰酶1 mL消化心肌細胞。3 min后加入DMEM高糖培養(yǎng)基(含20%胎牛血清)2 mL終止消化，細胞吹打混勻后收集至15 mL離心管中，5 000 r/min離心5 min，離心半徑12 cm，棄去上清液，使用DMEM高糖培養(yǎng)基(含20%胎牛血清)5 mL重懸心肌細胞，將細胞懸液滴加于載玻片上于倒置顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取4個視野，每個視野中選取10個細胞測量直徑，并根據(jù)直徑計算細胞體積。收集1×105個細胞，5 000 r/min離心5 min，離心半徑12 cm，棄去上清液，加入200 μL細胞裂解液，采用考馬斯亮藍染色法檢測每組心肌細胞的總蛋白含量。

1.5 蛋白免疫印跡(western blotting)檢測蛋白表達量

收集1×106個心肌細胞，1 000 r/min離心后將上清液棄去，沉淀中加入細胞裂解液200 μL并用槍頭反復吹打直至將沉淀完全重懸。4℃裂解30 min后，4℃，10 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至另一干凈EP管中。通過BCA蛋白定量試劑盒檢測細胞裂解液中蛋白濃度。進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，每孔蛋白上樣量為10 μg，120 V電泳50 min后通過濕轉法將蛋白轉至聚偏氟乙烯 (polyvinylidene fluoride membrane,PVDF)膜上。將PVDF膜取出并浸泡于5%脫脂奶粉中封閉1 h，使用PBS-吐溫20洗滌劑(PBS-tween20，PBST)沖洗PVDF膜3次，10 min/次。Anti-ANP、Anti-BNP、Anti-EGFR和anti-GAPDH按1∶500比例稀釋、anti-p-AKT、anti-p-ERK1/2和anti-p-STAT3按1∶100比例稀釋，稀釋液為3%BSA。將各蛋白所處位置處的PVDF膜裁下并浸泡于對應蛋白的一抗溶液中，4℃孵育過夜。PBST沖洗3次，10 min/次。加入二抗溶液室溫孵育30 min，孵育結束后用PBST沖洗3次，10 min/次，化學發(fā)光檢測蛋白表達情況。以蛋白條帶的灰度值作為蛋白的蛋白表達量，目標蛋白相對表達量=目標蛋白表達量/GAPDH蛋白表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 內(nèi)脂素對大鼠心臟重量指數(shù)和左心室重量指數(shù)的影響

內(nèi)脂素組心臟重量指數(shù)和左心室重量指數(shù)均明顯高于對照組，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 內(nèi)脂素對大鼠心臟重量指數(shù)和左心室重量指數(shù)的影響

2.2 內(nèi)脂素對大鼠心肌細胞肥大的影響

內(nèi)脂素組心肌細胞體積、蛋白含量、ANP和BNP蛋白相對表達量均明顯高于對照組，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。Western blot結果見圖1。

表2 內(nèi)脂素對大鼠心肌細胞體積、蛋白含量、ANP和BNP蛋白相對表達量的影響

圖1 內(nèi)脂素對大鼠心肌細胞ANP和BNP表達的影響

2.3 內(nèi)脂素對大鼠心肌細胞中EGFR信號通路的影響

內(nèi)脂素組心肌細胞中EGFR、p-AKT、p-ERK1/2和p-STAT3蛋白相對表達量均明顯高于對照組和內(nèi)脂素+AG1478組，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而對照組和內(nèi)脂素+AG1478組心肌細胞EGFR、p-AKT、p-ERK1/2和p-STAT3蛋白相對表達量比較，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。Western blot結果見圖2。

表3 內(nèi)脂素對大鼠心肌細胞中EGFR信號通路的影響

圖2 內(nèi)脂素對大鼠心肌細胞中EGFR信號通路的影響

2.4 EGFR信號通路介導了內(nèi)脂素誘導的大鼠心肌細胞肥大改變

內(nèi)脂素組心肌細胞中ANP和BNP蛋白相對表達量均明顯高于對照組和內(nèi)脂素+AG1478組，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而對照組和內(nèi)脂素+AG1478組心肌細胞ANP和BNP蛋白相對表達量比較，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。Western blot結果見圖3。

表4 各組心肌細胞ANP和BNP蛋白相對表達量比較

圖3 各組心肌細胞ANP和BNP蛋白相對表達量比較

3 討論

心肌肥厚是心力衰竭的前期病變，是猝死、腦卒中和冠心病等心腦血管疾病發(fā)生的獨立危險因素[10-12]。脂肪細胞因子主要包括內(nèi)脂素、脂聯(lián)素和瘦素等，由內(nèi)臟脂肪細胞分泌產(chǎn)生，與心肌肥厚的發(fā)生密切相關[13,14]。對內(nèi)脂素在心肌細胞肥大過程中的調(diào)節(jié)機制進行深入探究，并且從中尋找與心肌細胞肥大密切相關的標志物分子，有利于心肌肥厚的診斷和治療。

本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)脂素處理大鼠后出現(xiàn)明顯的心肌細胞肥大表型，分析其原因可能是由于內(nèi)脂素水平異常會引起心肌細胞產(chǎn)生氧化應激。Carbone等[15]的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)脂素具有煙酰胺磷酸核糖轉移酶活性，能夠調(diào)節(jié)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的生物學合成。由于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸參與線粒體呼吸電子傳遞鏈中的電子傳遞，并且是重要的質(zhì)子和電子受體。因此內(nèi)脂素水平異常會引起煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成異常，使得電子呼吸傳遞鏈紊亂，導致大量超氧離子和過氧離子等氧自由基的形成，形成氧化應激反應。氧化應激過程中形成的氧自由基與心肌細胞內(nèi)的代謝酶結合造成代謝酶類蛋白質(zhì)空間結構破壞并抑制其活性，使得心肌細胞的糖代謝和脂質(zhì)代謝紊亂，最終引起心肌細胞肥大的發(fā)生[16]。Behrends等[17]的研究發(fā)現(xiàn)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸是糖酵解過程中的關鍵質(zhì)子受體，糖酵解過程中產(chǎn)生的質(zhì)子能夠與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結合形成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，其具有較強的還原性，將質(zhì)子傳遞至乙酰輔酶A的同時釋放大量三磷酸腺苷。糖酵解代謝過程中產(chǎn)生的三磷酸腺苷能夠為細胞中微絲的組裝提供大量能量，微管蛋白經(jīng)三磷酸腺苷磷酸化后形成二聚體并進一步組裝成微絲，因此內(nèi)脂素水平升高會促進心肌細胞產(chǎn)生大量三磷酸腺苷，使得微管蛋白大量組裝成微絲結構，微絲大量合成使得心肌細胞發(fā)生極化，最終引起心肌細胞出現(xiàn)肥大表型[18]。

進一步研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)脂素能夠激活心肌細胞中的EGFR信號通路，并且EGFR信號通路介導了內(nèi)脂素誘導的大鼠心肌細胞肥大改變。分析其原因可能是由于EGFR信號通路參與細胞周期調(diào)控。Kenigsberg等[19]的研究發(fā)現(xiàn)EGFR信號通路參與細胞周期調(diào)控。細胞周期發(fā)展至有絲分裂中期會形成紡錘絲，此階段微絲大量形成，使得細胞體積增大。因此內(nèi)脂素水平升高會導致EGFR信號通路的異?；罨?，導致細胞周期阻滯的發(fā)生。心肌細胞周期停滯在中期，微絲大量組裝，導致心肌細胞體積增大而出現(xiàn)心肌細胞肥大表型[20]。同時，Darabi等[21]的研究發(fā)現(xiàn)白介素和腫瘤壞死因子等炎癥因子是EGFR信號通路的下游靶基因。因此內(nèi)脂素作用于心肌細胞并激活EGFR信號通路后能夠誘導白介素和腫瘤壞死因子等炎癥因子的表達，進而促進心肌細胞局部炎癥反應的形成。炎癥因子作用于心肌細胞后引起心肌細胞代謝紊亂，最終導致心肌細胞肥大的形成[22]。

綜上所述，內(nèi)脂素誘導大鼠心肌細胞出現(xiàn)肥大表型，而EGFR信號通路介導了內(nèi)脂素誘導的大鼠心肌細胞肥大改變，EGFR抑制劑AG1478能夠抑制內(nèi)脂素誘導的心肌細胞肥大，在心肌細胞肥大的治療中具有一定臨床意義。