牛彤旭，王 張，寶魯日，孫 微，師永紅1,

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；2.赤峰學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)在調(diào)節(jié)腫瘤新血管形成及腫瘤細(xì)胞生物學(xué)能力中具有重要作用。HIF-1的活性主要由HIF-1α 亞基決定，該亞基受細(xì)胞內(nèi)氧氣濃度的調(diào)節(jié)，在缺氧環(huán)境下HIF-1α 進(jìn)入胞核，與HIF-1β結(jié)合進(jìn)而誘導(dǎo)多種靶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)血管生成和增加腫瘤細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的耐受和惡性演進(jìn)[1]。利用siRNA靶向干擾HIF-1α抑制了細(xì)胞的生長和侵襲，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡[2,3]。泛素-蛋白酶水解系統(tǒng)是HIF-1α 的主要降解途徑，泛素羧基末端水解酶-3(Ubiquitin C-terminal hydrolases L3，UCH-L3)屬于去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)家族成員之一，調(diào)控泛素-蛋白酶體降解[4]。本課題組前期蛋白學(xué)組研究發(fā)現(xiàn)UCH-L3是MDA-MB-231細(xì)胞HIF-1α 的靶蛋白，受HIF-1α 的負(fù)性調(diào)控；UCH-L3不僅能促進(jìn)HIF-1α的降解，還能抵消蛋白酶抑制劑(MG231)對(duì)HIF-1α蛋白降解的影響，上調(diào)UCH-L3削弱了MDA-MB-231細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[5]。然而關(guān)于兩種蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性卻未見報(bào)道。因此，本研究擬從組織學(xué)水平檢測(cè)UCH-L3和HIF-1α 在乳腺癌組織、癌旁乳腺組織和良性病變組織中的表達(dá)，分析與乳腺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系以及兩者之間的相關(guān)性，從組織學(xué)層面驗(yàn)證兩種蛋白在人體乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中的可能作用，為乳腺癌提供可能的治療依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)病理科2016年1月1日～2017年12月31日收治的經(jīng)病理證實(shí)的乳腺癌女性患者99例，年齡30～85歲，中位數(shù)55歲。納入標(biāo)準(zhǔn): 均行手術(shù)治療; 術(shù)前未行抗腫瘤治療; 具有完整的臨床病理資料。其中83例可用我國常見惡性腫瘤診治規(guī)范的乳腺癌分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)，I級(jí)12例，Ⅱ級(jí)47例，Ⅲ級(jí)24例。99例乳腺癌組織中選取38例，將乳腺癌組織及其周圍距離腫瘤小于3 cm的癌旁非腫瘤乳腺組織進(jìn)行對(duì)比，另選取29例乳腺良性病變(包括纖維腺瘤、腺病、導(dǎo)管普通型增生和導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤)患者作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)符合內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科研倫理審批。

1.2 實(shí)驗(yàn)抗體與方法

Anti-UCHL3兔單克隆抗體(EPR5332)購置于abcam公司，HIF-1α抗體試劑(ZA-0552)購置于中杉金橋公司，采用免疫組織化學(xué)染色法(MaxVesion法)。制作厚度為4 μm的組織切片。UCH-L3兔單克隆抗體按1∶300稀釋，HIF-1α為即用型抗體使用羅氏公司的Benchmark XT自動(dòng)免疫組織化學(xué)儀進(jìn)行染色。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判讀

雙盲條件下由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立打分。本次實(shí)驗(yàn)中UCH-L3表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，而HIF-1α 有兩種表達(dá)形式，一種為細(xì)胞核表達(dá)，另一種為細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。免疫組化染色按如下標(biāo)準(zhǔn)分為：UCH-L3和HIF-1α 胞質(zhì)染色強(qiáng)度0分為細(xì)胞未著色、1分為淺黃色、2分為棕黃色、3分為棕色、4分為黑褐色；HIF-1α 胞核染色強(qiáng)度0分為未著色、1分為淺棕色、2分為棕色、3分為棕黑色；染色比例為陽性腫瘤細(xì)胞量占腫瘤總細(xì)胞量的百分比；最后綜合分?jǐn)?shù)=染色強(qiáng)度*染色比例(%)。根據(jù)綜合分?jǐn)?shù)分為：0分為“陰性”；>0分為陽性，其中包括0.01～0.99分為“”，1～1.99分為“”，2～2.99分為“”，≥3分為“”。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法，等級(jí)資料比較采用Spearman相關(guān)分析、Mann-WhitneyU檢驗(yàn)和Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 UCH-L3、HIF-1α 在乳腺癌、癌旁乳腺組織及良性病變組織中的表達(dá)

UCH-L3在乳腺癌組織、癌旁乳腺組織和良性病變組織中的陽性表達(dá)率分別為84.8%、100.0%和93.1%，乳腺癌組織UCH-L3陽性表達(dá)率低于癌旁乳腺組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)，見表1；經(jīng)過組間兩兩對(duì)比，癌旁乳腺組織陽性表達(dá)率高于乳腺癌組織。乳腺癌組織UCH-L3的表達(dá)強(qiáng)度也弱于癌旁乳腺組織和良性病變組織中(P=0.000和P=0.035)，見圖1、2和表2。本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α染色結(jié)果具有兩種表達(dá)形式，一種為細(xì)胞核表達(dá)；另一種為細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。HIF-1α胞核陽性表達(dá)率在乳腺癌細(xì)胞、癌旁乳腺組織細(xì)胞和良性病變組織分別為69.7%、10.5%和10.3%，乳腺癌細(xì)胞HIF-1α胞核陽性表達(dá)率高于癌旁乳腺組織和良性病變組織(P=0.000)，見圖3和表1。同樣，HIF-1α 細(xì)胞質(zhì)陽性表達(dá)率在乳腺癌組織、癌旁乳腺組織和良性病變組織分別為90.9%、52.6%和79.3%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，見表1，經(jīng)過組間兩兩比較，乳腺癌組織HIF-1α胞質(zhì)陽性表達(dá)率高于癌旁乳腺組織。

表1 乳腺癌、癌旁乳腺組織和良性病變組織中UCH-L3、胞核HIF-1α 和胞質(zhì)HIF-1α 陽性表達(dá)率的比較

A：乳腺癌組織呈中等陽性表達(dá)；B：癌旁乳腺組織呈強(qiáng)陽性表達(dá)；C：良性病變組織呈強(qiáng)陽性表達(dá)。

圖2 UCH-L3在乳腺癌組織呈不同強(qiáng)度表達(dá)(IHC 400×)Fig 2 UCH-L3 showed different intensity expression in breast cancer tissues(IHC 400×)

A：乳腺癌組織胞核強(qiáng)陽性，胞質(zhì)呈中等陽性；B：基底樣型乳腺癌組織胞核中強(qiáng)表達(dá)，胞質(zhì)陰性表達(dá)；C：癌旁乳腺組織中呈陰性表達(dá)；D：良性病變組織胞質(zhì)弱陽性。

表2 乳腺癌與癌旁乳腺組織和良性病變組織中UCH-L3表達(dá)強(qiáng)度的比較

2.2 UCH-L3、HIF-1α表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

UCH-L3陽性表達(dá)率在Luminal 分型中的 A型乳腺癌(100.0%)中明顯高于基底樣細(xì)胞型乳腺癌(73.3%)(P=0.037)；組織學(xué)分級(jí)為I級(jí)乳腺癌(100.0%)的UCH-L3陽性表達(dá)率高于Ⅲ級(jí)(79.2%)。UCH-L3表達(dá)率與年齡、pT、pN、病理分型的差異無關(guān)(P>0.05)，見表3。乳腺癌UCH-L3的表達(dá)強(qiáng)度與雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)呈正相關(guān)(r=0.258，P=0.010和r=0.292，P=0.003)，與人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)、Ki-67無相關(guān)性(P>0.05)。HIF-1α胞核陽性表達(dá)率以Luminal 分型中的HER2過表達(dá)型(100.0%)和基底細(xì)胞樣型乳腺癌(90.0%)高于Luminal A和B型(P=0.000)，見表3。HIF-1α胞核表達(dá)強(qiáng)度在乳腺癌與ER、PR呈負(fù)相關(guān)(r=-0.525，P=0.000和r=-0.438，P=0.000)，與Ki-67和組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)(r=0.390，P=0.000和r=0.367，P=0.001)。與之相反，HIF-1α胞質(zhì)陽性表達(dá)率卻在Luminal分型中以基底細(xì)胞樣型表達(dá)率最低(73.3%)(P=0.003)，見表3。而且，HIF-1α胞質(zhì)表達(dá)強(qiáng)度與ER、PR呈正相關(guān)(r=0.299，P=0.003和r=0.359，P=0.000)；與Ki-67、組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.257，P=0.005和r=-0.281，P=0.010)。HIF-1α胞核表達(dá)和胞質(zhì)表達(dá)率在各年齡組、pT組、pN組、病理分型均無顯著差別(P>0.05)，見表3。

表3 UCH-L3、胞核HIF-1α 和胞質(zhì)Hif-1α陽性表達(dá)率與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 UCH-L3和HIF-1α 之間的關(guān)系

Spearman相關(guān)分析顯示，UCH-L3僅與HIF-1α 胞質(zhì)表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)(r=0.226，P=0.008)。

3 討論

泛素是一種76個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，在真核生物中廣泛分布并高度保守。泛素化與翻譯后調(diào)控有關(guān)，即蛋白質(zhì)經(jīng)過泛素偶聯(lián)，然后通過蛋白水解酶系統(tǒng)降解。泛素結(jié)合通過改變靶蛋白的穩(wěn)定性、定位和/或活性及其動(dòng)力學(xué)來調(diào)節(jié)靶蛋白的細(xì)胞內(nèi)活性。然而，泛素化可以被DUBs逆轉(zhuǎn)，該酶又分為UCHs和泛素特異性加工蛋白酶(ubiquitin specific processing proteases，USPs)[6]。UCH-L3通過水解與靶蛋白連接的泛素鏈，使泛素游離出來，進(jìn)而達(dá)到調(diào)控靶蛋白降解的作用[7]，參與增殖、分化、凋亡[8]和EMT[9]以及預(yù)后[10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)UCH-L3在乳腺癌組織表達(dá)明顯低于癌旁乳腺組織或良性病變組織；Luminal分型中的基底細(xì)胞樣亞型低于Luminal A型，并與ER、PR呈正相關(guān)。與本課題組前期體外研究結(jié)果相符，即通過病毒表達(dá)載體上調(diào)乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞系MBA-MB-231的UCH-L3蛋白水平，能夠抑制細(xì)胞的增殖和生長、遷移、侵襲以及克隆形成能力[5]。這些提示UCH-L3表達(dá)的丟失或降低在乳腺癌的發(fā)生和演進(jìn)中的確發(fā)揮作用。有研究也顯示，高度轉(zhuǎn)移性前列腺癌PC3細(xì)胞UCH-L3表達(dá)水平降低，非轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞則表達(dá)上調(diào)，增加PC3前列腺癌細(xì)胞UCH-L3的表達(dá)，癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力下降[12]。

HIF-1α 是具有氧依賴性特點(diǎn)的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[13]。在缺氧條件下，HIF-1α 大量積累于細(xì)胞質(zhì)中，繼而轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，形成HIF復(fù)合物，誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)血管生成，改善腫瘤缺氧，增強(qiáng)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[14-16]。在正常氧濃度條件下，HIF-1α 與VHL腫瘤抑制蛋白結(jié)合，導(dǎo)致HIF-1α 的泛素化和蛋白酶體的降解[1]。本研究在組織學(xué)水平上發(fā)現(xiàn)HIF-1α 有細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)兩種表達(dá)模式，即細(xì)胞核表達(dá)和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)；胞核和胞質(zhì)HIF-1α 在乳腺癌組織的陽性表達(dá)率高于癌旁乳腺組織或良性病變組織；然而HIF-1α 的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)模式與乳腺癌臨床特征之間的關(guān)系相反，如乳腺癌胞核HIF-1α 陽性表達(dá)增加多見于Ki-67高表達(dá)、HER2過表達(dá)亞型和基底樣乳腺癌亞型，細(xì)胞核表達(dá)強(qiáng)度又與ER、PR呈負(fù)相關(guān)，與Ki67和組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)；相反，細(xì)胞質(zhì)HIF-1α 表達(dá)基底樣型乳腺癌中的陽性表達(dá)率明顯最低，HIF-1α 胞質(zhì)表達(dá)強(qiáng)度又與組織學(xué)分級(jí)和Ki-67呈負(fù)相關(guān)，與ER和PR表達(dá)正相關(guān)。是否細(xì)胞質(zhì)HIF-1α 高表達(dá)與其向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)受抑制有關(guān)，其機(jī)制尚不清楚。由此可見乳腺癌細(xì)胞核HIF-1α 的表達(dá)預(yù)示著乳腺癌具有更高惡性程度。這與本課題組在乳腺癌細(xì)胞系研究結(jié)果一致，即降低MDA-MB-231細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用[17]，因此HIF-1α 的過表達(dá)可能在乳腺癌變和演進(jìn)過程中發(fā)揮作用，HIF-1α 從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入胞核預(yù)示腫瘤的惡性演進(jìn)。亦有研究表明許多癌組織和轉(zhuǎn)移灶中均有 HIF-1α 的過表達(dá)，HIF-1α 陽性表達(dá)的甲狀腺髓樣癌患者，5年總生存率明顯降低[18]。與肝細(xì)胞癌組織HIF-1α 過表達(dá)與低存活率，高復(fù)發(fā)率和淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移率相關(guān)[19]。

本課題組前期研究采用雙向凝膠電泳結(jié)合飛行質(zhì)譜技術(shù)對(duì)siRNA干擾HIF-1α后的MDA-MB-231細(xì)胞中HIF-1的靶蛋白進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，與未經(jīng)siRNA干擾的細(xì)胞相比，蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)到19種下調(diào)蛋白和2種上調(diào)蛋白，其中的大多數(shù)曾被報(bào)道為HIF-1的靶蛋白，并首次確定UCH-L3是HIF-1上調(diào)的兩種差異蛋白之一，這意味著UCH-L3可能是HIF-1的一個(gè)新的直接或間接靶點(diǎn)；通過慢病毒轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)上調(diào)UCH-L3降低了MDA-MB-231細(xì)胞中游離和泛素結(jié)合HIF-1α的表達(dá)，并抑制其細(xì)胞的生長和克隆性，削弱了細(xì)胞的遷移和侵襲能力等惡性生物學(xué)行為；UCH-L3不僅能促進(jìn)泛素從多泛素HIF-1α中分離，進(jìn)而促進(jìn)HIF-1α的降解，而且能抵消蛋白酶抑制劑(MG231)對(duì)MDAMB-231細(xì)胞HIF-1α蛋白降解的影響[5]。而UCH-L3慢病毒過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的雌孕激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞，卻表現(xiàn)出HIF-1α 蛋白水平的升高和惡性生物學(xué)行為能力的提高。本次試驗(yàn)從組織學(xué)水平上分析了UCH-L3與HIF-1α 的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)UCH-L3表達(dá)在基底樣型乳腺癌中降低，與細(xì)胞核HIF-1α 表達(dá)正相反。然而UCH-L3與細(xì)胞質(zhì)HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)，二者均在基底樣亞型最低，可見HIF-1α 由胞質(zhì)向胞核的遷移不單純與其含量增加有關(guān)，UCH-L3對(duì)HIF-1α的調(diào)控也因乳腺癌的不同分子分型而異。綜上所述，UCH-L3和HIF-1α 對(duì)乳腺癌預(yù)后的評(píng)估具有一定的價(jià)值。提高UCH-L3的表達(dá)和阻止HIF-1α 由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的遷移可為乳腺癌的防治，特別是基底樣型乳腺癌提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。