陳 銘，林志華，徐 嫻，何 琳

(1.浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波 315100；2.浙江萬里學(xué)院 寧海海洋生物種業(yè)研究院，寧波 315100；3.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，寧波 315100)

縊蟶(Sinonovaulaconstricta)為廣溫廣鹽性雙殼類軟體動(dòng)物，棲息于潮間帶的沙泥中，廣泛分布于我國的沿海地區(qū)，是我國傳統(tǒng)四大養(yǎng)殖貝類之一，我國的養(yǎng)殖歷史已有數(shù)百年。夏季高溫、臺風(fēng)暴雨等天氣環(huán)境的影響使得灘涂水域環(huán)境溫度和鹽度變化劇烈。近岸潮間帶的海洋生物需要通過調(diào)節(jié)離子濃度以及保證機(jī)體內(nèi)的水分和鹽類的代謝處于穩(wěn)定狀態(tài)來保持穩(wěn)定的滲透壓[1-2]。

本文探討5種鹽度對縊蟶血液Na+、K+和Cl-離子含量的影響，確定鹽度突變過程中縊蟶生理生化方面的變化特征；并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，檢測CA基因在縊蟶不同組織以及不同濃度鹽度脅迫的表達(dá)分析，探索CA基因在縊蟶急性鹽度脅迫過程中的作用，為縊蟶在適應(yīng)鹽度環(huán)境變化的分子生理機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用縊蟶為浙江省寧波市本地群體，去除其表面附著物，挑選規(guī)格均勻，體色正常，體質(zhì)健康的個(gè)體，個(gè)體質(zhì)量為(10.4±1.4)g。實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)在循環(huán)養(yǎng)殖水族箱中7 d，海水鹽度為20，溫度為20 ℃，pH 8.1，連續(xù)充氣，每日換水1次，換水量為1/2，并投喂適量的金藻，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。

1.2 方法

1.2.1 血液Na+、K+和Cl-濃度的測定

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)5組，分別為對照組(鹽度為20)；低鹽組2組(鹽度為5和15)；高鹽組2組(鹽度為25和35)，每組12個(gè)縊蟶，重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次，實(shí)驗(yàn)前1天停止喂食，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將縊蟶從海水中移至各濃度實(shí)驗(yàn)組中。實(shí)驗(yàn)脅迫后4、8、12、24、48、72和96 h 采集血樣，用1 mL 一次性無菌注射器從閉殼肌抽取血液置于1.5 mL離心管中，3 000 r/min離心5 min，吸取上清液1 mL，與2 mL的雙氧水和5 mL優(yōu)級純的濃硝酸混合，放入微波消解儀，180 ℃消解20 min。將消解過后的液體定容到50 mL的容量瓶(用稀硝酸或者超純水定容)中。電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀檢測Na+和K+。Cl-的檢測按照南京建成試劑盒的說明書操作。

1.2.2CA基因的克隆

縊蟶暫養(yǎng)1周后活體解剖，取其鰓用于cDNA克隆，將鰓放在液氮中速凍后用Trizol提取總RNA，檢測RNA 濃度和A260/A280以及A260/A230值。用SMARTTMRACE DNA AmplicationKit試劑盒(Clontech)合成cDNA第一鏈，作為cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)的模板。參照縊蟶已有轉(zhuǎn)錄組文庫中的CA基因EST片段，用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)3′和5′特異擴(kuò)增引物rCA-F3和rCA-R3，由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)，進(jìn)行CA基因cDNA末端快速擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物切膠回收、連接轉(zhuǎn)化到pEASY-T1載體及DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)12 h，挑選白色單菌落，將陽性克隆進(jìn)行測序。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及其序列

1.2.3CA基因的序列及進(jìn)化分析

利用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行拼接3′和5′-RACE片段序列，得到CA基因cDNA全長；使用ProtParam軟件(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測氨基酸序列以及理化性質(zhì)；ORF Finder軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)預(yù)測CA基因的開放閱讀框；Clustal X軟件對氨基酸多序列進(jìn)行比對；ExPASy軟件推測蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測蛋白質(zhì)功能域；使用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/nph-sw)以及Signal P(http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/nph-sw)分別分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和信號肽區(qū)域；MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4CA基因在縊蟶不同組織以及鹽度脅迫下的鰓mRNA表達(dá)

鹽度脅迫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)5組：鹽度5、15、20、25和35，以鹽度20為正常鹽度對照，每組12個(gè)縊蟶，重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次。取鹽度20的鰓、肝胰腺、閉殼肌、外套膜、中間膜、腎臟、水管和足用于組織表達(dá)分析，實(shí)驗(yàn)脅迫后4、8、12、24、48、72和96 h取各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的鰓用于CA基因表達(dá)分析，將樣品置于液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。Trizol提取總RNA，使用TaKaRa Prime Script RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA，產(chǎn)物于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。引物設(shè)計(jì)參照縊蟶CA基因轉(zhuǎn)錄組文庫EST片段，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物qCA-F4和qCA-R4，使用2×TaqMaster mix試劑以及Light Cycler 480Ⅱ儀進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行比較分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS Statistics 17.0軟件分析，單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，多重比較檢測各測量指標(biāo)的差異，以P< 0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度變化對縊蟶血液離子濃度的影響

隨著鹽度的增加，血液Na+濃度均呈上升狀態(tài)，低鹽度組中，血液Na+濃度均呈現(xiàn)下降趨勢，最終趨于平穩(wěn)；高鹽度組中，血液Na+濃度均呈現(xiàn)上升趨勢，最終趨于平穩(wěn)。在96 h時(shí)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，低鹽組濃度分別降低了70.0%和32.1%，高鹽組濃度分別增加了27.3%和115.0%，見圖1。

圖1 不同鹽度對縊蟶血液Na+離子含量的影響

隨著鹽度的增加，血液K+濃度均呈上升狀態(tài)，低鹽度組中，血液K+濃度均呈下降趨勢，最終趨于平穩(wěn)；高鹽度組中，血液K+濃度均呈上升趨勢，最終趨于平穩(wěn)。在96 h時(shí)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，低鹽組濃度分別降低了70.8%和39.8%，高鹽組濃度分別增加了45.9 %和84.4%，見圖2。

圖2 不同鹽度對縊蟶血液K+離子含量的影響

隨著鹽度的增加，血液Cl-濃度均呈上升狀態(tài)，低鹽度組，血液Cl-濃度均呈現(xiàn)下降趨勢，最終趨于平穩(wěn)；高鹽度組，血液Cl-濃度均呈上升趨勢，最終趨于平穩(wěn)。在96 h時(shí)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，低鹽組濃度分別降低了54.9%和18.2%，高鹽組濃度分別增加了19.7%和53.8%，見圖3。

圖3 不同鹽度對縊蟶血液Cl-離子含量的影響

陰影代表poly A；加框代表CA基因的起始密碼子和終止子；單下劃線部分代表Carb_anhydrase(18-258aa)；雙劃線部分代表Carb_anhydrase(268-539aa)功能區(qū)；*代表蛋白翻譯結(jié)束

2.2 CA基因的克隆

CA基因cDNA全長2 182 bp，開放閱讀框(ORF)長度1 788 bp，3′非編碼區(qū)(UTR)長度為117 bp，含22 bp的polyA尾，包含終止密碼子TGA，5′非編碼區(qū)(UTR)長度為277 bp。ExPASy軟件推導(dǎo)出ORF編碼575個(gè)氨基酸，包含66個(gè)堿性氨基酸(R, K, H)、74個(gè)酸性氨基酸(D, E)、217個(gè)疏水性氨基酸(A, V, L, P, I, F, W, M)、218個(gè)親水性氨基酸(G, S, T, C, Y, N, Q)，該蛋白質(zhì)含有很大比例的親水性氨基酸，表現(xiàn)為親水性，該蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為64.94 ku，等電點(diǎn)pI=5.09；TMHMM軟件和SignalP軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)無跨膜區(qū)，但有信號肽(1-15)。Smart軟件進(jìn)行功能域預(yù)測顯示，CA存在2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：Carb_anhydrase(18-258aa)—Carb_anhydrase(268-539aa)。

使用MEGA6.0軟件，對縊蟶和其他10個(gè)物種的氨基酸序列進(jìn)行了序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果顯示：CA基因與太平洋牡蠣(Crassostreagigas，EKC20938.1)，蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis，OWF36341.1)，美洲牡蠣(Crassostreavirginica，XP_022312365.1)雙殼貝類同源性較高；與小鼠(Musmusculus，AAA50291.1)，原雞(Gallusgallus，CAA78681.1)，中華鱉(Pelodiscussinensis，XP_014437230.1)，斑馬魚(Daniorerio，NP_571185.1)，尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus，XP_003456776.1)，南美白對蝦(Penaeusvannamei，ADM87521.1)，中國對蝦(P.chinensis，ASU87567.1)等動(dòng)物的同源性較低。進(jìn)化樹分析表明：縊蟶與軟體動(dòng)物、甲殼類的親緣性較近，與鳥類、哺乳類、魚類、兩棲類等脊椎動(dòng)物的親緣性較遠(yuǎn)，見圖5。

圖5 采用MEGA 6.0軟件NJ法構(gòu)建的進(jìn)化樹

2.3 CA基因在縊蟶不同組織以及鹽度脅迫下鰓mRNA表達(dá)

CA基因在不同組織中的mRNA表達(dá)量結(jié)果顯示，CA基因在縊蟶成體的足、水管、肝胰腺、外套膜、鰓、腎、唇瓣、中間膜中均有表達(dá)，該基因在縊蟶鰓中表達(dá)量相對其他7個(gè)組織最高(P<0.05)，其次是肝胰腺，在足組織中的表達(dá)量最低，見圖6。

圖6 CA基因在縊蟶不同組織中的表達(dá)分析

CA基因在縊蟶不同濃度鹽度脅迫下的mRNA表達(dá)量結(jié)果顯示：在高鹽和低鹽環(huán)境適應(yīng)過程中，CA基因在鰓中的表達(dá)量持續(xù)上升，在24 h達(dá)到峰值，顯著高于鹽度20的對照組(P<0.05)，隨后表達(dá)量顯著下降并逐漸趨于平穩(wěn)。在鹽度5與鹽度35的實(shí)驗(yàn)組中CAmRNA 表達(dá)水平比鹽度15與鹽度25實(shí)驗(yàn)組的變化趨勢更加明顯，見圖7。

圖7 在不同鹽度下鰓中CA基因不同時(shí)間的表達(dá)水平

3 討論與結(jié)論

離子濃度是海洋生物滲透調(diào)節(jié)研究的重要評價(jià)指標(biāo)，海洋生物可以通過離子調(diào)節(jié)適應(yīng)水環(huán)境的變化，當(dāng)環(huán)境脅迫壓力超出自身調(diào)節(jié)的能力則會(huì)引起死亡[21-23]。在高滲環(huán)境中，縊蟶血液滲透壓低于水體滲透壓，機(jī)體被動(dòng)失水，為補(bǔ)償失水，縊蟶開始大量吸收海水并攝入大量NaCl，血清中Na+和Cl-離子迅速升高；在低滲環(huán)境中則反之[24-25]。隨著對水環(huán)境的適應(yīng)，縊蟶進(jìn)入主動(dòng)調(diào)節(jié)階段，體內(nèi)相應(yīng)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶活力提高，調(diào)節(jié)離子濃度至逐漸平穩(wěn)。由此可見，縊蟶具有一定的滲透壓平衡調(diào)節(jié)能力，能適應(yīng)一定范圍內(nèi)的鹽度變化。研究發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，縊蟶血液滲透壓隨鹽度降低而下降至逐漸平穩(wěn)；隨鹽度升高而升高至逐漸平穩(wěn)。在本實(shí)驗(yàn)中，Na+、K+和Cl-離子與血液滲透壓變化呈正相關(guān)關(guān)系，變化趨勢與滲透壓變化趨勢一致，低鹽度組，Na+、K+和Cl-濃度隨鹽度降低而下降直至最后平穩(wěn)；高鹽度組，Na+、K+、Cl-濃度隨鹽度升高而上升直至最后平穩(wěn)，這與日本鰻鱺(Anguillajaponica)、點(diǎn)籃子魚(Siganusguttatas)和尼羅羅非魚鹽度脅迫的研究結(jié)果基本一致[26-27]。

本實(shí)驗(yàn)通過測定縊蟶不同鹽度脅迫時(shí)間的血清離子濃度、CA基因克隆及CA基因表達(dá)量的測定，研究了血液離子在鹽度脅迫下的變化和CA基因的序列特征及其在鹽度適應(yīng)過程中的變化，為血液離子、CA基因在滲透壓調(diào)節(jié)中的作用機(jī)理研究奠定了理論基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：縊蟶能適應(yīng)一定的低鹽與高鹽的海水環(huán)境，在適應(yīng)環(huán)境過程中，可通過鰓來調(diào)節(jié)血液滲透壓和離子濃度。在急性鹽度脅迫下，縊蟶鰓CA基因mRNA表達(dá)量變化，表明了CA在鹽度變化后發(fā)揮了作用。