梁 燕，朱萬嬌，張志蘇，許 紅，張 健

(1.襄陽市中心醫(yī)院/湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，湖北 襄陽 441021;2.荊州職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，湖北 荊州 434020)

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致發(fā)展中國家女性死亡的主要原因[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球?qū)m頸癌患者超過50萬，其中80%的患者來自發(fā)展中國家[3-4]。手術(shù)和放化療仍是治療宮頸癌的主要方法，但二者均不能有效降低宮頸癌的致死率。因此，探究宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、尋找根治宮頸癌的方法是目前的研究熱點(diǎn)。有研究表明，微小型RNA(microRNA，miRNA)在癌癥中的異常表達(dá)及其對下游靶蛋白表達(dá)的調(diào)控在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，既可誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生發(fā)展又能抑制癌癥的惡化[5]。miR-196a是一類具有抑癌和誘導(dǎo)癌癥發(fā)生發(fā)展雙向作用的miRNA。研究顯示，miR-196a在乳腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)狀態(tài)，上調(diào)miR-196a表達(dá)能顯著抑制癌細(xì)胞的侵襲和遷移[6]。而miR-196a在宮頸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，下調(diào)miR-196a表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖[7]。NR6A1是一類生殖細(xì)胞核因子，在胚胎發(fā)育過程中具有重要作用[8]。有研究表明，NR6A1在腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，可能與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并且生物信息預(yù)測表明NR6A1可能是miR-196a的下游靶標(biāo)[9]。但miR-196a能否通過調(diào)控NR6A1的表達(dá)影響宮頸癌的發(fā)生發(fā)展還未見報(bào)道。因此，本研究以宮頸癌Hela細(xì)胞為研究對象，探究miR-196a與NR6A1的靶向關(guān)系及其對宮頸癌Hela細(xì)胞生存和運(yùn)動能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI 1640和胎牛血清購自美國Gibco公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒、熒光素酶報(bào)告試劑盒和Lipofectamine 2000TM均購自美國Invitrogen公司。TRIzol試劑盒、BCA試劑盒和RIPA裂解液購自北京索萊寶生物科技公司。CCK8試劑盒和Annexin V-FITC購自美國ThermoFisher生物公司。GAPDH、NR6A1、Ki-67、MMP-9、Caspase-3和VEGF一抗購自美國CST公司，二抗購自美國Santa Cruz公司。miR-NC、miR-196a inhibitor、mimic-NC、miR-196a mimic和pcDNA- NR6A1均由美國Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 細(xì)胞來源及培養(yǎng)

正常宮頸上皮HcerEpic細(xì)胞和宮頸癌Hela細(xì)胞、CaSki細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。將上述細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，2～3 d傳代1次，細(xì)胞傳代密度為1×104/mL，取第3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 RT-PCR檢測miR-196a和NR6A1 mRNA表達(dá)

用TRIzol試劑盒提取正常宮頸上皮HcerEpic細(xì)胞和宮頸癌Hela細(xì)胞、CaSki細(xì)胞的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)熒光定量試劑盒說明書對cDNA進(jìn)行定量分析，miR-196a以U6為內(nèi)參，NR6A1以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-196a和NR6A1相對表達(dá)水平。反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)所用引物均采用Primer 5進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海生工合成。NR6A1正向引物5’-GGGATGAACCGGAAGGCTATC-3’，NR6A1反向引物5’-GGCTGGTTGCTCTCCGAAG-3’；miR-196a正向引物5’-CCGACGTAGGTAGTTTCATGTT-3’，miR-196a反向引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；U6正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACAR-3’；U6反向引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；GAPDH正向引物5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，GAPDH反向引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCA-3’。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)說明書用Lipofectamine 2000TM將miR-NC、miR-196a inhibitor、陰性對照質(zhì)粒pcDNA、過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-NR6A1、inhibitor +NR6A1轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中，分別命名為NC組、miR-196a inhibitor組、pcDNA組、pcDNA-NR6A1組、inhibitor+NR6A1組。Control組則僅加入Lipofectamine 2000TM。轉(zhuǎn)染6 h后將轉(zhuǎn)染液更換為正常細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行相應(yīng)檢測。

1.5 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

利用生物信息預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測NR6A1 3’UTR序列上miR-196a的結(jié)合位點(diǎn)，用PCR將結(jié)合片段進(jìn)行擴(kuò)增并插入到熒光素酶載體中，構(gòu)建NR6A1野生質(zhì)粒(NR6A1+wt)。隨后利用基因突變技術(shù)將NR6A1 3’UTR與miR-196a的結(jié)合位點(diǎn)突變并克隆到載體中，構(gòu)建NR6A1突變質(zhì)粒(NR6A1+mut)。用miR-196a mimic或其陰性對照mimic-NC聯(lián)合NR6A1野生質(zhì)?；蛲蛔冑|(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，根據(jù)熒光素酶基因報(bào)告試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.6 CCK8檢測細(xì)胞活性

將傳代至第3～5代的Hela細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，并按照1.4項(xiàng)下方法轉(zhuǎn)染，各組連續(xù)培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d，每孔加入10L的CCK8試劑，于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖倍數(shù)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染后約48 h收集各組細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，并用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)染色，4 ℃避光孵育10 min,隨后上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.8 Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力

將按照1.4項(xiàng)下方法轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞接種到用基質(zhì)膠包被的Transwell小室上層中，密度為1×106/mL，用無血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，小室下層則加入正常培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)24 h后用無菌棉簽擦去上層未穿膜細(xì)胞，0.5%結(jié)晶紫對下層遷移細(xì)胞進(jìn)行染色，并進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.9 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

實(shí)驗(yàn)前1 d用記號筆于12孔板背面劃平行直線，至少有3條直線穿過每個培養(yǎng)孔。第2天將Hela細(xì)胞以5×104/mL的密度接種于12孔板內(nèi)，并按照1.4項(xiàng)下方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6 h后用10L槍頭垂直于培養(yǎng)板正面直線劃痕，并用PBS洗滌，0.5%結(jié)晶紫懸浮細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，并計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.10 免疫印跡檢測NR6A1蛋白表達(dá)

按照1.4項(xiàng)下方法處理細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞,用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度。將蛋白濃度調(diào)平后用10% SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗GAPDH(1∶1 000)、NR6A1(1∶1 000)、Ki-67(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)和VEGF(1∶1 000)于4 ℃封閉過夜。第2天用TBST洗去未結(jié)合一抗，加入山羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，加入化學(xué)發(fā)光顯色液于暗室曝光顯影。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌細(xì)胞中miR-196a和NR6A1 mRNA的表達(dá)

RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，宮頸癌Hela細(xì)胞和CaSki細(xì)胞中miR-196a和NR6A1 mRNA表達(dá)量均明顯高于正常宮頸上皮HcerEpic細(xì)胞(P<0.01)，且以Hela細(xì)胞中miR-196a和NR6A1 mRNA表達(dá)量最高(P<0.05)，見圖1。因此，選擇Hela細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

*：與HcerEpic組比較，P<0.01；#：與CaSki組比較，P<0.05圖1 miR-196a和NR6A1 mRNA在HcerEpic、Hela和CaSki細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 miR-196a與NR6A1的靶向關(guān)系

與Control組比較，NC組Hela細(xì)胞NR6A1蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)，miR-196a inhibitor組NR6A1蛋白表達(dá)水平明顯較低(P<0.01)，提示miR-196a能調(diào)控NR6A1表達(dá)(圖2)。生物信息預(yù)測結(jié)果表明，NR6A1基因序列上有miR-196a的靶向結(jié)合位點(diǎn)；此外，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-196a inhibitor能顯著降低NR6A1野生質(zhì)粒的熒光素酶活性(P<0.01)，但對NR6A1突變質(zhì)粒的熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，提示miR-196a可靶向調(diào)控NR6A1表達(dá)(圖3)。

*：與Control組比較，P<0.01

*：與NR6A1 wt+miR-NC組比較，P<0.01

2.3 下調(diào)miR-196a表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

pcDNA-NR6A1能顯著提高Hela細(xì)胞中NR6A1蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，見圖4，表明轉(zhuǎn)染成功；轉(zhuǎn)染細(xì)胞4 d后，與Control組比較，miR-196a inhibitor組細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯較低(P<0.01)，pcDNA-NR6A1組細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著較高(P<0.01)；與miR-196a inhibitor組比較，inhibitor+NR6A1組細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著較高(P<0.01)，見圖5，表明miR-196a inhibitor能通過下調(diào)NR6A1表達(dá)抑制Hela細(xì)胞增殖。

*：與Control組比較，P<0.01

*：與Control組比較，P<0.01；#：與miR-196a inhibitor組比較，P<0.01圖5 miR-196a對Hela細(xì)胞增殖的影響

2.4 下調(diào)miR-196a表達(dá)對細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-196a inhibitor能顯著提高Hela細(xì)胞凋亡率，pcDNA-NR6A1能顯著降低Hela細(xì)胞凋亡率，與Control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與miR-196a inhibitor組比較，inhibitor+NR6A1組細(xì)胞凋亡率明顯較低(P<0.01)，見圖6。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-196 inhibitor組Caspase-3表達(dá)較高，pcDNA-NR6A1組Caspase-3表達(dá)較低，與Control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖7。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與Control組比較，P<0.01；△：與miR-196a inhibitor組比較P<0.01

*：與Control組比較，P<0.05；#：與Control組比較，P<0.01；△：與miR-196a inhibitor組比較，P<0.01

2.5 下調(diào)miR-196a表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響

與Control組比較，miR-196a inhibitor組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯較少(P<0.01)，pcDNA-NR6A1組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯較多(P<0.01)；與miR-196a inhibitor組比較，inhibitor+NR6A1組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯較多(P<0.01)，見圖8。同時，miR-196a inhibitor組細(xì)胞劃痕閉合率顯著低于Control組(P<0.01)，pcDNA-NR6A1組細(xì)胞劃痕閉合率顯著高于Control組(P<0.05)；inhibitor+NR6A1組細(xì)胞劃痕閉合率顯著高于miR-196a inhibitor組(P<0.01)，見圖9。此外，miR-196a inhibitor還能顯著抑制Hela細(xì)胞中Ki-67、VEGF和MMP-9的表達(dá)(P<0.01)，pcDNA-NR6A1顯著促進(jìn)Ki-67、VEGF和MMP-9的表達(dá)(P<0.05)，inhibitor+NR6A1能顯著減弱miR-196a inhibitor對Hela細(xì)胞中Ki-67、VEGF和MMP-9表達(dá)的抑制作用(P<0.01)，表明miR-196a可通過靶向上調(diào)NR6A1表達(dá)促進(jìn)Hela細(xì)胞侵襲和遷移，見圖7。

*：與Control組比較，P<0.01；#：與miR-196a inhibitor組比較，P<0.01

*：與Control組比較，P<0.05；#：與Control組比較，P<0.01；△：與miR-196a inhibitor組比較，P<0.01

3 討論

miR-196a是一類位于脊椎動物HOX基因簇區(qū)域的miRNA，主要調(diào)控胚胎發(fā)育過程中同源轉(zhuǎn)錄因子的編碼，從而調(diào)控基因的遺傳表達(dá)[7,10]。近年來研究表明，miR-196a參與癌癥的發(fā)生發(fā)展。miR-196a在胃癌、胰腺癌及口腔癌細(xì)胞及組織中均呈高表達(dá)狀態(tài)，提示miR-196a可能具有致癌作用[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-196a在宮頸癌Hela細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于正常宮頸上皮細(xì)胞，表明miR-196a可作為宮頸癌發(fā)生及惡化的指標(biāo)。研究表明，miR-196a通過靶向LRIG3來促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-196a inhibitor能顯著降低宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖倍數(shù)及細(xì)胞增殖蛋白Ki-67的表達(dá)，還能顯著增加癌細(xì)胞凋亡率，提高凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)，并抑制癌細(xì)胞侵襲和遷移，進(jìn)一步表明miR-196a在宮頸癌中發(fā)揮著致癌作用，但其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

一項(xiàng)研究表明，miRNAs主要通過與靶向蛋白基因3’-UTR段結(jié)合調(diào)控靶向基因轉(zhuǎn)錄[15]。因此，探討miR-196a的靶向基因是了解miR-196a在宮頸癌中致癌作用機(jī)制的關(guān)鍵。在上皮性卵巢癌中，miR-196a可通過靶向下調(diào)HOXA10的表達(dá)促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲和遷移[16]；在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中，miR-196a可通過下調(diào)IκBα表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生及放療抵抗的形成[17]；Feng等[18]的研究表明，miR-196a可通過靶向SFRP1促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移；Villegas-Ruiz等[19]的研究表明，miR-196a還可通過抑制HOXC8影響宮頸癌細(xì)胞的增殖。每一個miRNA均有成百上千個靶向蛋白，miRNAs的功能及靶向蛋白還與特定的病理生理情況有關(guān)[20]。因此，進(jìn)一步探討miR-196a對宮頸癌細(xì)胞生存及運(yùn)動過程相關(guān)靶向蛋白的影響，有利于了解宮頸癌的發(fā)病機(jī)制。

生殖細(xì)胞核受體NR6A1是一類轉(zhuǎn)錄抑制因子，在小鼠胚胎發(fā)育、神經(jīng)再生和配子形成過程中發(fā)揮著重要作用[21]，并且在前列腺癌及膀胱癌中均呈高表達(dá)狀態(tài)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，NR6A1在宮頸癌Hela細(xì)胞中表達(dá)水平明顯升高，其可能參與了宮頸上皮細(xì)胞的異常分化，與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NR6A1高表達(dá)能促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并抑制癌細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-196a表達(dá)能下調(diào)Hela細(xì)胞中NR6A1的表達(dá)水平，上調(diào)miR-196a表達(dá)能顯著誘導(dǎo)NR6A1表達(dá)，提示miR-196a可能靶向調(diào)控NR6A1表達(dá)。通過生物信息預(yù)測發(fā)現(xiàn)，NR6A1基因序列上有連續(xù)的miR-196a結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明miR-196a可靶向調(diào)控NR6A1的表達(dá)。本研究表明，上調(diào)NR6A1表達(dá)能顯著減弱miR-196a inhibitor對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的調(diào)控作用，并顯著減弱miR-196a inhibitor對Ki-67、VEGF和MMP-9表達(dá)的抑制作用。Ki-67抗原是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核蛋白，在腫瘤細(xì)胞增殖活性的檢測中，Ki-67是最可靠的指標(biāo)之一[23]。VEGF是一種高度特異性的促血管生成因子，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[24]。MMP-9作為MMPs家族的成員，是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水解酶，能夠水解基膜，從而促進(jìn)腫瘤遷移[25]。因此，miR-196a對宮頸癌Hela細(xì)胞生存和運(yùn)動能力的影響與靶向調(diào)控NR6A1表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，下調(diào)miR-196a表達(dá)能降低宮頸癌細(xì)胞增殖倍數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞劃痕閉合率，并顯著提高癌細(xì)胞凋亡率；同時，進(jìn)一步上調(diào)NR6A1表達(dá)能顯著減弱miR-196a對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的調(diào)控作用。提示miR-196a能通過促進(jìn)NR6A1表達(dá)在宮頸癌中發(fā)揮致癌作用，下調(diào)miR-196a表達(dá)能夠抑制NR6A1表達(dá)，從而延緩宮頸癌的發(fā)展。本研究首次探討了miR-196a與NR6A1的靶向關(guān)系及miR-196a通過靶向NR6A1在宮頸癌中的作用，為宮頸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的探究提供了新的方向。